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Effects of route choice by Advanced Traveller Information Service (ATIS) were investigated in a study. To support the route choice behavior, the possibility of using collective traffic management systems which are mounted in public road space. To investigate what factors and what information must be communicated to the driver so that they change their route. In this work ATIS be examined in city traffic. The empirical study will verify what the role of ATIS is and which characteristics of the Information Service influence the decision strat-egy. Variable Message Signs will inform the driver while driving on possible alternatives and issues that have a major impact on the driver\\\'s decision. Here, the driver does not always make a decision within the meaning of homo oeconomicus, which increases the subjective benefits. But other determinants such as socio-demographic variables interacts with decision.

Einleitung: Das Mammakarzinom stellt mit etwa 25% aller malignen Primärtumoren das häufigste Malignom des weiblichen Geschlechtes dar. Trotz neuer Behandlungsoptionen und einer Zunahme der zielgerichteten und individualisierten Therapiemöglichkeiten haben Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom (MBC) eine limitierte Prognose. Für Patientinnen mit progredienter metastasierter Erkrankung, die eine schnelle Remissionsinduktion erfordert, stellt die Chemotherapie weiterhin die effektivste Behandlung dar. Insbesondere in späteren Therapielinien existieren für diese Patientinnen mangels prospektiver Studien keine Therapiestandards. Cisplatin, Ifosfamid und Etoposid sind wirksame Substanzen in der Behandlung des Mammakarzinoms. Ihre Kombination ist aus der Therapie der Keimzelltumoren bekannt und gut etabliert. Die Wirksamkeit und Toxizität von Platin- und Ifosfamid-basierten Chemotherapien als Salvagebehandlung des MBC wurden bisher nicht ausreichend evaluiert. Methodik: Alle MBC-Patientinnen, die sich an der Medizinischen Klinik für Hämatologie, Onkologie und Tumorimmunologie des Campus Charité Mitte einer Behandlung mit Cisplatin und Ifosfamid mit (PEI) oder ohne Etoposid (PI) zwischen April 2005 und April 2014 unterzogen, wurden retrospektiv hinsichtlich objektiver Ansprechrate (OR), progressionsfreien Überlebens (PFS), Gesamtüberlebens (OS) und therapieassoziierter Toxizitäten evaluiert. Ergebnisse: Es wurden insgesamt 20 Patientinnen mit im Median vier zytostatischen Vortherapien identifiziert, von denen 18 bezüglich der OR ausgewertet werden konnten. Die Behandlung mit PEI beziehungsweise PI resultierte in einer kompletten Remission, neun partiellen Remissionen und zwei Krankheitsstabilisierungen. Das mediane PFS betrug vier (Range 0-18) Monate und das mediane OS von Therapiebeginn belief sich auf 8,5 (Range 0-50) Monate. Die Therapie mit PEI beziehungsweise PI verursachte bei 80% der Patientinnen Grad 3/4-Toxizitäten (überwiegend hämatologisch). Schlussfolgerung: PEI/PI stellt eine effektive Salvagetherapie für MBC- Patientinnen dar, deren Anwendung jedoch aufgrund der schwerwiegenden Toxizität nicht generell empfohlen werden kann. Der Vergleich mit den Ergebnissen aus Platinmonotherapie-Studien legt den Schluss nahe, dass PEI oder PI bei Patientinnen mit tripel-negativem Mammakarzinom besonders effektiv ist. Eine weiterführende Untersuchung dieser Chemotherapie in prospektiven klinischen Studien erscheint gerechtfertigt., Background: Breast cancer is the most common cancer in women worldwide representing approximately 25% of all malignant tumors in females. Despite new treatment options and the increase of targeted and individualized therapies, patients with metastatic breast cancer (MBC) still have a limited prognosis. Chemotherapy remains the backbone of effective treatment in case of progressive metastatic disease requiring the induction of a rapid remission. In spite of effective treatment options in first- and second-line therapy of MBC, the best possible therapy thereafter remains controversial. Cisplatin, etoposide, and ifosfamide are each effective in breast cancer. Their combination is effective and well established in germ cell cancer treatment, whereas the efficacy and toxicity of platinum- and ifosfamide-based chemotherapy as salvage treatment in MBC has not yet been evaluated sufficiently. Methods: Patients with MBC treated with cisplatin plus ifosfamide with (PEI) or without (PI) etoposide in the Department of Hematology, Oncology and Tumor Immunology at the Charité - University Medicine Berlin, Campus Mitte between 04/2005 and 04/2014 were retrospectively analyzed with special attention to the objective response (OR), progression-free survival (PFS), overall survival (OS) and treatment-related toxicities. Results: A total of 20 patients (median four prior chemotherapies) treated with PEI or PI were identified, of whom 18 were evaluable for OR. Treatment with PEI/PI resulted in one complete remission, nine partial remissions and two cases of stable disease. The median PFS was 4 (range 0-18) months and median OS from therapy initiation was 8.5 (range 0-50) months. PEI/PI therapy caused grade 3/4 toxicities (mainly hematological) in 80% of patients. Conclusion: PEI/PI is an effective salvage treatment for patients with MBC but cannot be recommended generally due to toxicity. However, comparison with platinum monotherapy trials suggests that PEI/PI might be a more effective treatment in triple-negative breast cancer. Prospective clinical trials should be performed to further evaluate the clinical value of this chemotherapy.

Die Inzidenz des malignen Melanoms hat in den letzten Jahrzehnten zugenommen. Weltweit wird jedes Jahr bei ungefähr 300.000 Patienten ein Melanom diagnostiziert. Das Melanom gehört damit zu den zehn häufigsten Tumorarten in Nordamerika, Westeuropa und Ozeanien. In den letzten Jahren hat die Zulassung von selektiven Inhibitoren für MAP-Kinasen BRAF und MEK sowie von Immuncheckpoint-Inhibitoren, wie beispielsweise Antikörper gegen PD-1 und CTLA-4, die Melanomtherapie signifikant verbessert. Dennoch sind die oft frühzeitige Metastasierung und die hohe Therapieresistenz von Melanomen dafür verantwortlich, dass nach 5 Jahren nur 25 % der Patienten überleben, bei denen Metastasen aufgetreten sind. Deshalb besteht weiterhin der dringende Bedarf, neue Therapien zu entwickeln. Ein vielversprechendes neues Behandlungskonzept ist der Einsatz von onkolytischen Viren, die selektiv in Tumorzellen replizieren und diese dadurch zerstören. Bisher wurden die zwei onkolytischen Viren Rigvir und T-VEC für die Behandlung von Melanomen zugelassen. Um die Effizienz von onkolytischen Viren zu verbessern, werden diese häufig mit Transgenen ausgestattet, die die antitumorale Aktivität der onkolytischen Viren weiter steigert. Da gezeigt werden konnte, dass eine Apoptoseresistenz häufig ursächlich für die Therapieresistenz von Melanomzellen ist, wurde vor Kurzem das onkolytische Adenovirus Ad-TRAIL entwickelt. Ad-TRAIL ist ein selektiv in Melanomzellen replizierendes onkolytisches Adenovirus, das mit TRAIL unter Kontrolle eines Dox-abhängigen Promotors ausgestattet ist. TRAIL ist ein Mitglied der TNF-Superfamilie und induziert Apoptose in Tumorzellen, während normale Zellen geschützt sind. In in vitro und in vivo Studien mit Ad-TRAIL zeigte sich, dass die Kombination von viraler Onkolyse und selektiver Apoptoseinduktion zu einer signifikant verbesserten antitumoralen Aktivität des Virus in Melanomzellen beitrug. Darüber hinaus wies Ad-TRAIL ein deutlich erhöhtes Sicherheitsprofil auf. Trotz der vielversprechenden Ergebnisse war der Einsatz von Ad-TRAIL jedoch begrenzt, da einige Melanomzellen intrinsisch resistent gegenüber TRAIL sind oder nach längerer Exposition eine Resistenz gegen TRAIL entwickelten. Zahlreiche Studien deuten dabei darauf hin, dass antiapoptotische Bcl-2-Proteine, vor allem Mcl-1, wesentlich für das Überleben von Melanomzellen sind und eine Resistenz gegenüber einer TRAIL-induzierten Apoptose vermitteln. In diesem Zusammenhang verfolgte die vorliegende Arbeit zwei Ziele. Erstens sollte aufgeklärt werden, ob Melanomzellen durch eine Herunterregulation von Mcl-1 gegenüber Ad-TRAIL sensitiviert werden können. Zweitens sollten verschiedene RNA-Interferenz-vermittelnde Sequenzen für den Knockdown von Mcl-1 verglichen werden, um zukünftig die effizienteste Sequenz in das Genom von Ad-TRAIL inserieren zu können und somit die Apoptoseinduktion durch TRAIL sowie die Herunterregulation von Mcl-1 in einem Virus zu vereinen. Die Verbesserung der Effizienz des onkolytischen Adenovirus Ad-TRAIL in resistenten Melanomzellen war dabei das übergeordnete Ziel dieser Arbeit. Zunächst konnte in diesem Zusammenhang die deutlich unterschiedliche Sensitivität von vier Melanomzelllinien gegenüber löslichem TRAIL und Ad-TRAIL bestätigt werden (Mel-HO > SK-Mel-19 > Mel-2a > MeWo). Anschließend wurde untersucht, ob ein Knockdown von Mcl-1 Melanomzellen gegenüber Ad-TRAIL sensitivieren kann. Um dabei den Einfluss der unterschiedlichen Sensitivitäten der Melanomzelllinien vergleichen zu können, wurden für diese Experimente zum einen die TRAIL-resistenten MeWo- und zum anderen die TRAIL-sensitiven Mel-HO-Zellen eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die allgemeine zytolytische Aktivität, die Apoptoseinduktion und die Nekroseinduktion von Ad-TRAIL signifikant durch eine Herunterregulation von Mcl-1 gesteigert werden konnte, insbesondere wenn die TRAIL-Expression durch Dox induziert wurde. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die erhöhte Apoptoseinduktion durch TRAIL in Kombination mit der Herunterregulierung von Mcl-1 mit einer stärkeren Aktivierung der Effektor-Caspase-3 einhergeht. Der positive Effekt des Knockdowns von Mcl-1 wurde in der TRAIL-resistenten Zelllinie MeWo, aber auch in der TRAIL-sensitiven Zelllinie Mel-HO beobachtet. Dies zeigt, dass die Vorteile der Herunterregulierung von Mcl-1 nicht auf Melanomzellen mit TRAIL-Resistenz beschränkt sind. Relativ gesehen war der positive Effekt der Herunterregulation von Mcl-1 jedoch in MeWo-Zellen stärker als in Mel-HO-Zellen. Beim Vergleich der verschiedenen RNA-Interferenz-vermittelnden Sequenzen für den Knockdown von Mcl-1 stellte sich die Dreifachkopie einer amiRNA gegen Mcl-1 (3xamiRMcl-1) im Vergleich zu den anderen untersuchten miRNAs und shRNAs als am effizientesten und sichersten für den Knockdown von Mcl-1 heraus. Zusammenfassend legen diese Daten daher eine Herunterregulierung von Mcl-1 als Strategie zur Verbesserung von Ad-TRAIL nahe. In Zukunft könnte in das Genom von Ad-TRAIL die 3xamiRMcl-1-Sequenz inseriert werden, um die induzierbare Expression von TRAIL und die Herunterregulation von Mcl-1 durch RNA-Interferenz in einem Virus zu vereinen. The incidence of malignant melanoma has been increasing over the past decades. Globally each year approximately 300,000 new patients are diagnosed with cutaneous melanoma, which thus belongs to the ten most common cancers in North America, Western Europe and Oceania. Only recently, selective inhibitors for the MAP kinases BRAF and MEK as well as immune checkpoint inhibitors, like PD-1 or CTLA-4 antibodies, have significantly improved melanoma therapy. However, since melanoma is often characterized by early dissemination and severe therapy resistance the current survival rate of patients with metastases still does not exceed 25 % after 5 years. Hence, new strategies to further improve melanoma therapy are required. A promising new strategy is the use of oncolytic adenoviruses, which selectively replicate in and destroy tumor cells. So far, the two oncolytic viruses Rigvir and T-VEC have been approved for the treatment of melanoma. Arming of oncolytic viruses with transgenes, that support the antitumoral activity, has been shown to be a valuable approach to increase the oncolytic efficacy of these viruses. As apoptosis deficiency plays a major role in therapy resistance of melanoma, previously the oncolytic adenovirus Ad-TRAIL was developed. Ad-TRAIL selectively replicates in melanoma cells and is armed with TRAIL under control of a Dox-dependent promoter. TRAIL is a member of the TNF superfamily, that induces apoptosis in tumor cells, while normal cells are largely protected. In vitro and in vivo studies with Ad-TRAIL demonstrated that the combination of viral oncolysis and selective induction of apoptosis contributed to a significantly improved antitumor activity of the virus in melanoma cells. Ad-TRAIL also exhibited a distinctly higher security profile. Despite the promising results the overall efficacy of Ad-TRAIL remained limited, as some melanoma cells were intrinsically resistant to TRAIL or developed resistance to TRAIL after prolonged exposure. Numerous studies indicate that antiapoptotic Bcl-2 proteins - in particular Mcl-1 - are essential for the survival of melanoma cells and mediate resistance to TRAIL-induced apoptosis. Therefore, the present study pursued two aims. First, to investigate whether melanoma cells can be sensitized to Ad-TRAIL by silencing of Mcl-1. Secondly, to compare different RNA interference-mediating sequences for the knockdown of Mcl-1 in order to be able to insert the most efficient sequence into the genome of Ad-TRAIL in the future to thus unite the apoptosis-inducing TRAIL and the silencing of Mcl-1 in one virus. Taken together, the superior aim of this study was to improve the efficiency of the oncolytic adenovirus Ad-TRAIL in resistant melanoma cells. In the present study the different sensitivities of four melanoma cell lines towards soluble TRAIL and Ad-TRAIL could be confirmed (Mel-HO > SK-Mel-19 > Mel-2a > MeWo). Therefore, it was subsequently examined whether a knockdown of Mcl-1 sensitized melanoma cells to Ad-TRAIL. In order to be able to compare the influence of different sensitivities of melanoma cells, the TRAIL-resistant MeWo and the TRAIL-sensitive Mel-HO cells were used for these experiments. It was demonstrated, that the general cytolytic activity, the induction of apoptosis and the induction of necrosis by Ad-TRAIL was significantly increased by the silencing of Mcl-1, in particular when TRAIL expression was induced by Dox. Furthermore, it was shown that the significantly enhanced induction of apoptosis by Ad-TRAIL in combination with the knockdown of Mcl-1 was accompanied by a stronger activation of the main effector caspase-3. The positive effect of Mcl-1 silencing was seen in TRAIL-resistant MeWo, but also in TRAIL-sensitive Mel-HO cells, demonstrating that the benefits of downregulating Mcl-1 were not limited to melanoma cells with TRAIL resistance. However, in relative terms the positive effect of Mcl-1 silencing was stronger in MeWo than in Mel-HO cells. In regard to the evaluation of the different RNA interference-mediating sequences, 3xamiRMcl-1 was found to be the most efficient and safest sequence for the knockdown of Mcl-1 compared to the other miRNAs and shRNAs examined. Taken together, these findings suggest Mcl-1 silencing as a new strategy to further enhance the oncolytic activity of Ad-TRAIL in melanoma. As a future perspective, the 3xamiRMcl-1-sequence could be inserted into the genome of Ad-TRAIL in order to combine the inducible expression of TRAIL and the silencing of Mcl-1 by RNA interference in one virus.

HERV-K(HML-2) ist das jüngste und am besten erhaltene humane endogene Retrovirus. Menschliche Zellen, die diese Viren alle im Genom tragen sind in der Lage funktionelle virale Hüllproteine zu exprimieren. Diese Proteine können andere Retroviren pseudotypisieren und ihren Zelltropismus dadurch verändern. Wichtige Charakteristika des Eintrittprozesses, der durch das Hüllprotein von HERV-K(HML-2) vermittelt wird, sind noch unbekannt und wurden in dieser Arbeit mit Hilfe von pseudotypisierten lentiviralen Reporterviren analysiert. Als HERV-K(HML-2)-Hüllprotein wurde eine zuvor rekonstituierte Sequenz von HERV-K113 verwendet. Im Fokus der Untersuchungen stand die Identifizierung der Domäne des Hüllproteins, die an den noch unbekannten Rezeptor bindet. Dafür wurde durch einen in silico-Vergleich mit Sequenzen verwandter β-Retroviren zunächst eine putative Rezeptorbindestelle gefunden. Durch gezielte Mutagenese wurde dieser Bereich mehrfach modifiziert. Die mutierten Hüllproteine waren nicht mehr in der Lage, den Zelleintritt der Viren zu gewährleisten oder verminderten ihn erheblich, was in Übereinstimmung mit einer Rezeptorbindungsfunktion dieser Proteinregion steht. Nachfolgend wurde der Versuch unternommen, durch Austausch der gefundenen Rezeptorbindedomäne von HERV-K(HML-2) gegen die des nahen verwandten MMTV, den Virustropismus zu verändern. Die chimären Proteine wurden jedoch nicht in Retroviren eingebaut. In einem weiteren Ansatz wurden lösliche Versionen der rezeptorbindenden SU-Einheit des HERV-K(HML-2)-Hüllproteins als Fusionsprotein mit einer C-terminalen Immunglobulindomäne hergestellt. Als Kontrolle wurden homologe Proteine mit Hüllproteinen anderer Retroviren kloniert und augereinigt. In einer Reihe von Experimenten konnte die spezifische Bindung dieser Proteine an einen zellulären Rezeptor in permissiven Zellen nachgewiesen. In einem proof-of principle Experiment wurde dann die Möglichkeit zur Kopräzipitation des unbekannten Rezeptors von HERV-K(HML-2) mit Hilfe dieser Fusionsproteine gezeigt. Im Zuge der Arbeit wurde der Rezeptor noch nicht isoliert. Die Herstellung und erfolgreiche Charkterisierung der SU-Ig-Fusionsproteine leistet dazu aber eine sehr aussichtsreiche und wichtige Voraussetzung. HERV-K(HML-2) is the youngest and best-conserved human endogenous retrovirus. Human cells, which are carrying these viruses in their genome, can express functional viral envelope proteins. These proteins can be used for pseudotyping other retroviruses and therefore for changing their cell tropism. In the present work, important characteristics of the entry process mediated through the envelope protein of HERV-K(HML-2), which are still unknown, were analysed using pseudotyped lentiviral reporter viruses. A previously reconstituted sequence of HERV-K113 was used as an HERV-K(HML-2) envelope protein. This study focused on finding the domain of the envelope-protein that binds to the yet unknown receptor. To achieve this, an in silico comparison with protein sequences of closely related Betaretroviruses was performed. This comparison allowed a prediction of a putative receptor binding site, which then underwent site-directed mutagenesis leading to several modifications within the region. The generated envelope mutants were either unable to mediate the cell entry of the viruses or did it in a heavily depleted manner, indicating the receptor binding role of the region. In order to alter the virus tropism, we interchanged the then found receptor binding domain of HERV-K(HML-2) with that of the most closely related MMTV, but the chimeric proteins couldn’t be incorporated into the retroviruses. A further approach consisted of expressing a soluble version of the receptor binding subunit of HERV-K(HML-2) envelope protein as a fusion protein with a C-terminal immunoglobulin domain. As control, homologous proteins based on envelope proteins from other retroviruses were cloned and affinity-purified. In a series of experiments, the specific binding of the proteins on a cellular receptor in permissive cells could be demonstrated. In a proof-of principle experiment, the possibility of a precipitation of the unknown receptor of HERV-K(HML-2) by using the fusion proteins was shown. In the course of this work, the receptor has not yet been isolated. The production and successful characterization of SU-Ig- fusion proteins supply however a promising and important requirement for future attempts.

Die Leber ist das zentrale Stoffwechselorgan des menschlichen Organismus und ist verantwortlich für eine Vielzahl essentieller Stoffwechselvorgänge. Adenovirale Infektionen der Leber können schwerwiegenden Gewebsschädigungen verursachen mit pathologischen Konsequenzen für den menschlichen Organismus. Bestehende antiadenovirale Therapien sind oftmals nur begrenzt wirksam und können zudem starke Nebenwirkungen zeigen. Daher werden insbesondere zur Behandlung immunsupprimierter Patienten alternative Therapieansätze benötigt. In diesen Zusammenhang ist die antiadenovirale Gentherapie vermittelt über RNA-Interferenz und AAV-Vektoren besonders vielversprechend, bedarf jedoch weiterführender Forschung und alternativer Zellkulturmodelle. Dreidimensionale Gewebemodelle bieten als Schnittestelle zwischen klassischen zweidimensionalen Zellkulturen und Tiermodellen eine vielversprechende Alternative innerhalb der biowissenschaftlichen Forschung, da sie sowohl strukturelle Komplexität besitzen als auch die Verwendung von humanen Zellen sowie die Generierung präziser und reproduzierbarer Strukturen ermöglichen. Hierbei ist der Extrusionsdruck nach dem Stand der Technik besonders zellschonened sowie ökonomisch bezogen auf den Biotintenverbrauch und daher eine der biowissenschaftlich am häufigsten genutzten Drucktechniken. Daher beschreibt die vorliegende Arbeit die Generierung hepatischer Gewebeanaloga mittels pneumatischem Extrusionsdruck, zur Untersuchung adenoviraler Infektionen sowie adeno-assoziierter Virusvektor-vermittelter Gentherapie. Zur Nachbildung möglichst physiologischer Mikrostrukturen innerhalb der generierten Strukturen wurde humane extrazelluläre Matrix als zentrale Biotintenkomponente verwendet und mit HepaRG-Zellen, einer humanen hepatischen Zelllinie, sowie zur Verbesserung der Druckeigenschaften mit Alginat und Gelatine gemischt. Es konnte gezeigt werden, dass Biotinten mit anteilig bis zu 10 % humaner extrazellulärer Matrix optimale Druckeigenschaften besitzen und die Generierung formstabiler sowie definierter dreidimensionaler Strukturen ermöglicht und zudem sowohl die Viabilität als auch den Metabolismus (Albuminsekretion und Cytochrom P450 3A4-Aktivität) der HepaRG-Zellen innerhalb der Strukturen begünstigt. Darüber hinaus konnten entsprechende Strukturen effizient mit adeno-assoziierten Virusvektoren des Serotyp 6 transduziert und parallel das endogen exprimierte Cyclophillin B mittels RNA-Interferenz signifikant herunterreguliert werden. Des Weiteren ermöglichen die generierten dredimensionalen Strukturen die Replikation des Adenovirus Serotyp 5 und die Bildung infektiöser Partikel. Somit wurde deutlich, dass die generierten hepatischen Strukturen zukünftig als Grundlage zur Untersuchung infektiöser Viren und adeno-assoziierter Virusvektoren vermittelter Gentherapie Anwendung finden können., The liver is the central metabolic organ of the human organism and is responsible for many essential metabolic processes. Adenoviral infections of the liver can cause serious tissue damage with pathological consequences for the human organism. Existing antiadenoviral therapies are often only effective to a limited extent and can also show strong side effects. For this reason, alternative therapeutic approaches are particularly needed for the treatment of immunosuppressed patients. In this context, antiadenoviral gene therapy mediated via RNA interference and AAV vectors is particularly promising, but requires further research as well as alternative cell culture models. Three-dimensional tissue models, as an interface between classical two-dimensional cell cultures and animal models, offer a promising alternative within bioscientific research, as they possess structural complexity and enable the use of human cells and the generation of precise and reproducible structures. According to the state of the art, particularly extrusion printing is cell preserving as well as economical concering bio ink consumption and therefore one of the most frequently used printing techniques in biosciences. Accordingly, this present study describes the generation of hepatic tissue analogues by pneumatic extrusion printing for the investigation of adenoviral infections and adeno-associated virus vector-mediated gene therapy. To reproduce physiological microstructures within the generated structures, human extracellular matrix was used as the central bio ink-component and mixed with HepaRG cells, a human hepatic cell line, as well as alginate and gelatine to improve the printing properties of the bio inks. It could be shown that bio inks with up to 10 % human extracellular matrix have optimal printing properties and enable the generation of dimensionally stable as well as defined three-dimensional structures and furthermore promote viability and metabolism (albumin secretion and cytochrome P450 3A4 activity) of the HepaRG cells within the structures. In addition, corresponding structures could be efficiently transduced with adeno-associated virus vectors of serotype 6 and the endogenously expressed human cyclophillin B could be significantly silenced by RNA interference. Furthermore, the generated three-dimensional structures allow the replication of adenovirus serotype 5 and the formation of infectious particles. Thus, it became clear that the generated hepatic structures can be used in the future as a basis for the investigation of infectious viruses and adeno-associated virus vectors of mediated gene therapy.

Das Coxsackievirus B3 (CVB3)-Maus-Myokarditismodell wird standardmäßig zur Untersuchung der Virus-induzierten Myokarditis verwendet. Entgegen der CVB3-Infektion im Menschen stellt im murinen Organismus nicht das Herz, sondern das Pankreas das für die CVB3-Infektion suszeptibelste Organ dar. Verschiedene klinische Symptome, wie der starke Gewichtsverlust, das schmerzhafte Hochziehen des Bauches sowie schnell auftretende Todesfälle, können als direkte Folge der virusbedingten akuten Pankreatitis angesehen werden. Diese fulminante Ausprägung der Pankreatitis stellt für die Tiere eine extreme Belastung dar, welche sich von der humanen Präsenz unterscheidet. Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand die Verbesserung des CVB3-Maus-Myokarditismodells durch die Entwicklung einer genetisch modifizierten CVB3-Variante, welche durch die Insertion von microRNA-Zielsequenzen (microRNA-Target Sites, miRNA-TS) eine Pankreasattenuation aufweist. Die Expressionsanalyse von miRNAs im Pankreas und Herz mittels eines Affymetrix miRNA –Chip-Assays sowie quantitativer RT-PCR zeigte, dass die miRNA-375 die stärkste Expression im Pankreas aufwies und nur geringfügig im Herzen exprimiert wird. Darauf basierend wurden drei Kopien der miRNA-375TS in das 3’ -bzw. 5’-Ende des Genoms der CVB3-Variante rCVB3.1, jeweils in positiver bzw. negativer Orientierung, inseriert. Die Analyse der daraus resultierenden vier rekombinanten CVB3-Varianten in vitro zeigte, dass die virale Replikation über die Insertion der miRNA-TS in positiver Orientierung in die 3’-UTR des Genoms (Virusvariante: CVB3-375TS(3+)) am effektivsten durch die miRNA-375 unterdrückt wurde. In der pankreatischen Zelllinie EndoC-βH1 wurde, verglichen mit dem keine TS-Sequenzen enthaltenden Kontrollvirus, die Replikation von CVB3-375TS(3+) durch die endogene miRNA-375 Expression ca. um vier log10-Stufen verringert. In isolierten primären embryonalen Kardiomyozyten wurde CVB3-375TS(3+) hingegen nicht unterdrückt. Für die in vivo Versuche wurden drei Kopien der miRNA-375TS in das 3’-Ende des Genoms der kardiotropen CVB3-Variante H3N inseriert. Es zeigte sich, dass die intraperitoneale (i.p.) Injektion des generierten Virus (H3N-375TS) in NMRI-Mäusen weder eine Pankreatitis noch eine Myokarditis verursachte. Hingegen führte die intravenöse (i.v.) Applikation von H3N-375TS in NMRI- als auch Balb/C-Mäusen zu einer Infektion des Herzens und induzierte je nach Versuchsaufbau eine akute oder chronische Myokarditis ohne Infektion des Pankreas. Während die akute Myokarditis sich durch moderate kardiale H3N-375TS-Titer, die Expression proinflammatorischer Zytokine sowie die Inflammation und die Zerstörung des Herzgewebes auszeichnete, war die chronische Myokarditis durch sehr geringe kardiale H3N-375TS-RNA Level ohne detektierbare Virusreplikation sowie durch die Ausbildung fibrotischer Gewebeareale gekennzeichnet. Ob und welche Rolle das Pankreas für die Ausbildung der Myokarditis in Mäusen spielt wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen nunmehr eindeutig, dass bei der i.p. Applikation von CVB3 das Pankreas essentiell für die kardiale Infektion ist, wohingegen bei der i.v. Applikation eine Myokarditis ohne Infektion des Pankreas durch die mittels miRNA-375TS genetisch modifizierte CVB3-Variante verursacht werden kann. Das H3N-375TS induzierte Modell erlaubt so die Untersuchung der CVB3induzierten Myokarditis in Mäusen unabhängig von einer Pankreasinfektion. Zudem verringerte das pankreasattenuierte H3N-375TS bei NMRI-Mäusen, vor allem aber bei Balb/C-Mäusen, die auf die Pankreatitis zurückführbaren Schmerzen bzw. das Leiden während der CVB3-Infektion. Damit verstärkt es nicht nur die wissenschaftliche Relevanz der Myokarditisanalyse im Mausmodell, sondern es entspricht hinsichtlich der tierschutzrechtlichen Forderungen der 3R-Richtlinien den beiden Aspekten Reduction und Refinement. The coxsackievirus B3 (CVB3) mouse myocarditis model is the standard model to investigate virus-induced myocarditis. Compared to human, in mice the pancreas but not the heart represents the most susceptible organ for CVB3 infection. Multiple clinical symptoms, as drastic weight loss, painfull contraction of the stomac as well as sudden death are direct results of the viral induced pancreatitis. Thus, the pathogenesis of CVB3 infection differs between mice and men, as in the murine CVB3 induced myocraditis model the pancreas is always co-infected and damaged by CVB3. This study aimed to improve the mouse myocarditis model by development of a genetically engineered CVB3 variant, which became pancreas-attenuated by insertion of microRNA-target sites (miRNA-TS) sequences. Analysis of miRNA expression in the pancreas and the heart by Affymetrix-miRNA-chip analysis as well as quantitative RT-PCR revealed that miRNA-375 is the highest expressed miRNA in the pancreas with minimal expression in the heart. Based on this finding, four miRNA-375 susceptible CVB3 variants were generated by insertion of three copies of miRNA-375TS in positive or negative orientation into the 3’- or 5’-end of the CVB3 genome of the CVB3 variant rCVB3.1. In vitro it was shown that the generated CVB3 containing the inserted miRNA-375TS in positive orientation in the 3’UTR of the CVB3 genome (virus variant: CVB3-375TS(3+)) was strongest suppressed by miRNA-375. In pancreatic EndoC-βH1 cells replication of CVB3-375TS(3+) was suppressed up to four log10 steps by endogen miRNA-375 expression compared to a non-targeted control virus. Furthermore, there was no repression of the virus in isolated primary embryonic mouse cardiomyocytes. For in vivo experiments, three copies of the miRNA-375TS were inserted into the 3’UTR of the cardiotropic CVB3 variants H3. Here, the intraperitoneal (i.p.) administration of the engineered virus H3N-375TS did not result in pancreatic as well as cardiac infection in NMRI mice. However, intravenous (i.v.) administration of H3N-375TS into NMRI and Balb/C mice resulted in the infection of the heart and induced acute and chronic myocarditis, respectively, but did not lead to pancreatic infection. The acute myocarditis was characterized by moderate cardiac titers of replicating H3N-375TS, cardiac tissue destruction, inflammation and expression of proinflammatory cytokines, whereas chronic myocarditis developing animals showed rarely H3N-375TS-RNA with no detectable virus replication and fibrotic tissue areas. In literature, the role of the pancreas in virus-induced myocarditis is controversly discussed. The present study clearly shows that the pancreas is essential for cardial infection using i.p. administred CVB3. I.v. application of genetically modified pancreas-attenuated CVB3 showed, that during this route of infection CVB3 induced myocarditis can be induced without infection of the pancreas. This allows the solely investigation of CVB3 induced murine myocarditis independently from a previous pancreas infection. Furthermore, the pancreas-attenuated H3N-375TS reduces pain and thereby suffering of NMRI and Balb/C mice during CVB3 infection that is commonly related to pancreatitis. Therby, the model not just facilitates clinical relevance of investigation of vius-induced myocarditis in mice, in terms of animal welfare aspects, it also fulfills two requirements of the concepts of the 3-Rs, Reduction and Refinement.

Gedruckt erschienen im Universitätsverlag der TU Berlin, ISBN 978-3-7983-3028-3, Der Sammelband gibt einen Überblick über aktuelle bioethische Fragestellungen. Die Beiträge gehen aus einem interdisziplinären Seminar mit Studierenden der Biotechnologie und Philosophie hervor. Nach einer allgemeinen Einführung in die Bioethik werden Themen vom Lebensanfang über Gesundheit und Verbesserung menschlicher Fähigkeiten bis zum Lebensende diskutiert. Die Auseinandersetzung umfasst kontrovers diskutierte Themen wie Präimplantationsdiagnostik, moderne Lebensmittel und Sterbehilfe., The anthology provides an overview concerning current bioethical issues. The chapters result from an interdisciplinary seminar with students of biotechnology and philosophy. Following a general introduction into bioethics, the discussion icludes topics from the beginning of life, health and human enhancement to the end of life. It comprises inter alia preimplantation diagnostics, modern food production and euthanasia.

Die Verwendung einer optimalen Analgesie sollte oberste Priorität in der Versuchstierkunde haben und ist nicht nur aus ethischen, sondern auch aus rechtlichen Gründen verpflichtend. Laut nationalen und internationalen Versuchstierstatistiken ist die Maus mit ca. 70 % die am häufigsten verwendete Spezies. Opioide werden gewöhnlich zur perioperativen Behandlung von moderaten bis schweren Schmerzen eingesetzt. Aufgrund der langanhaltenden Wirkung und geringen unerwünschten Nebenwirkungen wird für die Spezies Maus bevorzugt das Opioid Buprenorphin verwendet. Unterschiedliche Empfehlungen bzgl. Dosierung, Applikationsart und -intervall führen jedoch zu Unstimmigkeiten in dessen Anwendung. Obwohl mausstammspezifische Unterschiede in der Wirkung von Opioiden bekannt sind, sind diese bisher für die analgetische Wirkung von Buprenorphin noch nicht eindeutig geklärt und finden daher keine Berücksichtigung in den Empfehlungen. Das Ziel der hier vorliegenden Arbeit war es daher, den analgetischen Effekt von Buprenorphin in drei häufig verwendeten Maus-Inzuchtstämmen (C57BL/6J, Balb/cJ, 129S1/SvImJ) zu untersuchen und zu prüfen, ob eventuelle Unterschiede in der Wirkung auf eine veränderte Metabolisierung zurückzuführen sind. Hierfür wurden die basale Schmerzempfindlichkeit sowie der analgetische Effekt von Buprenorphin (0,42 mg/kg, 4,0 mg/kg) unter Verwendung der Incremental Hot Plate in vivo getestet. Serum- und Gehirnkonzentrationen von Buprenorphin und seiner Metaboliten wurden bestimmt, um ggf. pharmakokinetisch-bedingte Veränderungen aufzudecken. Darüber hinaus wurden in vitro die für die Metabolisierung von Buprenorphin relevanten CYP3A Isozyme hinsichtlich der mRNA Expression, des Proteingehalts und der Aktivität, untersucht. Die verwendeten Mausstämme unterschieden sich deutlich in ihrer basalen Schmerzempfindlichkeit, wobei Balb/cJ Mäuse am sensitivsten und 129S1/SvImJ Mäuse am wenigsten sensitiv waren. Die Applikation von Buprenorphin führte zu einem dosis- und stammesabhängigen analgetischen Effekt. Die Dosiserhöhung von Buprenorphin steigerte die Antinozizeption beim C57BL/6J und Balb/cJ Stamm, wohingegen der analgetische Effekt beim 129S1/SvImJ Stamm stagnierte. Serum- und Gehirnkonzentrationen von Buprenorphin und seiner Metaboliten waren dosisabhängig und unterschieden sich bei einer Dosis von 4,0 mg/kg Buprenorphin zwischen den Stämmen. Das Verhältnis von Buprenorphin und seinen Metaboliten im Blut sowie die Verteilung zwischen Gehirn und Blut zeigten keine Dosis- und nur geringe Stammesunterschiede, die aber nicht mit der analgetischen Wirkung korrelierten. Darüber hinaus wurden keine Stammesunterschiede in der Aktivität und im Proteingehalt der CYP3A Isozyme detektiert. Auf mRNA Ebene wurden Stammesunterschiede bei einigen CYP3A Isozymen detektiert. Jedoch konnte kein Zusammenhang zwischen mRNA und Aktivitätsdaten nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, dass die Applikation von Buprenorphin mausstammspezifisch gestaltet werden sollte. Nur so kann Schmerzen optimal vorgebeugt und unerwünschte Nebenwirkungen vermieden werden. Die beobachteten Unterschiede auf pharmakokinetischer Ebene können den unterschiedlichen analgetischen Effekt von Buprenorphin in den drei Mausstämmen nicht ausreichend erklären. Möglicherweise spielen pharmakodynamische Mechanismen eine übergeordnete Rolle, welche in weiterführenden Studien untersucht werden sollen. Die Ergebnisse sollen die wissenschaftliche Gemeinschaft für die Verwendung einer optimierten Analgesie sensibilisieren und somit aktiv zum Tierschutz in der Versuchstierkunde beitragen. The optimal dosage of analgesics should be state-of-the-art in laboratory animal sciences and is not only a question of animal welfare but also a legal provision. According to current national and international statistics on laboratory animals, the mouse is the most commonly used species with approximately 70 %. Opioid analgesics are commonly used for perioperative care of moderate to severe pain in mice. Among the numerous opioid drugs available, buprenorphine is the preferred analgesic due to its long-lasting effect and little adverse side effects. Vast differences in recommendations for dosage, application route and application intervals lead to uncertainties for appropriate administration and counteract optimal pain management. Although strain differences in the analgesic efficacy for opioids in mice are known, they have not been sufficiently investigated for buprenorphine, and consequently have not been taken into account in current recommendations. Therefore, the present study aimed to elucidate the influence of strain differences on the analgesic effect of buprenorphine. Hence, basal pain sensitivity and the analgesic effect of buprenorphine (0.42 mg/kg, 4.0 mg/kg) were tested in vivo using three popular mouse strains (male C57BL/6J, Balb/cJ, 129S1/SvImJ) on the Incremental Hot Plate. As pharmacokinetic mechanisms might play a crucial role influencing the analgesic outcome, phase-I and -II metabolism were assessed. Thus, the metabolically relevant CYP3A isozymes were investigated in vitro in regard to mRNA expression, protein content and activity. Moreover, serum and brain concentrations of buprenorphine and its metabolites were analyzed in order to investigate alterations in the metabolism. Basal pain sensitivity differed considerably between the mouse strains with Balb/cJ mice being the most and 129S1/SvImJ mice the least sensitive strain. The application of buprenorphine led to dose and strain dependent analgesic differences. While the analgesic effect of buprenorphine increased in C57BL/6J and Balb/cJ mice with the higher administered dose, the analgesic effect remained stable in 129S1/SvImJ mice. Serum and blood concentrations of buprenorphine and its metabolites were dose and partly strain dependent (4.0 mg/kg dose group). The metabolic ratio in blood and distribution between brain and blood showed no dose and only slight strain dependent variations, which did not correspond with the analgesic effect of buprenorphine. Additionally, no strain dependent differences for CYP3A activity and protein content could be detected in vitro, whereas at mRNA expression level slight strain differences were present. However, the mRNA expression differences of some CYP3A isozymes were not in accordance with activity data. Thus, administration of buprenorphine for optimal pain management should be adapted to the respective mouse strain to avoid pain or adverse side effects. However, strain differences in the analgesic effect of buprenorphine could not be explained by differences in pharmacokinetics. Hence, differences in pharmacodynamic parameters are more likely and should be investigated in further studies. In summary, the results of this study should sensitize the scientific community to optimize pain management in order to contribute to laboratory animal welfare in life sciences.

Im letzten Jahrzehnt wurden elf neue humane Polyomaviren (PyV) und zahlreiche tierische PyV identifiziert. Die Charakteristika dieser PyV wie Gewebetropismus, zelluläre Eintritts- und Infektionsmechanismen sind bislang ungeklärt. Humanes PyV 9 (HPyV9), im Serum eines Nierentransplantat-Empfängers entdeckt, und Humanes PyV 12 (HPyV12), in Proben von kolorektalen Lebermetastasen identifiziert, sind zwei neuartige humane PyV, deren partielle Charakterisierung Gegenstand der vorliegenden Dissertation ist. Dies umfasst die Untersuchung ihrer Genoprävalenz in Gewebeproben von Patienten mit malignen Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes (GIT), der VP1 (Hauptkapsidprotein)-basierten Seroprävalenz von HPyV9 und HPyV12 und der Seroreaktivität gegen HPyV9- und HPyV12-TAg(78aa) in Seren von Blutspendern (n=100), Patienten mit malignen (n=54) und mit nicht-malignen Erkrankungen des GIT (n=32). Hinzu kommt die Etablierung eines Protokolls für die Identifikation potentieller Zelllinien als in vitro-Replikationssysteme für die beiden PyV, welche u. a. die Analyse von Spleiß-Mechanismen der frühen Genregion von HPyV9 und HPyV12 erlauben. Die mittels quantitativer PCR in Gewebeproben ermittelte Genoprävalenz lag bei 0 % für HPyV9 und bei 2,8 % für HPyV12 und deutet nicht auf einen Gewebetropismus der beiden PyV in den vorliegenden Materialien hin. Zur Bestimmung der Seroprävalenz von HPyV9- und HPyV12-VP1 wurde ein Kapsomer-basierter ELISA verwendet. Die Seroprävalenz von HPyV9-VP1 war in Seren von Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen des GIT signifikant höher als in jenen von Patienten mit malignen Erkrankungen des GIT und in jenen von Blutspendern (59 % vs. 37 % (p=0,02) und vs. 32 % (p=0,04). Die HPyV12-VP1-Seroprävalenz lag bei 8 % (Blutspender), 20 % (Patienten mit malignen Erkrankungen des GIT) und 25 % (Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen des GIT) (Unterschiede nicht signifikant, p>0,05). Zur Bestimmung der Seroreaktivitäten gegen die ersten 78 N-terminalen Aminosäuren wurde ein TAg-basierter ELISA angewendet. Seroreaktivitäten von 17 % bis 39 % für HPyV9- und HPyV12-TAg(78aa) in allen drei Serengruppen deuteten auf eine Präsenz von IgG-Antikörpern gegen diese Antigene in der allgemeinen Bevölkerung hin. In Seren von Patienten mit malignen Erkrankungen des GIT war die HPyV9-TAg(78aa)-Seroreaktivität signifikant höher als in jenen von Blutspendern (39 % vs. 34 %, p=0,04). Das Protokoll zur Untersuchung von Zelllinien auf ihre Eignung als in vitro-Replikationssystem für beide Viren identifizierte die Vero-Zelllinie als vergleichsweise gut geeignet. Sie zeigte die stärkste Zunahme an VP1-mRNA-Kopien beider PyV und erlaubte die Beobachtung zytopathischer Effekte, die Anfärbung viraler Proteine im Immunfluoreszenzassay und die Analyse von Spleiß-Vorgängen der frühen Genregionen. Neben für das kleine und große T-Antigen kodierenden, gespleißten mRNAs wurden die bisher unbekannten, alternativen Spleiß-Produkte HPyV9-145T und HPyV12-84T detektiert. Für HPyV12 wurden weitere Spleiß-Varianten identifiziert, die nicht-kanonische Spleiß-Sequenzen aufwiesen. Die präsentierten Ergebnisse tragen erste Erkenntnisse zur Charakterisierung der neuartigen HPyV9 und HPyV12 bei. Die Schlussfolgerungen zur Geno- und Seroprävalenz erfordern weitere Analysen mit alternativen bzw. größeren Probengruppen. Das Protokoll zur Testung von Zelllinien sollte weiter optimiert und ggf. auf primäre Zelllinien ausgeweitet werden. Von gesondertem Interesse wird die Untersuchung des transformierenden Potentials der neuartigen Spleiß-Varianten der T-Antigene sein, da für diese ein Zusammenhang mit der onkogenen Transformation von Wirtszellen sowie ein Einfluss auf die Pathogenese vermutet werden kann. Eleven novel human polyomaviruses (PyVs) and various animal PyVs have been identified during the last ten years. Basic characteristics like tissue tropism, cellular entry and infection mechanisms of these viruses will be the subject of future studies. The present thesis deals with the partial characterization of two novel human PyVs, the human polyomaviruses 9 (HPyV9) and 12 (HPyV12). Both were recently discovered, HPyV9 in the serum of a renal transplant recipient and HPyV12 in metastatic liver tissue. Here, genoprevalence and seroprevalence of HPyV9 and HPyV12 were analysed in different subject groups, cell lines were searched that support their replication, and HPyV9 and HPyV12 tumor antigens (TAg) were identified on the mRNA level. In tissue samples of patients suffering from malignant diseases of the gastro-intestinal tract (GIT), quantitative PCR yielded genoprevalences of 0 % for HPyV9 and 2.8 % for HPyV12. In ELISA based on viral major capsid protein (VP1), seroprevalence of HPyV9 was significantly higher in sera from patients with non-malignant diseases of the GIT (59 %) than that in sera of patiens with malignant diseases of the GIT (37 %, p=0.02), and in sera of blood donors (32 %, p=0.04). VP1 seroprevalences of HPyV12 (8 % in blood donors, 20 % in patients with malignant diseases of the GIT, 25 % in patients with non-malignant diseases of the GIT) were generally lower and without significant differences (p>0.05). Similarly, ELISA based on the common N-terminus (78 amino acids) of T antigens of either PyV revealed sero-reactivities of 17 % - 39 %. These data did not indicate any clear association of HPyV9 and HPyV12 with diseases of the GIT. Among the 12 cell lines tested to support HPyV9 and HPyV12 replication by transfection of synthetic genomes, the Vero cell line allowed the strongest increase in VP1 mRNA copies. Occasionally, cytopathic effects were observed, and viral proteins detected in immunofluorescence assay. Analysis of the early gene region of both viruses on the mRNA level resulted in identification of spliced LTAg- and small TAg-encoding mRNAs. In addition, so far unknown alternative TAgs (HPyV9-145T and HPyV12-84T) were identified. The results presented here contribute to the partial characterization of HPyV9 and HPyV12. Future studies concerning geno- and seroprevalence of the two PyV with alternative and larger sample panels are needed as the present results gave only first insights. The limitations of the protocol to test cell lines as potential in vitro replication systems might be overcome by further optimization and inclusion of primary cell lines. Characterization of the transforming potential of the identified LTAg splice variants will be of specific interest as they can be assumed to play a role in the oncogenic transformation of host cells and in pathogenesis.

Zellkultivierungen stellen ein elementares Werkzeug für die Erforschung vielfältiger biologischer Phänomene dar. In der Virologie werden Infektionen in vitro fast ausschließlich in Monolayer-Kulturen charakterisiert und erforscht, in denen Zellen flach ausgebreitet auf starren Oberflächen kultiviert werden und im Vergleich zum in vivo Status der gleichen Zellen deutliche Unterschiede bezüglich Morphologie und Physiologie aufweisen. Im Gegensatz dazu werden in einigen Teilen von Forschungsfeldern wie der Onkologie und der Stammzellforschung, aber auch für spezielle virale Erreger, deren Bedürfnisse keine andere Art der Kultivierung zulassen, bereits seit Jahrzehnten alternative Kultivierungsmethoden verwendet. Bei diesen Alternativen handelt es sich um dreidimensionale (3D) Gewebekulturen, in denen Zellen in vivo-ähnliche Charakteristika aufweisen und somit ein sehr gutes Abbild des jeweiligen Gewebes und untersuchten biologischen Phänomens liefern. Für Infektionen mit Orthopockenviren (OPV), deren Analyse aufgrund des zoonotischen Potentials einiger Vertreter wie den Kuhpockenviren (CPXV) einerseits und der Bedrohung eines Missbrauchs als bioterroristisches Agens des humanpathogenen Variola Virus andererseits, von hoher Relevanz für die öffentliche Gesundheit ist, wurden bis dato nur wenige Untersuchungen in 3D-Kulturmodellen publiziert. Diese beschränkten sich hauptsächlich auf morphologische Charakterisierungen und die Analyse der Wirksamkeit verschiedener antiviraler Substanzen. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Etablierung eines 3D-Zellkulturmodells, das einerseits zur weiterführenden Erforschung von OPV Infektionen beitragen sollte und andererseits einfacher zu handhaben und an ein breiteres Spektrum möglicher Wirtszellen adaptierbar sein sollte als bisher etablierte 3D-Ansätze. Zu diesem Zweck wurde als Fundament für die 3D-Kulturen eine dezellularisierte biologische extrazelluläre Matrix (EZM) verwendet, die mit verschiedenen Zelltypen besiedelt werden konnte und somit für die Untersuchung unterschiedlicher Viren geeignet war. Uninfizierte epitheliale 3D-Zellkulturen wiesen im Vergleich zu korrespondierenden Monolayer-Kulturen distinkte Unterschiede bezüglich Zellmorphologie, Differenzierungsstatus sowie Polarisation auf und zeigten auf Transkriptomebene ein ähnliches Expressionsmuster wie ihr in vivo Gegenstück – die menschliche Epidermis. Um detailliertere Erkenntnisse über die Virusreplikation von OPV und deren Interaktionen mit den Wirtszellen innerhalb eines komplexen biologischen Systems zu erhalten, wurden zwei epitheliale 3D-Infektionsmodelle mit dem CPXV-Stamm Brighton Red (BR) als Modellvirus etabliert. Durch die 3D-Kultivierung der Zelllinie Vero E6 konnte bei einer Infektion mit CPXV eine im Vergleich zur Monolayer-Kultur deutlich verlängerte Zellviabilität bei annähernd gleichbleibenden Virustitern erzielt werden. Weiterhin war in diesem Modell, wie auch bei der Weiterentwicklung der 3D-Kulturen mit primären humanen Keratinozyten, eine effektivere Virusreifung in Zelllysaten und Überständen zu erreichen. Während die Virusreplikation in 3D- und Monolayer-Kultur ansonsten sehr ähnlich ablief, gab es in primären 3D-Kulturen erhebliche Unterschiede im Wirtszelltranskriptom, die sich signifikant auf die Regulation spezifischer biologischer Prozesse auswirkten. Zudem konnte durch die Inhibition des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors, der sich anhand von Vorergebnissen und früherer Arbeiten unserer Arbeitsgruppe als vielversprechendes Ziel für eine antivirale Therapie mit Gefitinib anbot, erstmals gezeigt werden, dass eine Virusinfektion in Abhängigkeit der Kultivierungsart in 3D-kultivierten Zellen wesentlich effizienter gehemmt werden kann als in korrespondierenden Monolayer-Kulturen. Das in dieser Arbeit etablierte Kultivierungsmodell stellt ein vielfältig einsetzbares, reproduzierbares und im Vergleich zu komplexeren 3D-Ansätzen einfacher zu handhabendes 3D-Zellkulturmodell für Zelllinien und Primärzellen dar. Durch das gewebeähnliche Verhalten der Zellen können in vitro prädiktivere Daten für das Geschehen in vivo generiert und mögliche Zielmoleküle für antivirale Substanzen ermittelt werden, die in konventionellen Monolayer-Kulturen aufgrund des artifiziellen Wachstums der Zellen unter Umständen nicht von Relevanz sind. Andersherum trägt die 3D-Kultivierung auch dazu bei, die mitunter langwierige Erforschung von Zielmolekülen zu vermeiden, die durch Versuche in Monolayer-Kulturen identifiziert werden und unter Umständen lediglich kultivierungsabhängige Artefakte darstellen. Aufgrund der besseren Vorhersage der Wirkungsweise von Substanzen in vivo können so eventuell notwendige Tierversuche präziser geplant und auf ein Minimum reduziert werden und somit nur noch die aussichtsreichsten Kandidaten in weiterführende, kostenintensive klinische Studien überführt werden. Cell cultivations reflect a fundamental tool for research on diverse biological phenomena. Research on viruses in vitro is mainly carried out in conventional monolayer cultures where cells grow outstretched and flattened on rigid surfaces. Compared to in vivo conditions monolayer cultured cells show distinct differences in morphology and physiology. Unlike in virology, three-dimensional cell cultivation methods are used in different fields of research such as oncology or stem cell research since several decades because of their in vivo like characteristics and therefore high similarity to the respective organs or investigated biological phenomena. But also a few viruses whose biological needs are linked to more complex and differentiated tissues are studied in 3D cultures since more than twenty years. So far, infections with orthopoxviruses (OPV) which are highly relevant for public health because the zoonotic potential of some species such as cowpox virus (CPXV) as well as the threat of Variola virus being misused as a biological weapon were rarely studied in 3D culture models. The few existing studies were limited to morphological characterizations and some efficacy studies of antiviral substances. Therefore, the aim of the study was on the one hand the establishment of an easy-to-handle 3D cell culture model for comprehensive investigations of OPV infections. Further, the 3D culture system should allow adaption to a broad spectrum of cells for the study of different viruses. For this reason, a decellularized biological extracellular matrix (ECM) was used to generate 3D cultures with several cell types. Uninfected epithelial 3D cultures showed distinct differences regarding cell morphology, differentiation, and polarization compared to the corresponding monolayer cultures. Their gene expression patterns exhibited strong similarities to their in vivo counterparts – the human epidermis. For more detailed analysis of OPV replication and virus-host cell interactions within a complex biological system two epithelial 3D infection models with CPXV Brighton Red (BR) as model virus were established. Cell viability in CPXV-infected 3D cultures established with the Vero E6 cell line was distinctly prolonged compared to the corresponding monolayer cultures producing nearly stable viral titers. In this infection model as well as in an advanced 3D culture system with primary human keratinocytes efficiency of virus maturation in cell lysates and in supernatants was strongly elevated. However, while overall virus replication in 3D and monolayer cultures was comparable, considerable differences in the host cell transcriptome were observed which resulted in a significant differential regulation of specific biological processes. Based on the data from the 3D culture and on data from previous studies of our working group, the epidermal growth factor receptor emerged as a promising target for a host-directed antiviral therapy that could be specifically inhibited by gefitinib. With this approach it was shown for the first time that virus inhibition was cell culture model dependent with a strongly enhanced efficiency in 3D cultures. In summary, this versatile and reproducible 3D culture system for cell lines and primary human cells is far easier to handle than many previously established 3D approaches. Due to the tissue-like behavior of the cells, data generated in vitro will be more predictive for the in vivo situation. Therefore, 3D cultivation allows the discovery of novel target molecules for antiviral treatment otherwise missed due the artificial nature of conventional monolayer cultivation. Vice versa, 3D cultivation may help reducing potential lengthy and expensive research on target molecules only identified as cultivation artefacts in monolayer cultures. Due to an improved prediction of the in vivo mechanisms of substances based on 3D cultivation, animal experiments can be planned more precisely and therefore ultimately could be reduced to a minimum. In consequence, only the most promising candidate substances would finally reach the cost-intensive clinical trials.

Due to specific orientation of guanine molecules certain guanine-rich sequences can form inter- or intramolecular structures, known as Guanine (G)-quadruplexes (G4s or GQs). Over the last 10 years, it has been shown several times that RNA G-quadruplexes located in the 5´ UTR of the mRNA suppress translation, however, a recent study indicated that in eukaryotic cells RNA G-quadruplexes are globally unfolded. Under physiological conditions, the formation of RNA G-quadruplexes can be strongly regulated by interaction partners, such as helicases. Thus, the functional analysis of the RNA G-quadruplexes within the physiological and pathophysiological context is an exciting field of research. The present study describes the comprehensive captures of the cellular proteins which specifically bind to different RNA G-quadruplex motifs located in mRNAs of ARPC2, Bcl-2, MMP16 and NRAS, and hence can regulate the conformation of these secondary structures. Following metabolic labeling of proteins in the human cell line HEK293, RNA G-quadruplex binding proteins were detected using pull-down assays and LC-orbitrap mass spectrometry. Two different patterns of interactions for the RNA G-quadruplex motifs could be identified. While the RNA G quadruplexes of NRAS and MMP16 specifically interacted with a small number of proteins, those of Bcl-2 and ARPC2 exhibited a broader range of protein binding. Proteins identified in the present study are mainly involved in posttranscriptional and translational regulation and/or carcinogenesis. It is commonly accepted that RNA G-quadruplexes in the 5´ UTR of mRNAs show inhibitory effects on translation processes, however, it should be noted that this gene regulatory function has mainly been observed using reporter plasmid-based assays, so that the biological impact of the RNA G quadruplexes within the cellular system still remains unclear. In order to elucidate the functional relevance of RNA G-quadruplexes, a G-quadruplex disrupted cell line was generated by means of the CRISPR/Cas9 system. To this end, a G-quadruplex forming sequence of the anti-apoptotic gene Bcl-2 was mutated in the human melanoma cell line A-375. The Bcl-2 G-quadruplex disrupted cells showed no alternation of the endogenous Bcl-2 protein level, and consequently compared to wild type cells no increase in resistance to an apoptotic stimulus was observed. It is therefore conceivable that in previous studies G-quadruplexes were overexpressed in the transfected cells, resulting in an abnormal balance between the amounts of endogenous helicases and overexpressed G quadruplexes. As a consequence, the level of endogenous helicases was not sufficient to unwind the G-quadruplexes. Thus, the present study suggested that the genomic G-quadruplex in the 5´ UTR of the Bcl-2 mRNA is probably unfolded by its interaction partners, e.g. helicases and other proteins identified in the present study. All MS data are available from the ProteomeXchange Consortium via the PRIDE repository with identifier PXD005761. Innerhalb der Nukleinsäure befinden sich Guanin-reiche Sequenzen, welche über die spezifischen Anordnungen von Guaninmolekülen inter- bzw. intramolekulare Strukturen ausbilden und als Guanin (G)-Quadruplexe, G4s oder GQs bezeichnet werden. Während der letzten 10 Jahre konnte mehrfach gezeigt werden, dass in der 5´-UTR der mRNA lokalisierte RNA G-Quadruplexe translationshemmend wirken, wohingegen kürzlich nachgewiesen wurde, dass RNA G-Quadruplexe in eukaryotischen Zellen in der Regel in nicht-gefaltetem Zustand vorliegen. Unter physiologischen Bedingungen kann jedoch die Ausbildung von RNA G-Quadruplexen durch Interaktionspartner wie Helikasen stark reguliert werden, so dass die funktionelle Analyse der RNA G-Quadruplexe innerhalb physiologischer bzw. pathophysiologischer Zusammenhänge ein spannendes Untersuchungsgebiet darstellt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine umfassende Identifizierung der zellulären Proteine, welche spezifisch an unterschiedliche RNA G-Quadruplexmotive in der 5´-UTR von ARPC2, Bcl-2, MMP16 und NRAS binden und somit die Ausbildung dieser Sekundärstruktur regulieren können, erfolgen. Durch metabolische Markierung der Proteine in der humanen Zelllinie HEK293 gefolgt von Pull Down Assays sowie die LC-Orbitrap Massenspektrometrie wurden RNA G-Quadruplex-bindende Proteine identifiziert. Innerhalb der verwendeten RNA G-Quadruplexe konnten zwei unterschiedliche Proteinbindungsmuster detektiert werden. Es zeigte sich, dass die RNA G-Quadruplexe von NRAS und MMP16 spezifisch mit wenigen Proteinen interagieren, während die von Bcl-2 und ARPC2 ein deutlich breiteres Spektrum an Proteinbindungen ermöglichen. Die hier identifizierten Proteine sind unter anderem an posttranskriptionellen und translationalen Regulationsmechanismen bzw. an der Karzinogenese beteiligt. Obwohl weitgehend von einem translationshemmenden Effekt der RNA G-Quadruplexe in der 5´-UTR der mRNAs ausgegangen wird, konnte diese genregulatorische Funktion meistens mittels Reporterplasmid-basierten Assays nachgewiesen werden, so dass die tatsächliche biologische Funktion der RNA G-Quadruplexe im zellulären System noch weitestgehend ungeklärt ist. Um dies aufzuklären, wurde in dieser Arbeit eine Zelllinie generiert, in der die G-Quadruplexsequenz des antiapoptotischen Gens Bcl-2 in der humanen Melanomzelllinie A-375 durch das CRISPR/Cas9 System mutiert wurde. Hierdurch kann kein G-Quadruplex mehr ausgebildet werden. Die Bcl-2 G Quadruplex-defizienten Zellen wiesen im Vergleich zu den Wildtypzellen keine Änderung der endogene Bcl-2 Proteinexpression sowie keine daraus resultierte verstärkte Resistenz gegenüber einem apoptotischen Stimulus auf. Es ist daher denkbar, dass in den bislang publizierten Studien durchgeführte Assays G-Quadruplexe über Reporterplasmide überexprimiert wurden und folglich die Mengen an endogenen Helikasen aufgrund eines hohen Levels von G-Quadruplexen zu Helikasen nicht ausreichten, um diese zu entfalten. Daher deutet die vorliegende Arbeit darauf hin, dass das genomische G-Quadruplex in der 5´-UTR der Bcl-2 mRNA wahrscheinlich durch Interaktionspartner, zum Beispiel die hier identifizierten Helikasen aber auch andere Proteine, entfaltet werden kann. Alle massenspektrometrischen Daten sind über das „ProteomeXchange Consortium“ in der PRIDE Datenbank unter PXD005761 verfügbar.

Infektionen mit humanen Adenoviren verlaufen meist mild und sind nach wenigen Wochen auskuriert. Vor allem die oberen Atemwege sind betroffen, abhängig vom Serotypen können sich auch andere Symptome ergeben. Liegt eine weitere Erkrankung vor, die mit einer natürlichen oder pharmakolo-gisch induzierten Schwächung des Immunsystems einhergeht, z.B. nach Transplantationsprozeduren, verlaufen die Erkrankungen schwerer, Infektionen können disseminieren und das Risiko, an Multior-ganversagen zu sterben, erhöht sich drastisch. Derzeit existiert keine Standardtherapie und die emp-fohlene Verabreichung von Nukleosidanaloga, intensivmedizinischer Betreuung und Palliativmedizin stellt keine befriedigende Option für die Betroffenen dar. Zwei besonders Erfolg versprechende An-sätze befinden sich noch in der Phase der Erforschung. Das Nukleotidanalogon Brincidofovir (BCV) durchlief kürzlich eine Phase-III-Studie, die zu positiven Ergebnissen kam. Sprachen Patienten binnen kurzer Zeit auf die Behandlung an, war die Wahrscheinlichkeit groß, dass sie die Infektion überwinden konnten. In der Gruppe der Non-Responder waren weiterhin zahlreiche Todesfälle zu verzeichnen. Dar-über hinaus wurden sehr eindrucksvolle Studien mit allogenen T-Zell-Spenden präsentiert. T-Zellen wurden von Spendern isoliert, ex vivo für Adenovirus-Epitope geprimt und expandiert. Anschließend wurden sie dem Patienten infundiert. Mit Hilfe dieses Ansatzes war es möglich, teilweise multiple In-fektionen verschiedener Viren gleichzeitig erfolgreich zu behandeln. Auch hier gab es kein vollständi-ges Ansprechen aller eingeschlossenen Patienten auf die Therapie, unter den Respondern waren die Aussichten auf Heilung sehr gut. Bemühungen, die Verfügbarkeit der T-Zellen als „Off-the-shelf-Pro-dukte“ zu erhöhen, sowie die Produktionszeiträume und –kosten zu senken, werden intensiv verfolgt. In einem anderen Ansatz wurde das Prinzip der RNA Interferenz ausgenutzt, um die virale Replikation zu unterbinden. Spezifische siRNAs wurden entwickelt, die ihre Zielsequenz in den mRNAs verschiede-ner, essentieller, viraler Gene hatten. Bei Anwesenheit von mRNA und siRNA, wurde die Translation des viralen Proteins inhibiert, indem die mRNA abgebaut wurde. Erste in vitro-Studien unterstrichen das hohe Potential des Ansatzes. Besonders auffällig war die Inhibierung der Replikation von hAd5 durch den Einsatz von sechs miteinander verketteten Expressionsumgebungen einer amiR, die die Ex-pression von pTP regulierte. Mit Hilfe eines adenoviralen Vektors konnte die Bildung neuer Virionen in vitro um 97,6 % vermindert werden. In der vorliegenden Arbeit wurden publizierte siRNA-, shRNA- oder amiR-Sequenzen zum Teil minimal verändert, um mit Hilfe der Expressionsumgebung der natürlichen miR-155 bereitgestellt werden zu können. Neun verschiedene amiRs mit Zielsequenzen in den mRNAs von fünf viralen Genen wurden erstellt und ihr Potential zur Inhibierung der Adenovirus-Replikation untersucht. Nach eingehender Analyse der Vektoren mit einer Kopie einer amiR-Expressionsumgebung wurden diverse Kombinati-onsvektoren erstellt, die gleichzeitig amiRs gegen pTP und / oder E1A exprimierten. Zwei der unter-schiedlich konfigurierten Vektoren erwiesen sich als ähnlich hilfreich in Hinblick auf die Verringerung der Virusreplikation und der Verbesserung der Viabilität infizierter Zellen. Der eine Vektor entsprach weitestgehend dem von Ibrisimovic et al. vorgestellten, welcher sechs Kopien der amiR-pTP expri-mierte. Die amiR-pTP wurde aus dieser Arbeit übernommen und war auch nach Expression von scAAV2-Vektoren, statt von adenoviralen Vektoren, weiterhin sehr effizient. Der andere Vektor expri-mierte neben drei Kopien amiR-pTP noch drei weitere Kopien amiR-E1A_2. Sowohl hinsichtlich der Virusreplikation als auch der Viabilität unterschieden sich die Ergebnisse der beiden Vektoren nicht signifikant voneinander. Sie wurden ausgewählt, in einem immunsupprimierten, permissiven Tiermo-dell auf ihr Potential zur Virusinhibierung untersucht zu werden. An Hand der verfügbaren Daten aus der Literatur wurde ein Modell Syrischer Hamster entwickelt, wel-che pharmakologisch immunsupprimiert wurden. Sie wurden prophylaktisch mit scAAV2/9-amiR-Ad (6x) transduziert und eine Woche später mit hAd5 infiziert. Analysen zeigten eine disseminierte Infek-tion mit replizierenden Viren in Serum, Leber, Herz und in geringen Mengen in der Milz. Der Gewebe-schaden war sehr gering, ca. 5 – 10 % der Leberzellen waren infiziert. Daraus resultierend waren keine gewebetoxischen Effekte zu beobachten. Durch den Einsatz beider amiR-Ad-Vektoren wurde die In-fektion auf ein Maß reduziert, das als klinisch unbedenklich betrachtet wird. Ähnlich wie schon in den in vitro-Studien konnten nur wenige Unterschiede zwischen den beiden Vektoren gefunden werden. Einzig die immunhistologischen Schnitte legten eine stärkere Wirkung des Vektors nahe, der sowohl amiR-pTP als auch amiR-E1A_2 exprimierte. Es konnte also experimentell belegt werden, dass drei Ex-pressionsumgebungen von amiR-pTP kombiniert mit drei weiteren für amiR-E1A_2 eine Verringerung der Virusinfektion induzierten, die in Bezug auf die Reduktion von Virusnachkommen in Leber und Se-rum, der Reduktion viraler DNA in der Leber und auch in der Bewertung der pathologischen Gewebe-schäden die größten Verbesserungen gegenüber nicht behandelten Kontrollen zeigten. Die signifikante Verringerung der Infektion kann zukünftig beispielsweise durch die Kombination mit anderen therapeutischen Ansätzen. So würde eine hAd5-Infektion auf mehreren Ebenen attackiert. Bereits vor dem Zelleintritt könnten mit Hilfe einer löslichen Virusrezeptorfalle Viruspartikel gebunden werden, welche dann nicht mehr für eine Infektion zur Verfügung stünden. Gemeinsam mit der Re-duktion der Replikation der verbliebenen Viren durch amiR-Ad-induzierte RNAi würde der Effekt ide-alerweise stärker reduziert als durch die Einzelkomponenten allein. Beide Therapien zeichneten sich tierexperimentell durch die Abwesenheit von Nebenwirkungen aus. Im Bereich der Behandlungen, die bereits stärker erforscht worden sind – BCV und T-Zell-Transplanta-tion, sind enorme Fortschritte gemacht worden. Beide Ansätze zeigten aber Lücken, wiesen Patienten-gruppen aus, die darauf nicht ansprachen, und waren z.T. mit Nebenwirkungen verbunden, die ihrer-seits schwerwiegende Konsequenzen darstellten. Mit der Erforschung der antiviralen RNAi wird ein weiterer konsequenter Schritt in die Richtung einer gut verträglichen Therapie mit breiter Anwen-dungsbasis unternommen. Das Wirkprinzip konnte in dieser Studie eindrucksvoll demonstriert wer-den, viele weitere Aspekte können in zukünftigen näher beleuchtet werden, um sowohl das Tiermodell zu verbessern als auch die Möglichkeiten der Anwendung von Kombinationstherapien zu erforschen. Human Adenoviruses usually cause mild infections and are cleared by the immune system within a few weeks. In most cases, the upper respiratory tract is affected; depending on the serotype other symp-toms may additionally occur. In presence of another disease that causes a depletion of the immune system, e.g. after transplantation procedures, infections can cause more serious symptoms, spread over the body, and the risk to die from multi-organ failure increases drastically. These days, there is no agreement on a standard therapy, while the recommended administration of nucleotide analogs, hos-pitalization in intensive care units and palliative care do not present a satisfying option. Two rather promising approaches are still being tested. The nucleotide analog Brincidofovir (BCV) was recently evaluated in phase III clinical trial. First positive results were published stating a high probability for virus clearance if the patient quickly responded to therapy. Among the non-responders several deaths occurred due to the infections, whereas deaths among responders were usually due to other causes. Impressing studies exploiting allogenic T-cell transplantation were presented as well. T-cells were iso-lated from donors, primed and expanded ex vivo, and finally infused to infected patients. Using this approach, multiple concomitant virus infections could be treated at the same time. However, there were patients who did not respond to the therapy, whereas among the responders chances for com-plete clearance of the infection were very good. These days, measurements are taken to reduce time and costs of production and to facilitate T-cells as “off the shelf” therapy. Viral infections can also be inhibited based on the principle of RNAi. Sequence-specific siRNAs finding their target sites within different crucial viral mRNAs have been developed. In presence of both, mRNA and siRNA, the translation of the viral protein is inhibited by degradation of the mRNA. Several in-vitro studies underlined the efficacy of that approach. Especially remarkable was the inhibition of hAd5 rep-lication by concatemerization of six expression cassettes of an amiR targeting pTP. Using an adenoviral vector assembly of new virions could be inhibited by 97.6 %. In this study, the published sequences of anti-adenoviral siRNAs, shRNAs or amiRs were altered to fit the amiR-expression cluster mimicking the natural environment of miR-155. Nine different amiRs were designed to find their respective target sites in the mRNAs of five adenoviral mRNAs, and their poten-tial to inhibit viral replication was evaluated. After careful analysis of the efficacy of single-copy amiR-vectors combinations of amiR-expression clusters were designed to enhance the efficiency. The new vectors expressed amiR-pTP and / or amiR-E1A_2 concomitantly; they differed in their respective con-figuration of expression cassettes. Two of them proved exceptionally potency regarding inhibition of virus replication and improvement of cell viability of infected cultures. One of them contained six cop-ies of amiR-pTP as published by Ibrisimovic et al.; the other expressed three copies of amiR-pTP and another three of amiR-E1A_2. The results obtained from both vectors never showed statistically sig-nificant differences between each other. They were chosen to be evaluated for their inhibition capa-bility in an immunosuppressed, permissive animal model. According to literature data, a Syrian hamster model was established. Concomitant to pharmacologic suppression of the immune system, they were transduced with scAAV2/9-amiR Ad (6x), and two weeks thereafter infected with hAd5. Analyses showed a disseminated infection with replicating particles in serum, liver, heart and spleen one week p.i. The pathologic damage of liver tissue was minor, as only 5 – 10 % of the cells were infected resulting in no visible toxic effects on the tissue. The administration of either one of the two vectors reduced the infection to a level that is considered clinically unremark-able. Similar to the in vitro-experiments, the differences in between the vectors were negligible, except for the immunohistochemistry, in which the vector targeting pTP and E1A performed slightly better. These results suggest that the combination of three expression cassettes of amiR-pTP and amiR-E1A_2 induced an inhibition of hAd5-infection detectable on the level of virus titer in liver and serum, viral DNA in and histopathologic assessment of liver tissue was superior to the treatment with the previ-ously published vector target pTP, exclusively. The proposed therapy may be combined with others, e.g. the virus receptor trap sCar, resulting in an attack on the infection on multiple levels. The receptor trap prevents viruses from cell entry by binding the cell attachment receptors and presenting them to immune cells via its Fc portion. Given the addi-tional reduction of virus replication based on RNAi, the effect on virus replication and infection treat-ment might ideally be higher than caused by single approach treatments. In addition to their high effi-cacy, both therapies did not induce adverse events during animal trials. Among the more researched treatments using BCV or T-cells, enormous progress has been made. On the other hand, both approaches could not be presented to be flawless. There were patients not re-sponding during clinical trials, and sometimes adverse events occurred, presenting serious problems themselves. Further investigation of RNAi as a potential antiviral therapy is another important step towards a well tolerable therapy with a broad spectrum of applications. This study serves as a proof-of-principle examination of the potential of antiviral RNAi in vivo; many more aspects should be scope of future projects improving the underlying animal model as well as the potential implementation of combined therapies.

Functional autoantibodies (aab) against the angiotensin II receptor type 1 (AT1R) and the endothelin 1 receptor type A (ETAR) have been identified in patients suffering from systemic sclerosis (SSc). Aim of this study was to investigate the effects of these aab on peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). As a first approach, expression of AT1R and ETAR has been analysed in PBMCs of SSc-Patients and healthy individuals by flow cytometry. Second, purified IgG from SSc-Patients (SSc-IgG) containing AT1R- and ETAR-aab was used to stimulate PBMCs and isolated T cells in vitro. Purified IgG from healthy individuals served as normal control (N-IgG). Alterations in cytokine secretion and chemotactic motility have been investigated by ELISA and chemotaxis assay, respectively. This study revealed that human PBMCs express both, AT1R and ETAR, and that the expression was decreased in PBMCs of SSc-patients. AT1R expression in monocytes of SSc-patients correlated with disease activity and seemed to decline in the course of the disease. SSc-IgG was able to induce the chemotaxis of isolated T cells, that was reduced by selective AT1R and ETAR antagonists. In PBMC culture, SSc-IgG led to an increased expression of the activation marker HLA-DR on inflammatory monocytes and stimulated PBMCs to secrete the inflammatory cytokine IL-8 and the profibrotic cytokine CCL18. Secretion of both cytokines was inhibited by selective antagonists too. The concentrations of the cytokines correlated with the severity of clinical manifestations of the SSc-IgG donors. It was shown here, that both AT1R and ETAR are expressed in human PBMCs. Thus these cells are susceptive to the natural ligands as well as to functional AT1R- and ETAR-aab. The reduced receptor expression found in monocytes and T cells of SSc-patients can be assumed to be a consequence of desensitization mechanisms and/or migration of highly receptor-positive cells into the surrounding tissue. SSc-IgG containing AT1R- and ETAR-aab is able to create an inflammatory and/or profibrotic environment by inducing the chemotaxis of T cells as well as the secretion of IL-8 and CCL18. In conclusion, the results of this study suggest that functional agonistic AT1R- and ETAR-aab induce and maintain pathogenic processes, and are therefore involved in the pathogenesis of SSc. Therefore, specific removal of these aab should be more than to date in the focus of SSc treatment. In Patienten mit systemischer Sklerose (SSc) sind funktionelle Autoantikörper (Auto-Ak), die gegen den Angiotensin II-Rezeptor Typ 1 (AT1R) und den Endothelinrezeptor Typ A (ETAR) gerichtet sind, identifiziert worden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Effekte dieser Auto-Ak auf humane mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) untersucht. Dazu wurde zuerst die Expression des AT1R und des ETAR in PBMCs von Gesunden und SSc-Patienten durchflusszytometrisch analysiert. Außerdem wurden aufgereinigte IgG-Fraktionen von Patienten (SSc-IgG), welche AT1R- und ETAR-Auto-Ak enthielten, für die Stimulation von PBMCs und isolierten T-Zellen in vitro verwendet. IgG von gesunden Normalspendern diente als Kontrolle. Veränderungen in der Sekretion von Zytokinen oder der chemotaktischen Motilität wurden mittels ELISA bzw. Chemotaxisassay untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass AT1R und ETAR in humanen PBMCs exprimiert werden, jedoch vermindert in SSc-Patienten. Die AT1R-Expression in Monozyten korrelierte mit der Krankheits-aktivität und schien im Verlauf der Erkrankung abzunehmen. Die SSc-IgG-induzierte Chemotaxis von isolierten T-Zellen ließ sich mit selektiven AT1R- und ETAR-Antagonisten inhibieren. In PBMC-Kultur führte SSc-IgG zur erhöhten HLA-DR-Expression auf inflammatorischen Monozyten sowie zur Sekretion des inflammatorischen Zytokins IL-8 und des profibrotischen Zytokines CCL18. Auch die Sekretion beider Zytokine ließ sich durch die selektiven Antagonisten inhibieren, die Zytokinkonzentrationen korrelierten mit der Schwere der klinischen Manifestationen der IgG-Spender. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass AT1R und ETAR in humanen PBMCs exprimiert werden. Somit sind diese Zellen für eine Regulation durch die natürlichen Liganden sowie durch funktionelle AT1R- und ETAR-Auto-Ak empfänglich. Die verminderte Expression der Rezeptoren in Monozyten und T-Zellen von SSc-Patienten ist vermutlich in Desensitisierungs-mechanismen und/oder einer Abwanderung hoch rezeptor-positiver Zellen ins Gewebe begründet. SSc-IgG bzw. die darin enthaltenen AT1R- und ETAR-Auto-Ak sind in der Lage, durch Induktion einer T-Zell-Migration sowie der Sekretion von IL-8 und CCL-18 ein entzündliches und/oder profibrotisches Milieu zu schaffen. Die Resultate dieser Arbeit lassen darauf schließen, dass funktionelle agonistische AT1R- und ETAR-Auto-Ak krankmachende Prozesse initiieren und aufrechterhalten, und somit zur Pathogenese der SSc beitragen. Die spezifische Entfernung dieser Auto-Ak sollte daher stärker als bisher in den Fokus der SSc-Behandlung rücken.

Multiple myeloma (MM) is a B-cell malignancy characterized by accumu- lation of malignant plasma cells (PC) within the bone marrow. Bone marrow mesenchymal stromal cells (BMMSCs) represent a crucial component of multiple myeloma (MM) microenvironment supporting its progression and proliferation. Alterations in bone marrow mesenchymal stromal cells of multiple myeloma patients (MM-BMMSCs) have become an important research focus. However, the role of alterations of MM-BMMSCs in the pathophysiology of MM is not clear. In this study, aberrations in MM-BMMSCs and their modification through interaction with MM cells should be analysed. MM-BMMSCs displayed a senescence-like state that was accompanied by an increased senescence associated ß-galactosidase activity (SAßGalA), a reduced number of colony-forming units, an accumulation of cells in S phase of the cell cycle and the overexpression of different microRNAs (miR-16, miR-223, miR-485-5p, miR-519d) and p21. MM-BMMSCs showed reduced expression of mitochondrial stress response protein SIRT3 and an increased mitochondrial DNA mass that was associated with a higher amount of reactive oxygen species compared to healthy donor BMMSCs (HD-BMMSCs). The overexpressed microRNAs miR-485-5p and miR-519d are located on DLK1-DIO3 and C19MC, respectively. Analyses revealed copy number accumulation and hypomethylation of both clusters. In vitro interaction with MM cells decreased the SAßGalA of MM-BMMSCs in correlation with the reduction of p21 and cells in S phase of the cell cycle. MiR-485-5p was significantly decreased in co-cultured MM-BMMSCs in connection with an increased methylation of DLK1-DIO3. Modification of miR-485-5p levels using microRNA mimic or inhibitor altered senescence and cell cycle characteristics of MM-BMMSCs. Cell contact to MM cells induced increased expression of SIRT3 associated with reduced levels of reactive oxygen species in MM-BMMSCs. Co-cultured MM-BMMSCs displayed an increased level of monocarboxylate transporter MCT1/CD147, whereas co-cultured MM cells showed a higher level of MCT4/CD147. In this context, interaction between MM-BMMSCs and MM cells led to the exchange of lactate, which was inhibited by treatment of co-cultures with MCT inhibitor alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (alpha-CN). This induced apoptosis in MM cells and suppressed the increase of SIRT3 as well as the reinforced activation of NF-kappaB in MM-BMMSCs. Inhibition of SIRT3 in HD-BMMSCs using siRNA induced increased SAßGalA and a higher level of reactive oxygen species. Furthermore, knock-down of SIRT3 led to the accumulation of HD-BMMSCs in S phase of the cell cycle. MiR-223 expression in MM-BMMSCs was reduced by the presence of MM cells in vitro in a cell-contact dependent manner. Co-cultivation of MM cells and MM-BMMSCs induced activation of notch amongst others via jagged-2/notch-2 leading to increased expression of Hes1, Hey2 or Hes5 in both cell types. Cultivation of MM-BMMSCs with increasing levels of recombinant jagged-2 reduced miR-223 and increased Hes1 levels in a concentration-dependent manner. Transient reduction of miR-223 levels increased VEGF and IL-6 expression and secretion by MM-BMMSCs and impaired their osteogenic differentiation potential. Inhibition of notch signaling induced apoptosis in both MM cells and MM-BMMSCs. Furthermore, it increased miR-223 levels and reduced the expression of VEGF and IL-6 by both cell types. MM-BMMSCs show constitutive alterations in vitro resulting in a senescence-like state. MM cells modulate multiple pathways in senescence-like MM-BMMSCs leading to a better viability. SIRT3 and the DLK1-DIO3 cluster seem to influence the senescence-like state of MM-BMMSCs. Modulation of this phenotpye by MM cells can be reduced by treatment of co-cultures with MCT inhibitor alpha-CN. It is questionable whether the senescence-like state of MM-BMMSCs plays a pathological role in active MM or is more important for the promotion of a relapse. MiR-223 seems to participate in different MM supporting pathways in MM-BMMSCs including regulation of cytokine secretion as well as osteogenic differentiation. Further in vivo analysis regarding the role of the senescence-like state of MM-BMMSCs and of miR-223 for the support of MM could provide starting points for a more efficient anti-myeloma treatment. Das Multiple Myelom (MM) ist eine B-Zellneoplasie, welche sich durch die Akkumulation maligner Plasmazellen im Knochenmark klinisch manifestiert. Mesenchymale Knochenmarkstromazellen sind eine essentielle Komponente der Mikroumgebung des MM und können die Tumorproliferation und -progression fördern. Die Untersuchung von Alterationen in Knochenmarkstromazellen von MM-Patienten (MM-BMMSCs) stellt einen Schwerpunkt in der Erforschung des MM dar. Allerdings ist der Einfluss dieser Alterationen auf die Pathogenese des MM nicht vollständig geklärt. In dieser Arbeit sollten Aberrationen in MM-BMMSCs und deren Beeinflussung durch die Interaktion mit MM-Zellen untersucht werden. MM-BMMSCs zeigten einen seneszenzartigen Zustand, welcher sich durch die erhöhte Aktivität der Seneszenz-assoziierten ß-Galactosidase (SAßGal), die verringerte Anzahl von „colony-forming units“, die Akkumulation der Zellen in der S-Phase des Zellzyklus und die Überexpression verschiedener microRNAs (miR-16, miR-223, miR-485-5p, miR-519d) und p21 äußerte. Weiterhin war dieser Phänotyp von einer reduzierten Expression des mitochondrialen Stressproteins SIRT3, einer erhöhten Masse mitochondrialer DNA und einer erhöhten Menge an reaktiver Sauerstoffspezies im Vergleich zu BMMSCs von gesunden Spendern (HD-BMMSCs) begleitet. MiR-485-5p und miR-519d sind auf den zwei genomischen Clustern DLK1-DIO3 und C19MC lokalisiert. Analysen zeigten die Hypomethylierung und Kopieanzahlakkumulation von beiden Clustern in MM-BMMSCs. Die in vitro Interaktion mit MM-Zellen führte zur Erniedrigung der SAßGal-Aktivität, welche mit der reduzierten Expression von p21 und der Reduktion der Zellen in der S-Phase des Zellzyklus assoziiert war. MiR-485-5p war signifikant reduziert in co-kultivierten MM-BMMSCs in Verbindung mit einer gesteigerten Methylierung der regulatorischen Region von DLK1-DIO3. Die Modifizierung von miR-485-5p über microRNA Mimikry und Inhibitoren beeinflusste die Zellzykluseigenschaften und den seneszenzartigen Phänotyp von MM-BMMSCs. Des Weiteren verursachte der Zellkontakt zu MM-Zellen die erhöhte Expression von SIRT3 und die Reduktion der reaktiven Sauerstoffspezies in MM-BMMSCs. Zudem konnte in co-kultivierten MM-BMMSCs ein gesteigertes Level des Monocarboxylat-Transporters MCT1/CD147 detektiert werden, wogegen in co-kultivierten MM-Zellen MCT4/CD147 erhöht wurde. In diesem Zusammenhang zeigten MM-BMMSCs und MM-Zellen einen Austausch von Laktat, welcher durch die Behandlung von Co-Kulturen mit dem MCT-Inhibitor alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (alpha-CN) inhibiert wurde. Dies führte zur Apoptose der MM-Zellen, verhinderte die Steigerung von SIRT3 und die erhöhte Aktivierung des NF-kappaB Signalweges in MM-BMMSCs. Die Inhibierung der SIRT3 Expression in HD-BMMSCs mittels siRNA verursachte eine Steigerung der SAßGal-Aktivität, sowie des Gehalts an reaktiver Sauerstoffspezies, und induzierte die Akkumulation der HD-BMMSCs in der S-Phase des Zellzyklus. Zusätzlich zeigte sich bei Co-Kultivierung mit MM-Zellen eine zellkontakt- abhängige Reduktion von miR-223 in MM-BMMSCs. Die Co-Kultivierung verursachte die Aktivierung des Notch-Signalweges in beiden Zelltypen unter anderem über eine Jagged2-Notch2-Interaktion. Diese führte zur erhöhten Expression der Notch-Targetgene Hes1, Hey2 oder Hes5 in beiden Zellfraktionen. Die Inkubation von MM-BMMSCs mit rekombinantem Jagged2 verursachte die konzentrationsabhängige Steigerung von Hes1 und gleichzeitig die Reduktion von miR-223. Die transiente Inhibierung von miR-223 erhöhte die Sekretion und Expression von IL-6 und VEGF und verschlechterte das osteogene Differenzierungspotential von MM-BMMSCs. Die Inhibierung der Notch-Signalisierung verursachte Apoptose in MM-Zellen und MM-BMMSCs und reduzierte die Expression und Sekretion von VEGF und IL-6 beider Zelltypen. Gleichzeitig wurde der Gehalt von miR-223 in MM-BMMSCs gesteigert. MM-BMMSCs zeigen konstitutive Veränderungen in vitro, welche in einem seneszenzartigen Zustand resultieren. MM-Zellen modulieren verschiedene Signalwege in seneszenzartigen MM-BMMSCs, welche die Vitalität der Zellen zu verbessern scheinen. SIRT3 und der DLK1-DIO3 Cluster könnten einen Einfluss auf den seneszenzartigen Phänotyp von MM-BMMSCs haben. Die Beeinflussung dieses Phänotyps durch MM-Zellen kann durch den MCT-Inhibitor alpha-CN reduziert werden. Es ist fraglich ob dieser Phänotyp für die Pathogenese des aktiven MM von Bedeutung ist oder vielmehr ein Rezidiv des MM fördern könnte. MiR-223 scheint eine wichtige Rolle für multiple, tumorfördernde Signalwege in MM-BMMSCs zu spielen. Hierzu zählt die Modifikation der Zytokinsekretion und der osteogenen Differenzierung von MM-BMMSCs.Weiterführende in vivo Analysen bezüglich der Rolle des Seneszenz-artigen Phänotyps von MM-BMMSCs und von miR-223 für die Unterstützung des MM könnten neue Ansatzpunkte für eine effizientere Therapie des MM aufzeigen.

Ziel dieser Arbeit war es, Proteine zu identifizieren, die spezifisch an RNA G-Quadruplexe binden. G-Quadruplexe sind ungewöhnliche Sekundärstrukturen, die von guaninreichen Nucleinsäuren gebildet werden. In der 5‘-UTR von mRNAs können sie die Translation inhibieren. Als Modellsequenzen wurden die RNA G-Quadruplexe aus der 5‘-UTR von ARPC2 (actin related protein 2/3 complex subunit 2) und MMP16 (matrix metalloproteinase 16) ausgewählt. Diese Sequenzen waren hoch konserviert und ihre Expression konnte in der humanen Nierenzelllinie Hek293 nachgewiesen werden. Das ARPC2 G-Quadruplex wurde in dieser Arbeit erstmals beschrieben. Die G-reichen Sequenzen wurden zunächst mit spektroskopischen Methoden hinsichtlich der Ausbildung eines G-Quadruplexes, sowie auf dessen Stabilität untersucht. Der Einfluss der G-Quadruplexe auf die Translation wurde mittels Dual-Luciferase-Assays bestimmt. Das ARPC2 G-Quadruplex hemmte die Translation um etwa 40 %, das MMP16 G-Quadruplex sogar um ca. 50 %. Um G-Quadruplex bindende Proteine zu identifizieren, wurden Pull-down-Assays mit Hek293 und HeLa Zelllysat durchgeführt. Es wurden eine Reihe spezifisch bindender Proteine gefunden, von denen viele zu den ribosomalen Proteinen und zu den Spleißfaktoren gehörten. Für das ARPC2 G-Quadruplex wurden deutlich mehr Proteine identifiziert als für das MMP16 G-Quadruplex. Die Bindungen zwischen einigen dieser Proteine und den G-Quadruplexen wurden genauer charakterisiert. Mittels Oberflächenplasmonresonanz-Spektroskopie konnten Bindungskonstanten im nanomolaren Bereich bestimmt werden, die ein Indiz für biologisch relevante Interaktionen liefern. Ein direkter Einfluss der Proteine auf die Translation konnte weder in Co-Transfektionsexperimenten, noch in in vitro Translationsassays gezeigt werden. Entweder ist der Einfluss der Proteine auf die Translation indirekt oder deren Bindung an die G-Quadruplex-Sequenzen hat eine andere Funktion. Durch das Verwenden eines sensitiveren Orbitrap Massenspektrometers war es möglich, die vorherigen Ergebnisse zu bestätigen und noch weitere Proteine zu detektieren. Von der ARPC2 5‘-UTR wurden zwei Spleißvarianten gefunden, von denen nur eine das G-Quadruplex enthält. Es konnte gezeigt werden, dass sie einen unterschiedlichen Einfluss auf die Translation eines Reportergens haben. Die G-Quadruplex-Variante inhibierte die Translation, während die zweite, kürzere Variante keinen Einfluss hatte. Beide Varianten wurden in MCF7, Hek293 und HeLa Zellen exprimiert. Durch Induktion von Stress auf die MCF7 Zellen wurde die G-Quadruplex-Variante deutlich hochreguliert. ARPC2 ist eine von 7 Untereinheiten des ARP2/3-Komplexes. Erstaunlicherweise besitzen sechs der Untereinheiten ein G-Quadruplex in ihrer 5‘- oder ihrer 3‘-UTR. Diese Überrepräsentation von G-Quadruplex-Sequenzen deutet auf eine gemeinsame Regulation der Untereinheiten hin. Der Einfluss dieser G-Quadruplexe auf die Translation wurde in Dual-Luciferase-Reporter-Assays untersucht. Alle G-Quadruplex-Sequenzen hemmten die Translation, wobei die 3‘-UTR G-Quadruplexe einen viel stärkeren Einfluss hatten als die 5‘-UTR G-Quadruplexe. G-quadruplexes are noncanonical secondary structures formed by Guanine-rich nucleic acids. They can serve as regulatory elements affecting different levels of gene expression. The present study focused on the identification of proteins binding RNA G-quadruplexes in 5‘-UTRs of mRNAs, which are able to inhibit translation of the respective mRNA. So far, little is known about trans-acting factors, interacting with RNA G-quadruplexes and thereby influencing their formation or function. To identify G-quadruplex binding proteins, the G-rich sequences of the 5‘-UTRs of matrix metalloproteinase 16 (MMP16) and actin related protein 2/3 complex subunit 2 (ARPC2) were chosen. Both sequences were highly conserved between different species. Their expression in the investigated Hek293 cell line was shown by RT-PCR. Formation of a G-quadruplex was already described for the MMP16 sequence, while the ARPC2 G-quadruplex was for the first time described in this work. Biophysical characterization of the G-quadruplexes was performed using CD-spectroscopy and UV-melting experiments. Both sequences were able to inhibit translation of a reporter gene. To identify G-quadruplex binding proteins, pull-down assays followed by MALDI-TOF mass spectroscopy were performed. Many of the identified proteins belonged to the groups of ribosomal proteins and splicing factors. In total, more proteins were binding to the ARPC2 than to the MMP16 G-quadruplex. The interaction of selected proteins with the G-quadruplexes was further analysed by surface plasmon resonance spectroscopy. Binding constants at nanomolar level were determined, indicating a biological relevance of the interactions. A direct influence of the identified proteins on translation could neither be shown in co-transfections with reporter plasmids nor in in vitro translation assays. This suggests they may influence translation indirectly, via activation of other factors, or they do not function on translation but rather on another process. The results have been confirmed using a more sensitive mass spectrometry method. In addition, this method identified a lot more potential G-quadruplex binding proteins. There are two variants of the ARPC2 5‘-UTR. A longer form containing the G-quadruplex and a shortend isoform lacking it. Their influence on translation was investigated in a luciferase reporter assay. While the G-quadruplex UTR inhibited translation of the reporter protein, the shorter variant had no influence on protein expression compared to the control. Expression of both variants could be shown in Hek293, MCF7 and HeLa cell lines. Interestingly, in MCF7 cells expression of the G-quadruplex variant was highly upregulated after cultivation for 96 h, without changing cultivation media, which is likely to represent stress conditions. ARPC2 is a subunit of the ARP2/3 complex, consisting of seven proteins. Six of this subunits contain a G-quadruplex in either their 5’- or their 3’-UTR. This accumulation suggests a common regulatory mechanism for the proteins. Influence on translation of this sequences was analysed by dual-luciferase assays. While all G-quadruplex sequences were able to inhibit translation, influence of the 3’-UTR sequences on translation was higher.

Adenovirus (Ad)-Infektionen zeigen beim Menschen in der Regel einen akuten, aber weitestgehend milden Krankheitsverlauf. Bei Patienten mit geschwächter Immunabwehr können Adenovirusinfektionen zu schweren und mitunter tödlich verlaufenden Erkrankungen führen. Zu den Risikogruppen gehören vor allem immunsupprimierte Patienten, wie Empfänger von Organtransplantaten, Kinder nach hämatopoetischer Stammzelltherapie aber auch Patienten mit akuter Leukämie. Gegenwärtig ist in der Klinik jedoch keine spezifisch auf Adenovirusinfektionen ausgerichtete Therapie im Einsatz. Die Behandlung basiert vor allem auf symptomatischen und unspezifischen Ansätzen. Daher bedarf es der Entwicklung neuer spezifischer anti-adenoviraler Therapieansätze. In der vorliegenden Arbeit wird das antivirale Potential rekombinanter löslicher Varianten des Coxsackievirus- und Adenovirus-Rezeptors (CAR) gegen (Ad) beschrieben. Ein besonderes Augenmerk liegt dabei auf dem Fusionsprotein sCAR-Fc, welches aus dem extrazellulären Bereich des CAR und dem Fc-Teil des humanen IgG1 besteht. 1) Von den verschiedenen untersuchten löslichen Varianten des CAR ist sCAR-Fc die effektivste im Hinblick auf die Inhibierung der Ad-Aufnahme in die Zellen. Dabei wirkt sCAR-Fc ausschließlich extrazellulär und die inhibierende Wirkung ist konzentrationsabhängig. Durch eine Verkürzung der D2-Domäne des sCAR-Fc wurden verschiedene Varianten generiert, welche eine verringerte Ad-Inhibierung aufwiesen. 2) Durch die sCAR-Fc vermittelte Inhibierung der Aufnahme von Ad konnte die adenovirale Replikation und auch der dadurch hervorgerufene zytopathische Effekt in der Zellkultur um bis zu 99 % verringert werden. 3) Die inhibierende Wirkung des sCAR-Fc war umso stärker je eher die Behandlung der Ad-Infektion begonnen wurde. So war das antivirale Potential im prophylaktischen Ansatz am größten. Allerdings konnte auch eine therapeutische Gabe von sCAR-Fc bei frühzeitigem Behandlungsbeginn eine signifikante Inhibierung der Ad-Infektion erzielen. 4) Durch die systemische Applikation des im Rahmen dieser Arbeit hergestellten scAAV9-CMV-sCAR-Fc konnten hohe sCAR-Fc Serumspiegel von bis zu 40 μg/ml über einen langen Zeitraum in vivo im Mausmodell generiert werden. Dabei konnten keine Nebenwirkungen der hohen sCAR-Fc Expression beobachtet werden. 5) Die antivirale Wirkung des sCAR-Fc, welche in vitro nachgewiesen wurde, konnte ebenfalls in vivo bestätigt werden. So war es möglich durch den Einsatz von sCAR-Fc die adenovirale Infektion der Leber und des Herzens in einem immunsupprimierten Mausmodell signifikant zu inhibieren. Gleichzeitig konnte ein signifikanter Rückgang von proinflammatorischen Zytokinen in der Leber nachgewiesen werden. 6) Die Kombination von sCAR-Fc mit anderen antiviralen Agenzien, wie Cidofovir und verschiedenen gegen adenovirale mRNAs gerichtete siRNAs, konnten den inhibitorischen Effekt von sCAR-Fc um ein Vielfaches verstärken. Diese Kombinationstherapie könnte einen neuen Ansatz in der Behandlung von Ad-Infektionen im immunsupprimierten Patienten darstellen. In der vorliegenden Dissertation konnte die inhibierende Wirkung löslicher CAR-Varianten gegen Ad veranschaulicht werden. Der Einsatz dieser Moleküle, allen voran sCAR-Fc, bietet damit eine zusätzliche Option bei der üblichen Behandlung von Ad-Infektionen im immunsupprimierten Patienten. Durch die Kombination mit weiteren antiviralen Agenzien könnte eine effektivere und vielversprechende Therapie bei Ad-Infektionen in Risikopatienten ermöglicht werden. Adenoviruses induce acute but mild infections in human patients. However, in immunocompromised patients adenovirus can cause severe infections sometimes leading to death. Immunosuppressed patients like recipients of organ transplantations, children after hematopoietic stem cell therapy and patients with acute leukemia are part of the high risk group. Currently, there is no specific curative anti-adenoviral therapy available in the clinics. The therapy is mainly based on the unspecific treatment of the symptoms. Therefore, there is a necessity of the development of new specific anti-adenoviral therapeutic approaches. The present study describes the antiviral potential of recombinant soluble variants of the coxsackievirus- and adenovirus-receptor (CAR) against adenoviruses (Ad). A special focus is given to the fusionprotein sCAR-Fc, which consists of the extracellular Region of CAR and the Fc-domain of the human IgG1. 1) From the different soluble CAR variants sCAR-Fc was the most efficient one in terms of cellular Ad-uptake inhibition. sCAR-Fc is effective exclusively extracellular und its inhibitory effect is concentration dependent. Through the reduction of the D2-domain of sCAR-Fc different variants were generated, which showed a reduced Ad-inhibition. 2) Due to the sCAR-Fc mediated inhibition of the Ad-uptake the adenoviral replication and the induced cytopathic effect in cell culture was reduced by 99%. 3) The inhibitory effect of sCAR-Fc was higher the earlier the treatment of the Ad-infection started and the antiviral potential in the prophylactic approach was the strongest. However, also an early therapeutic application of sCAR-Fc was able to significantly inhibit the Ad-infection. 4) Through systemic application of scAAV9-CMV-sCAR-Fc high sCAR-Fc concentrations in the serum of up to 40 μg/ml were expressed over a long period in an in vivo mouse model. No side effects could be observed during this time. 5) The antiviral effect of sCAR-Fc, which could be observed in vitro, was also verified in vivo. The treatment with sCAR-Fc was able to significantly inhibit the adenoviral infection of the liver and the heart in an immunocompromised mouse model. At the same time a significant reduction of proinflammatory cytokines in the liver could be observed. 6) The combination of sCAR-Fc treatment with other antiviral agents like Cidofovir or siRNAs against adenoviral mRNAs was able to strongly increase the inhibitory effect of sCAR-Fc. This combined therapy represents a possible new approach for the treatment of Ad-infections in immunocompromised patients. In this present study the inhibitory effect of soluble CAR-variants against Ad was demonstrated. The application of these molecules, first of all sCAR-Fc offer new options for the usual treatment of Ad-infections in immunocompromised patients. Through the combination with other antiviral agents, a more effective and promising Ad-therapy in high risk patients could be established.

Die Ankylosierende Spondylitis (AS) ist eine chronisch-entzündliche rheumatische Erkrankung ungeklärter Ätiologie, die zur Gruppe der Spondyloarthritiden gehört. Die AS ist primär durch eine Entzündung des Achsenskeletts und im weiteren Krankheitsverlauf durch eine Knochenneubildung, die zur Gelenkankylose und Syndesmophytenbildung führt, gekennzeichnet [1]. Die Zusammenhänge zwischen Entzündung und Knochenneubildung als auch die Mechanismen, die dabei zur Knochenneubildung und Gelenkankylose führen, sind wenig verstanden. Ziel dieser Arbeit war es daher, mittels immunhistologischer und histomorphometrischer Untersuchungen von Facettengelenken von AS-Patienten im Vergleich zu Autopsiekontrollen und OA-Patienten, die Sequenz des entzündungs-vermittelten Gelenkumbaus zu analysieren und beteiligte Mechanismen und Mediatoren zu identifizieren. Daneben sollte in Arthritis- und Spondylitis-Tiermodellen das Auftreten einer Knochenneubildung untersucht werden, mit dem Ziel, Modelle zu identifizieren, die für die Testung therapeutischer Ansätze zur Hemmung der Knochenneubildung geeignet sind. Als erstes wichtiges Ergebnis der systematischen Analyse der Facettengelenke von AS-Patienten konnten histomorphologische Stadien des Gelenkumbaus bei AS definiert werden. AS-Stadium 1: physiologische Gelenkmorphologie, AS-Stadium 2: Facettengelenke mit partieller oder kompletter Knorpelfusion, AS-Stadium 3: Facettengelenke mit knöcherner Fusion mit Erhalt vereinzelter Knorpelinseln, AS-Stadium 4: Facettengelenke mit totalem Verlust knorpeliger Gelenkbestandteile. Zweitens zeigte die stadienabhängige histomorphometrische Analyse der Facettengelenke den progredienten Verlust des hyalinen Gelenkknorpels (Abnahme der Knorpeldicke) und der subchondralen Endplatte (Abnahme der Dicke der Endplatte) bei AS. Daneben fand sich, koinzident mit der Knorpelfusion, das Auftreten subchondraler Knochenmarkveränderungen, das heißt eine Transformation des subchondralen Knochenmarkes in ein fibröses Pannusgewebe. Die immunhistologische Charakterisierung des Knorpelphänotyps deckte eine ausgeprägte Knorpeldegeneration in den Facettengelenken von AS-Patienten auf. Diese war charakterisiert durch eine erhöhte Apoptoserate der Chondrozyten und eine Abnahme des Proteoglykangehaltes des hyalinen Gelenkknorpels bei gleichzeitig reduzierter IL-10-, β-Catenin-, Wif-1-, Sclerostin-, Sox9-, BMP-2- und BMP-7-Expression der Chondrozyten. Anhalt für einen MMP-13-vermittelten aktiven Degradationsprozess ergab sich nicht, sodass die gezeigten Veränderungen als passive Knorpeldegeneration bewertet werden. Drittens wurde durch den direkten Nachweis Osteoklasten-vermittelter destruktiver, als auch Osteoblasten-vermittelter osteoproliferativer Eigenschaften des fibrösen Pannusgewebes die zentrale Rolle dieses Gewebes für den Umbauprozess der Facettengelenke bei AS pathophysiologisch untermauert. Durch den Nachweis Osteoblasten-vermittelter Knorpelossifikation konnte die Bedeutung der membranösen Ossifikation gezeigt werden, während sich kein Anhalt für die Beteiligung der enchondralen Ossifikation ergab (fehlende gesteigerte Expression der Hypertrophiemarker Runx2, MMP13 und COL10). Viertens zeigte die Analyse entzündlicher Veränderungen (Zellkomposition, Zellaggregate, entzündliche Mediatoren) im subchondralen Knochenmark der Facettengelenke eine stadienabhängige Anreicherung CD3+ T-Zellen sowie eine erhöhte Expression von TNFα, IL-23 und PGE2 bei AS. Diese immunologischen Veränderungen scheinen somit Bestandteil der Entzündungsreaktion zu sein und könnten Auslöser der Transformation des Knochenmarkes zu fibrösem Pannusgewebe bei AS sein. Mit diesen Ergebnissen verbessert diese Arbeit entscheidend das mechanistische Verständnis des entzündungs-induzierten Gelenkumbaus bei AS. Aufgrund der Analysen wurde das fibröse Pannusgewebe, inklusive der Osteoblasten und Osteoklasten, als neues Target für die Hemmung des Gelenkumbaus bei AS identifiziert. Als ein mögliches Modell zur Testung anti-osteoproliferativer Therapieansätze wurde das DTH-A-Mausmodell identifiziert. Dieses ist durch das Auftreten von entzündungsinduzierter membranöser und enchondraler Ossifikation gekennzeichnet, sodass eine Prüfung potenzieller neuer Wirkstoffe (wie zum Beispiel EP2- und EP4-Rezeptorantagonisten) auf beide Formen der Knochenneubildung möglich ist. Ankylosing spondylitis (AS) is a chronically inflammatory rheumatic disease with undetermined etiology, which belongs to the group of spondyloarthritides. AS is primarily characterized by the inflammation of the axial skeleton and in the course of the disease by new bone formation, which is leading to ankylosis and formation of syndesmophytes [1]. The correlation between inflammation and new bone formation as well as the mechanisms that lead to new bone formation and joint ankylosis are still poorly understood. Therefore, this study was constructed to discover an inflammatory mediated sequence of joint remodeling and the identification of involved mechanisms and mediators. In order to reach these goals facet joints of AS patients were immunohistochemically and histomorphometrical examined and compared with autopsy controls and patients with osteoarthritis. Furthermore, the occurrence of new bone formation was also investigated in animal models of arthritis and spondylitis to identify models, which are suitable for testing therapeutic strategies to inhibit this osteoproliferation. The first important conclusion of the systematic analysis of facet joints from patients with AS was the definition of histomorphological stages of the joint remodeling in AS. AS-stage 1: physiological joint morphology, AS-stage 2: facet joints with partially or completely fused cartilage, AS-stage 3: facet joints with bony fusion and a maintenance of isolated cartilage islands, AS-stage 4: facet joints with total loss of cartilaginous parts of the joint. Second, the stage-dependent histomorphometric analysis of the facet joints revealed the progressive loss of hyaline articular cartilage (decrease in cartilage thickness) and the subchondral bone plate (reduction of the thickness of the bone plate) in AS. In addition, subchondral bone marrow changes, i.e. the transformation of the subchondral bone marrow into a fibrous granulation tissue, occurred coincidentally with the fusion of the articular cartilage. The immunohistological characterization of the phenotype revealed a degeneration of the cartilage of facet joints from patients with AS. This phenomenon is characterized by an increase in apoptosis of the chondrocytes as well as a decrease in the proteoglycan content of the hyaline articular cartilage along with a reduced expression of IL-10, β-catenin, wif-1, sclerostin, Sox9, BMP-2 und BMP-7 by chondrocytes. Because of the lack of evidence for an MMP-13-mediated active process of degradation, the shown changes are assessed to be a kind of passive degeneration of the cartilage. Third, the importance of fibrous granulation tissue for the process of joint remodeling in facet joints from patients with AS could be proven for the first time through the direct detection of both, osteoclast-mediated destructive as well as osteoblast-mediated osteoproliferative properties of this tissue. Hence the proof of the osteoblast-mediated cartilage ossification the importance of the membranous ossification was verified, whereas no evidence for the involvement of the process of endochondral bone formation could be detected (lack of increased expression of the hypertrophy markers Runx2, MMP13 und COL10). Fourth, the analysis of inflammatory changes displayed (cell composition, cell aggregates, inflammatory mediators) an stage-dependent enrichment of CD3+ T-cells as well as an increased expression of TNFα, IL-23 und PGE2 within the subchondral bone marrow in facet joints from patients with AS. These immunological changes appear to be part of the inflammatory reaction and could be the trigger for the transformation of the subchondral bone marrow into the fibrous granulation tissue in AS. As a consequence of the gained results, this study significantly improves the mechanistic understanding of the pathological process of joint remodeling in AS. Due to the analysis the fibrous granulation tissue, including the osteoblasts and osteoclasts, could be identified as the new target for the inhibition of the process of joint remodeling in AS. The DTH-A mouse model was identified as a possible model for testing anti-osteoproliferative therapeutic approaches. This model is characterized by the occurrence of inflammatory induced endochondral and membranous ossification and therefore shows that the impact of potentially new substances (such as EP2 and EP4 receptor antagonists) can be examined on both forms of new bone formation.

Embryonale Stammzellen werden auf verschiedensten Gebieten der regenerativen Medizin als Hoffnungsträger für zellbasierte Therapien für eine Vielzahl von Krankheiten angesehen. Des Weiteren finden sie im Rahmen der medizinischen Forschung im Bereich der Entwicklungsbiologie, Embryotoxikologie und Pharmakologie vielseitig Anwendung und werden in diesem Zusammenhang als Modellsysteme eingesetzt. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Etablierung eines Teratommodells aus murinen embryonalen Stammzellen, das einerseits zur Beurteilung der Qualität von Stammzellpräparaten dienen und andererseits für die Entwicklung eines neuen Embryotoxizitätstestsystem genutzt werden sollte. Verschiedene Parameter der Zellkultivierung bzw. der Teratombildung in der NOD/SCID-Maus (Zellzahl, Probenahmezeitpunkt, Markerprofil, Applikationsroute, Biolumineszenz) wurden untersucht. Durch die Analyse des Expressionsprofils auf RNA- und Proteinebene sowie histopathologische Bewertungen und Biolumineszenzanalysen wurden das in vitro und in vivo Verhalten der embryonalen Stammzelllen (7AC5) charakterisiert und die Einwirkung von Referenzsubstanzen mit embryotoxischem Potenzial bestimmt. Es wurden folgende Ergebnisse generiert. 1. Murine embryonale 7AC5/EYFP-Stammzellen verhalten sich hinsichtlich Wachstumseigenschaften unter feeder- und serumfreien (7AC5/FF) Kultivierungsbedingungen vergleichbar zur Standardkultur auf Feederzellen (7AC5/MEF). Die 7AC5/FF- und 7AC5/MEF-Stammzellen sind durch eine hohe Expression der Pluripotenzmarker (Oct-3,4, Nanog, Sox2) gekennzeichnet. Nur der Pluripotenzmarker SSEA-1 ist auf 7AC5/FF-Stammzellen signifikant schwächer exprimiert. Jedoch hat die verminderte Expression von SSEA-1 keinen direkten Einfluss auf den pluripotenten Charakter der Zellen. In vivo sind 7AC5-Stammzellen durch ein vergleichbares Differenzierungspotenzial und Teratombildungsrate wie 7AC5/MEF-Stammzellen gekennzeichnet. 2. 7AC5/FF-Stammzellen wurden durch Nukleofektion mit einem Luciferaseplasmid als Reportergen stabil transfiziert. Die transfizierten Zellen (7AC5/Luc) zeigen vergleichbare Wachstumseigenschaften zu nicht-transfizierten Zellen in vitro und in vivo. Durch die Integration des Luciferaseplasmids in das Zellgenom ist eine semiquantitative Charakterisierung des Engraftmentpotenzials möglich. Nach der Applikation über unterschiedliche systemische und organspezifische Transplantationsrouten in NOD/SCID-Mäuse wurde die Teratombildungsrate in Abhängigkeit von der Zellzahl detailliert untersucht. Es zeigte sich eine zeitlich verzögerte Teratombildungsrate mit abnehmender Zellzahl, die unter anderem durch die Transplantationsroute beeinflussbar war. Die 7AC5-abgeleiteten Teratome wiesen jedoch, unabhängig von den experimentell untersuchten Parametern und Transplantationsbedingungen, ein vergleichbares Differenzierungspotenzial in vivo sowie ein charakteristisches Expressionsprofil auf. Durch die stabile Integration eines Luciferaseplasmids wurde eine duale Reportergen-tragende Stammzelllinie (EYFP- und Luc-Gen) etabliert, deren Zelleigenschaften in vitro, in vivo und ex vivo detektiert werden kann. 3. Zur Etablierung des Embryotoxizitätstestsystems wurde die embryotoxische Wirkung von verschiedenen Referenzsubstanzen aus drei Embryotoxizitätsklassen in vitro (zwei Substanzen je Klasse) und in vivo (eine Substanzen je Klasse) an 7AC5-Stammzellen untersucht. Die bestimmten IC50-Werte ermöglichten eine erste in vitro Klassifizierung der untersuchten Substanzen nach ihrem embryotoxischen Potenzial, sodass Saccharose und Coffein als nicht embryotoxische, Dexamethason und Valproinsäure als schwache und 6-AN und 5-FU als stark embryotoxische Substanzen eingeordnet werden konnten. Zur weiteren Charakterisierung wurden in vivo Studien an NOD/SCID-Mäusen mit Saccharose, VPA und 5-FU durchgeführt. Durch die Substanzbehandlung wurde das Teratomwachstum entsprechend der Embryotoxizitätsklasse nicht, moderat bzw. stark gehemmt. Die Behandlung mit der stark embryotoxischen Substanz 5-FU verminderte signifikant die Teratomentwicklung. Außerdem wurde die Vielfältigkeit der Keimblattstruktur in den stammzellabgeleiteten Teratomen negativ beeinflusst. Im Expressionsprofil konnte mittels des untersuchten Markerpanels von Pluripotenz- und Differenzierungsmarkern nur bei der stark embryotoxischen Substanz 5-FU in vitro und in vivo partielle Unterschiede nachgewiesen werden. Das im Rahmen dieser Arbeit etablierte Teratommodell von 7AC5-Stammzellen in der NOD/SCID-Maus kann unter Verwendung von in vivo live Imaging Methoden (Biolumineszenz) genutzt werden, um die Organverteilung, das Engraftment- und Differenzierungspotenzial von embryonalen Stammzellen zu untersuchen. Des Weiteren ist eine Klassifizierung von neuen Substanzen nach ihrem embryotoxischen Potenzial möglich. Durch Verwendung von humanen embryonalen bzw. induziert pluripotenten Stammzellen zur Teratombildung ist die Etablierung eines humanisierten Testsystems zur Substanztestung in der Maus möglich. Embryonic stem cells are a promising tool for cell-based therapies in many fields of regenerative medicine. Furthermore, they play an important role as a model system and research tool for developmental biology, embryotoxicology and pharmacology. The present work is engaged in the establishment of a teratoma model with murine embryonic stem cells, which can be used on the one hand for the quality assessment of stem cell sources and on the other hand for the development of a new embryotoxicity test system. Different cultivation conditions and the teratoma model (cell number, time point of sample collection, marker profile, application routes, bioluminescence) were characterized. Analyzing the expression profile on RNA and proteine level, histopathological assessment of the samples and bioluminescene studies were used to determine the in vitro and in vivo behaviour of the murine embryonic 7AC5 stem cell line and the influence of reference drugs with embryotoxic potential on these characteristics. Folllowing results were achieved: 1. Murine embryonic 7AC5/EYFP stem cells are characterized by a comparable morphology under feeder- and serum-free conditions (7AC5/FF) due to the standard cultivation on feeder cells (7AC5/MEF). 7AC5/FF and 7AC5/MEF stem cells express characteristic pluripotency markers (Oct-4, Nanog and Sox2) on a high level. In contrast, SSEA-1 as a distinctive marker for pluripotency of murine embryonic stem cells is significantly lower expressed in 7AC5/FF stem cells in comparison to 7AC5/MEF stem cells. However, the lower SSEA-1 expression in 7AC5/FF stem cells seems to have no influence on the pluripotent character of the stem cell line. In vivo 7AC5/FF and 7AC5/MEF stem cells are characterized by a comparable differentiation potential, teratoma growth and development. 2. 7AC5/FF stem cells were stable transfected with a Luciferase plasmid as a reporter gene. Transfected stem cells (7AC5/Luc) show a comparable in vitro and in vivo behaviour like non-transfected 7AC5 stem cells. A semiquantitative determination of the engraftment potential was possible after the integration of the luciferase plasmid in the genome of 7AC5 stem cells. After application of these cells through different systemic and organ specific transplantations routes teratoma growth was investigated in dependent of the cell number. Teratoma development was delayed in time after application of decreasing cell numbers, which was influenced in addition by the transplantation route. However, stem cell derived teratomas are characterized by a comparable teratoma growth, differentiation potential and a distinctive expression profile independent from the investigated experimental parameters and transplantation routes. By the integration of the luciferase plasmid a dual reporter gene stem cell line (EYFP and Luc gene) was established, whose in vitro, in vivo and ex vivo cell properties can be detected by the analysis of these two reporter genes. 3. For the establishment of the embryotoxic test system with 7AC5 stem cells were investigated in vitro (two drugs per group) and in vivo (one drug per group) concerning their sensitivity towards reference drugs with different embryotoxic potential (non, weak, strong). By the determination of the IC50 values of the investigated drugs in vitro a first classification could be conducted. Saccharose and Caffeine were disposed as non embryotoxic, VPA and Dexamethason as weak embryotoxic and 5-FU and 6-AN as strong embryotoxic. For further characterization in vivo studies with NOD/SCID mice were performed with Saccharose, VPA and 5-FU. Teratoma growth was not, weak or strong inhibited by the treatment with these three drugs according to their embryotoxic potential. Treatment with 5-FU as a strong embryotoxic drug significantly decreased teratoma growth. Furthermore, the differential variability of the germ layer structures of teratomas was negatively influenced by the treatment. Expression profile of 5-FU treated 7AC5 stem cells and derived teratomas identified partial differences of investigated pluripotency and differentiation markers. In conclusion, the established teratoma model of 7AC5 stem cells in NOD/SCID mice and the application of live imaging methods (bioluminescence) can be used to determine the organ distribution, engraftment and differentiation potential of embryonic stem cells in vivo. In addition, classification of the embryotoxic potential of new drugs is possible. Using human embryonic or induced pluripotent stem cells for the teratoma model the establishment of a humanized test system in the mouse for embryotoxic drug testing is possible.

Die Leber verfügt über einzigartige immunregulatorische Funktionen, die eher zur Induktion von Toleranz führen, als eine Immunantwort auszulösen. Durch die Expression von von koinhibitorischen Rezeptoren und immunsupprimierenden Mediatoren übt die Leber einen entscheidenden Einfluss auf die Homöostase des gesamten Organismus aus. Das spezielle Milieu der Leber wird durch die Zusammensetzung und charakteristischen Eigenschaften der Zellpopulationen in den Sinusoiden und dem Parenchym bestimmt. Durch den geringen Durchmesser der Sinusoide haben passierende T-Zellen aus dem Blutstrom intensiven Kontakt mit den Lebersinusendothelzellen (LSEC), Kupffer Zellen und dendritischen Zellen der Leber. LSEC und die anderen leberresidenten antigenpräsentierenden Zellen (LAPC) nehmen Antigen aus dem Blutstrom auf und präsentieren diese über MHC Moleküle an T-Zellen. In dieser Arbeit wurde der Frage nachgegangen, auf welche Art und Weise eine Antigenpräsentation durch LSEC an CD4+ T-Zellen zur Induktion von Toleranz beiträgt und inwieweit sich die LSEC dabei von den anderen Leber APC unterscheiden. Der tolerogene Einfluss der Leber ist nicht nur auf das Organ selbst beschränkt, sondern spielt auch eine Rolle in peripheren Geweben. Damit T-Zellen lokal wirken können, müssen sie in die entsprechenden Gewebe migrieren. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass LSEC bei einer antigenspezifischen Aktivierung von naiven CD4+ T-Zellen und Th1 Zellen in vitro die darmspezifischen Homingrezeptoren α4β7-Integrin und z.T. CCR9 auf den T-Zellen hochregulierten, während die LAPC nicht dazu in der Lage waren. Die Induktion der Darmhoming-Repetoren war abhängig von LSEC-eigener Retinolsäure. In in vivo Homingassays wurde für LSEC-re-aktivierte Th1 Zellen eine präferentielle Einwanderung in den Darm und das darmassoziierte lymphatische Gewebe (GALT) nachgewiesen. Die Modulation der Effektorfunktion von T-Zellen bzw. die Induktion von Apoptose sind wichtige Mechanismen der Toleranzentstehung in der Leber. In vitro Kokulturen von LSEC bzw. LAPC mit naiven CD4+ T-Zellen bzw. Th1 Zellen zeigten, dass LSEC die Induktion bzw. Expression des pro-inflammatorischen Zytokins Interferon-γ verringerten, während die LAPC vorrangig Apotose induzierten. Die Aktivierung von CD4+ T-Zellen durch LSEC unter homöostatischen Bedingungen führt zur Induktion von FoxP3-Helios+ regulatorischen T-Zellen (TLSEC). Mittels in vitro Suppressionsassays wurde die Suppression der Proliferation und Expression von Effektorzytokinen von CD8+ T-Zellen analysiert. TLSEC waren gleichermaßen suppressiv, wie ex vivo-isolierte regulatorische T-Zellen. Im Zusammenhang mit den darm-spezifischen Migrationseigenschaften wurde in einem Transfercolitismodel in vivo die regulatorische Kapazität der TLSEC auf die Entstehung einer Darmentzündung untersucht und ansatzweise bestätigt. Wurden CD4+ T-Zellen unter Th1-polarisierenden Bedingungen durch LSEC in vitro aktiviert, dann entstanden Th1 Zellen, die neben dem pro-inflammatorischen IFNγ zusätzlich das anti-inflammatorische Zytokin IL-10 exprimierten. Diese Th1LSEC wirkten nicht mehr pro-inflammatorisch, sondern supprimierten sogar eine Th1-vermittelte Entzündung in vivo. Die Induktion von IL-10+ Th1 Zellen durch den Notch-Signalweg ist beschrieben. Hier wurde gezeigt, dass LSEC die Notch-Liganden der Dll- und Jagged- Familie auf einem hohen Niveau exprimierten. Die Blockade des Notch-Signalwegs mittels eines γ-Sekretaseinhibitors bzw. die Verwendung von Notch-defizienten CD4+ T-Zellen resultierten in einer spezifischen Inhibition der IL-10 Expression in Th1LSEC. Aus den Ergebnissen folgt, dass LSEC, abhängig vom Notch-Signalweg, suppressive IL-10+ Th1 Zellen induzieren. Zusammenfassend wurde in der hier vorliegenden Arbeit gezeigt, dass LSEC in vitro sowohl unter homöostatischen, als auch unter inflammatorischen Bedingungen regulatorische CD4+ T-Zellen induzieren. Zusätzlich haben LSEC in der Leber die einzigartige Fähigkeit, durch die Hochregulation von darmspezifischen Homing-rezeptoren auf CD4+ T-Zellen, nicht nur zur Immunregulation in der Leber selbst, sondern auch im Darm beizutragen. The liver has unique immune regulatory poperties that results in the induction of tolerance rather than inflammatory responses to antigens. By the expression of coinhibitory molecules and immunosuppressive mediators the liver plays an important role for systemic homeostasis. The unique microenvironment and the cellular constitution of the sinusoids and the parenchyma determine the outcome of hepatic immune responses. Due to the small diameter of the blood vessels, passing T cells can intensively interact with the liver sinusoidal endothelial cells (LSEC), Kupffer cells and dendritic cells. Nutrient- and hepatotrophic antigens are taken up by various liver antigen presenting cells (APC) and are presented via major histocompatibility complex class II molecules to CD4+ T cells. The present study addressed the question how the antigen-specific activation of CD4+ T cells by LSEC contributes to tolerance induction and analyzed the differences between LSEC and other liver APC during this interaction. The tolerogenic capacity of the liver is not restricted to the organ itself, but has rather systemic relevance. To affect the local immune response, T cells have to migrate into the respective tissues. Antigen-specific activation of naive CD4+ T cells and Th1 cells by LSEC in vitro induced expression of the gut-specific homing receptors α4β7-integrin and partially CCR9 on CD4+ T cells, whereas activation by LSEC-negative liver APC (LAPC) failed to increase receptor expression. Induction of gut homing receptors depended on retinoic acid, provided by LSEC. Consequently, LSEC-modulated Th1 cells migrated preferentially into the gut and gut-associated lymphoid tissue (GALT), as confirmed by homing assays in vivo. Both, the induction of apoptosis and the modulation of effector cell properties are possible underlying mechanisms contributing to hepatic tolerance. By in-vitro-culture systems, the capacity of LSEC to prevent or even inhibit expression of interferon (IFN)-γ in CD4+ T cells was demonstrated. In contrast, LAPC induced or maintained IFNγ expression in CD4+ T cells and promoted T cell apoptosis, in addition. The antigen-specific activation of naive CD4+ T cells by LSEC under steady state conditions induced the generation of regulatory FoxP3-Helios+CD4+ T cells (TLSEC). TLSEC were able to suppress proliferation and cytokine secretion of CD8+ T cells in vitro, to the same extent as ex vivo isolated regulatory T cells. According to their gut-specific migratory capacities, TLSEC even suppress the pathogenesis of a T cell-mediated intestinal inflammation in a transfer colitis model in vivo. When CD4+ T cells are primed by LSEC under Th1-polarizing conditions in vitro, IL-10+ Th1 cells were generated. Due to the expression of the anti-inflammatory cytokine IL-10 LSEC-activated Th1 cells (Th1LSEC) failed to promote a delayed type hypersensitivity (DTH) response, but rather suppressed a Th1-mediated inflammation in vivo. IL-10 expression in Th1 cells facilitates self-limitation of immune responses and prevents Th1 cell-induced pathology. IL-10+ Th1 cells can be induced via the Notch pathway. Interestingly, LSEC express high levels of Notch ligands of the Dll and Jagged family. When Notch signaling was blocked by γ-secretase inhibitor or by the usage of Notch-deficient CD4+ T cells in vitro IL-10 induction by LSEC was selectively impaired. In conclusion, LSEC induce IL-10+ Th1 cells via the Notch pathway. In the present study the induction of regulatory CD4+ T cells by LSEC under steady state and inflammatory conditions was demonstrated. In addition, LSEC have the outstanding capacity in the liver to induce gut-specific homing receptors on T cells and thereby not only contributing to the immune regulation of the liver, but also to intestinal homeostasis.

Die Famile der Orthopockenviren umschließt neben den zwar ausgerotteten, im Falle einer nicht auszuschließenden bioterroristischen Ausbringung aber hochgefährlichen Variolaviren weitere humanpathogene Viren wie das Affenpocken-, das Kuhpockensowie das Vacciniavirus. Als zoonotische Erreger endemisch in Zentral- und Westafrika, Europa sowie Südamerika, verursachen Sie lokal begrenzt bis systemisch verlaufende pustuläre Erkrankungen, welche in Einzelfällen bis zum Tod führen können. Aufgrund des seltenen Auftretens sind deutschlandweit nur wenige Speziallabore wie das Robert Koch-Institut in der Lage, den Nachweis einer Orthopockenvirusinfektion anhand serologischer, Nukleinsäure- oder Partikel-basierter Nachweisverfahren zu erbringen. Ein im Falle einer bioterroristischen Freisetzung von Variolaviren notwendiges schnelles, sensitives und einfach durchzuführendes Detektionssystem existiert bis heute jedoch nicht. Um diese Lücke zu schließen, war das Ziel dieser Arbeit die Entwicklung eines Antikörper-basierten Schnelldetektionssystems zum Nachweis von Orthopockenviren. Durch Testung Oberflächenprotein-spezifischer polyklonaler Antikörper konnte gezeigt werden, dass das Attachment-Protein A27 am geeignetsten zur Induktion Detektions- optimierter Antikörper ist. In einem mehrstufigen Screeningverfahren wurden daher monoklonale Antikörper gegen A27 generiert, deren Bindungsepitope und Bindungskinetik mittels Peptid-Epitopmapping und Oberflächenplasmonresonanz- Messung bestimmt wurden. Hierbei zeigte sich, dass gute Zugänglichkeit der Bindungsepitope sowie schnelle und multivalente Bindung entscheidend für Detektionsoptimierte Antikörper waren. Die beiden besten Antikörper wurden schließlich auf der Abicap Vor-Ort-Detektionsplattform implementiert und bezüglich Sensitivität und Spezifität beim Orthopockenvirusnachweis charakterisiert. Als Ansatzpunkt für potenzielle Weiterentwicklungen wurden diese zusätzlich in Form rekombinanter single chain fragment variable Antikörper exprimiert und getestet. Das etablierte Detektionssystem war in der Lage, alle getesteten humanpathogenen Orthopockenviren mit hoher Sensitivität von bis zu 1,75×10^2 PFU/ml in 45 Minuten zu detektieren, wobei der Nachweis aus klinischem Material sowie einem verblindetem Probenpanel ohne Kreuzreaktivitäten möglich war. Durch die schnelle und einfache Durchführbarkeit bei gleichzeitig hoher Sensitivität eignet sich das Abicap-System sehr gut für die Vor-Ort-Testung sowohl bioterroristischer als auch klinischer Proben. Darüber hinaus können die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zur Generierung Detektions-optimierter Antikörper auf anderer Erreger übertragen werden. Besides the eradicated Variola virus, which in the case of an unlikely but non excludable bioterrorist attack nevertheless remains highly dangerous, the Orthopoxvirus family contains further viruses pathogenic for humans like Monkeypox, Cowpox, and Vaccinia virus. As zoonotic agents, they are endemic in Central and Western Africa, Europe, and South America, causing mainly local to systemic pustular diseases which, in rare cases, can lead to death. Due to their rare incidence, only a few specialized laboratories like the Robert Koch-Institute are able to diagnose orthopoxvirus infections via serological, nucleic acid, or virus-particle based detection methods. However, to date there is no fast, sensitive and simple rapid on-site detection system, which in the case of bioterrorist release of Variola virus would be needed. To fill this gap, the aim of this work was to develop an antibody-based rapid detection system for Orthopoxviruses. By testing surface protein-specific polyclonal antibodies, we could show that the attachment protein A27 is most suited for induction of detection-optimized antibodies. Hence, a multi-level screening was used to generate A27-specific monoclonal antibodies whose binding epitopes and kinetics were determined by peptide epitope mapping and surface plason resonance measurement. Hereby, high accessibility of binding epitopes as well as rapid and multivalent binding were hallmarks for detection-optimized antibodies. Finally, two outperforming antibodies were implemented on the Abicap onsite detection platform and characterized regarding their sensitivity and specificity in Orthopoxvirus detection. Additionally, as a starting point for further optimization, both antibodies were expressed as recombinant single-chain variable fragments. The established rapid detection system was able to detect all tested Orthopoxviruses pathogenic to humans with high sensitivity down to 1.75×10^2 PFU/ml within 45 minutes. Detection was possible from clinical samples and a blinded sample panel without cross-reactivity. Due to rapid and simple handling at sustained high sensitivity, the Abicap-platform is highly suited for onsite testing in a bioterrorist as well as a clinical context. Furthermore, findings regarding the generation of detectionoptimized antibodies gained during this work could be transferred to other agents.

Akute Myokarditiserkrankungen im Menschen stellen ein schwerwiegendes Problem in der Klinik dar und sind eine der Hauptursachen für Herzinsuffizienz. Die sich aus ihnen entwickelnden chronischen Formen bis hin zur DCM können zu Herzversagen und der Notwendigkeit einer Herztransplantation führen. Myokarditiden können durch eine Vielzahl infektiöser Erreger ausgelöst werden, wobei Enteroviren, insbesondere Coxsackievirus B3, einen hohen Anteil ausmachen. Da die Behandlung CVB3-bedingter Myokarditiserkrankungen in der Klinik größtenteils symptomatisch erfolgt, besteht ein großer Bedarf an der Entwicklung neuer, virusspezifischer Behandlungsoptionen. Die vorliegende Arbeit beschreibt das antivirale Potential einer Anti-CVB3-Kombinationstherapie, bestehend aus einer löslichen Rezeptorvariante sCAR-Fc und Anti-CVB3-shRNAs, shRdRP2 und shRdRP4. Die Expression der Substanzen erfolgte dabei ausschließlich über virale Vektoren. 1. Sowohl sCAR-Fc als auch shRdRP2.4 waren in Zellkultur in der Lage, die CVB3-Replikation effektiv zu inhibieren. Dies zeigte sich in der Verminderung des Virustiters und einer Erhöhung der Zellviabilität. 2. Bei gleichzeitigem Einsatz beider Komponenten in vitro konnte ein additiver antiviraler Effekt beobachtet werden, der eine signifikante Steigerung gegenüber den Einzeltherapien aufwies. Der antivirale Effekt war ferner abhängig von der Dosis der eingesetzten Komponenten, was die Spezifität des additiven Effekts belegt. 3. Auch in einem akuten in vivo CVB3-Maus-Myokarditismodell zeigte sich das antivirale Potential von therapeutisch eingesetztem sCAR-Fc und prophylaktisch verabreichten shRdRP2 und 4. Beide Substanzen waren bei individuellem Einsatz in der Lage das Inflammationslevel des Herzens sowie die Viruslast im Myokard signifikant zu verringern. Ferner verbesserten sie die hämodynamischen Parameter signifikant. 4. Der in vitro beobachtete, additive antivirale Effekt bei gleichzeitigem Einsatz von sCAR-Fc und shRdRP2.4, wurde auch in vivo deutlich. So wiesen die zweifach behandelten Tiere, im Vergleich zu den einzeltherapierten, signifikant niedrigere Virustiter und Inflammationslevel im Herzen auf. Auch ihre Herzfunktionsparameter, als wichtigste Kriterien für den Erfolg einer antiviralen Therapie gegen CVB3, waren signifikant besser, als die der einzeltherapierten. 5. Die in vivo erzielten Ergebnisse der Kombinationstherapie wiesen eine äußerst starke Konsistenz auf. So konnte nach Behandlung mit AdG12 und Dox bzw. mit scAAV2/9-shRdRP2.4 die jeweils wirksame Komponente sCAR-Fc bzw. shRdRP2.4 erfolgreich nachgewiesen werden. Durch diese verringerten sich die Virustiter im Herzen signifikant, was zu einer schwächeren Immunreaktion auf das Virus mit verringerter Inflammation und letztlich zu einer verbesserten Herzfunktion führte. 6. Nebenwirkungen oder antagonistische Effekte bei gleichzeitigem Einsatz beider antiviraler Komponenten wurden weder in vitro noch in vivo beobachtet. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation veranschaulichen das große Potential von Kombinationstherapien bei der Behandlung viraler Erkrankungen. Die Strategie, Viren an verschiedenen Stellen ihres Replikationszyklus anzugreifen und somit stärker zu inhibieren, ist dabei nicht nur für CVB3-Infektionen anwendbar, sondern kann generell auf alle Viren übertragen werden. Insbesondere bei schnell mutierenden Viren kann dadurch außerdem die Entstehung von Escape-Mutanten verhindert werden. Die Kombination zweier verschiedener Wirkstoffe stellt dabei nur den ersten Schritt einer Kombinationstherapie dar und kann in Zukunft je nach Komplexität und Virulenz des Virus um weitere Komponenten erweitert werden. Acute myocarditis in humans is a major issue in the clinic and one of the main causes for heart insufficiency. Chronic myocarditis and dilated cadiomyopathy can develop upon acute myocarditis and lead to heart failure and the necessity for heart transplantation. Myocarditis can be caused by a wide variety of infectious agents, with enteroviruses and especially CVB3 being the most prevalent. Since the treatment of CVB3 caused myocarditis is mostly symptomatic, there is a big need for the development of new, virus-specific treatment options. The present study describes the antiviral potential of an anti-CVB3 combination therapy consisting of a soluble receptor variant, called sCAR-Fc, and anti-CVB3 shRNAs, namely shRdRP2.4. For the expression of both components, viral vectors were employed. 1. In vitro, both sCAR-Fc and shRdRP2.4 were capable of inhibiting CVB3 replication effectively. This was shown by the reduction of virus titer as well as the enhancement of cell viability. 2. When combining both components in vitro, an additive antiviral effect was observed. The enhancement of the antiviral potency was significant compared to the individual effects of sCAR-Fc and shRdRP2.4. Furthermore the antiviral effect was dose-dependent, proving its specificity. 3. In an acute in vivo CVB3 mouse myocarditis model, the antiviral potential of therapeutically applied sCAR-Fc and prophylactically applied shRdRP2.4 was also confirmed. When individually applying each of the components, the inflammation level and virus titer in the heart were significantly reduced. Furthermore, the hemodynamic parameters of the animals were also improved significantly. 4. The additive antiviral effect, which was observed in vitro when applying sCAR-Fc and shRdRP2.4 simultaneously, also became apparent in vivo. Combined treated mice showed significantly less inflammation and lower virus titers in the heart compared to each of the individually treated groups. Also their heart parameters, as the most important criteria for the success of an antiviral treatment against CVB3, were significantly improved compared to single treatment. 5. The results of the in vivo approach show a remarkable consistency. After treatment with AdG12 and Dox or scAAV2/9-shRdRP2.4 respectively, the antiviral agents sCAR-Fc and shRdRP2.4 were present in the animals, leading to a significant decrease of the virus titer in the heart. Therefore the immune reaction towards the virus was strongly reduced as shown by a reduced level of inflammation in the heart. Consequently the heart function in treated animals was significantly improved compared to virus-infected, untreated mice. 6.No side effects or antagonistic effects were observed following combined application of sCAR-Fc and shRdRP2.4 both in vitro and in vivo. The results of the present study prove the great potential of combination therapies for the treatment of viral diseases. The strategy to target viruses at distinct points of their replication cycle to gain higher antiviral efficacy, is not only applicable for CVB3 infections but can also be transferred to virus infections in general. Another major advantage of combination treatment is the prevention of escape mutants especially in fast mutating viruses. The combination of two active components is only the first possible step of a combined therapy and can be extended in the future depending on virus complexity and virulence.

Kardiovaskuläre Erkrankungen sind die bei weitem häufigste Todesursache für Frauen und Männer. Mit einer fortschreitenden Zunahme der Lebenserwartung steigt zudem der Anteil in der Bevölkerung mit sowohl kardialen als auch renalen Beeinträchtigungen. Die pathophysiologische Interaktion beider Organe wird als kardiorenales Syndrom bezeichnet. Geschlechterunterschiede bei chronischen Nieren- und Herzkreislauferankungen können zumindest partiell auf Sexualhormone und im Besonderen dem Östrogen zugeschrieben werden. Dessen Rezeptorisoformen ERα und ERβ werden im Myokard und im Gefäßsystem expremiert. Besonders dem ERβ wird die Modulation protektiver Wirkungsmechanismen bei der myokardialen Hypertrophie zugeschrieben. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen hatten die Identi-fikation der relativen Bedeutung der Östrogenrezeptorisoformen im normotensiven DOCA-Salz-Modell in der Maus zum Ziel. Die durch die renokardiale Anpassungsreaktion induzierte pathologische Myokardhypertrophie wurde auf physiologischer, funktioneller und morphologischer Ebene charakterisiert. Den Abschluss der Arbeit bildete die detaillierte Analyse adaptiver und maladaptiver Signaltranskduktionswege im Herzen. Durch die vorliegenden Studien konnte ein Einfluss des ERβ, jedoch nicht des ERα, auf die Ausprägung der MH im renokardialen Syndrom nachgewiesen werden. Die Deletion des Rezeptors führte in weiblichen Tieren zu einer Inversion des kardialen Phänotyps. Nur in weiblichen ERβ defizienten Weibchen konnte unter DOCA-Salz anhand von echokardiographischen Messungen eine dilatative und dekompensierte MH festgestellt werden, wohingegen alle anderen DOCA-Gruppen eine konzentrische Hypertrophie mit gesteigerter Herzfunktion ausbildeten. Darüber hinaus wurde in ERβ-/--Weibchen die stärkste Fibrose nachgewiesen, welche entscheidend zur maladaptive Anpassung beitrug. Die Analyse intrazellulärer Signaltransduktionswege zeigte, dass in männlichen Tieren vorrangig der Calcineurin/NFAT-Signalweg für die Ausbildung der MH verantwortlich zu sein scheint. Wohingegen die Deletion des ERβ in Männchen nur geringe Auswirkungen auf die kardiale Signaltransduktion zeigte, wurden in ERβ defizienten Weibchen eine deutliche Reduktion anti-hypertropher Mechanismen beobachtet. Nur die Herzen von weiblichen WT-Tieren waren durch eine hohe intrinsische Aktivität des mit der physiologischen Hypertrophie assoziierten PI3K/AKT/mTOR-Signalwegs und durch die Aktivierung weiterer protektiver Signalmolekülen gekennzeichnet. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen zum einen, dass bezogen auf die MH intrinsische und protektive Mechanismen in weiblichen Tieren mit der Deletion des ERβ ihre ursprüngliche Funktion einbüßen. Eine therapeutische Behandlungs-möglichkeit bei kardiovaskulären Erkrankungen könnte daher der Einsatz von selektiven ER-Modulatoren (selective estrogen receptor modulators, SERMS) oder spezifischen Inhibitoren einzelner an der MH beteiligter Signalmoleküle darstellen. Darüber hinaus sollte eine individuelle und geschlechtsspezifische Behandlung von Patienten mit renokardialen Beeinträchtigungen bedacht werden. Cardiovascular disease is the preeminent cause of mortality in the western world for both sexes. Due to the rising life expectancy there is a growing part of the population that is suffering from failing cardiovascular and renal system. The important clinical condition of pathophysiological interactions between the heart and the kidneys is recognized as cardiorenal syndrome. Sex differences in renal and cardiac disease can be at least partially traced to sexual hormones and especially to estrogen. The isoforms of its receptors ERα and ERβ are expressed in the myocardium and in the vasculature. Pre menopausal females seem to be relatively protected from cardiovascular disease, which implicates a regulatory function of estrogen and its receptors, and in particular the ERβ. The aim of this work was to elucidate the relative importance function of the receptor isoforms for the development of pathological MH in a normotensive DOCA-salt mouse model. The cardiac phenotype induced by reduced nephron mass, aldosterone excess and high salt was examined on a functional, morphological, and molecular level including the adaptive and maladaptive signal transduction pathways in the heart. The results of this study revealed that the ERβ but not the ERα critically coordinates protective mechanisms in a sex specific manner in the cardiorenal syndrome. The deletion of the ERβ provoked an inversion of the cardiac phenotype in WT female mice. A dilative cardiac hypertrophy was echocardiographically detected only in ERβ-/- females. Additionally, their hearts demonstrated the highest degree of perivascular fibrosis and increased wall stiffness. In WT males, a strong activation of the calcineurin/NFAT pathway as the predominant hypertrophic signal was found similar to earlier studies. In contrast, the hearts of WT females revealed strong activation of intrinsic anti-hypertrophic mechanisms such as p38MAPK and the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway which is decisive for adaptive MH. Thus, modulation of mTOR activity seems to play a crucial role in directing the heart to either adaptive or maladaptive myocardial hypertrophy. Targeting molecules within the mTOR pathway by selektive compounds could be a therapeutic strategy in the future to avoid toxic side effects of substances such as rapamycin, which are already in clinical use. Furthermore, gender specific and more individualized treatments of patients with renal and cardiovasculare desease should be considered.

Die Inhibition von Viren mittels RNA-Interferenz hat sich in den letzten Jahren als ein neuer und vielversprechender therapeutischer Ansatz erwiesen. Die vorliegende Arbeit beschreibt sowohl die Optimierung von siRNA-basierten antiviralen Ansätzen als auch neue Methoden, die eine therapeutische Anwendung vereinfachen können. 1. Für ihre Replikation synthetisieren Picornaviren einen RNA-Minus-Strang, der als Matrize für den genomischen Plus-Strang dient. In der vorliegenden Arbeit konnte mit Hilfe von Strang-spezifischen siRNAs, die gegen das zur Picornavirus-Familie gehörende Coxsackievirus B3 gerichtet waren, eine Korrelation von Virusinhibition und der Fähigkeit einer siRNA, den genomischen Plus-Strang zu inhibieren, nachgewiesen werden. 2. Mit Hilfe von DAF-spezifischen siRNAs konnte in dieser Arbeit der in der Literatur umstrittene Einfluss der zellulären DAF-Expression auf die Ausbreitung des Echovirus 30 nachgewiesen werden. Eine Downregulation dieses Rezeptors, der von vielen jedoch nicht allen Echoviren für den zellulären Eintritt benötigt wird, führte zu einer deutlichen Inhibition der Ausbreitung des Virus. 3. Im Rahmen dieser Arbeit wurde weiterhin ein Modell entwickelt, anhand dessen schnell und kostengünstig hochwirksame antivirale siRNAs erhalten werden können. Durch eine Kombination von Kriterien, die die Effizienz einer siRNA beeinflussen können, wurden in Form einer schrittweisen Filterung sechs siRNAs gegen die RdRP des EV-30 selektiert, von denen fünf effizient die Ausbreitung des Virus inhibierten. 4. Schließlich wurde eine Methode entwickelt, die den schnellen Aufbau von (Mehrfach)-shRNA-Expressionskassetten erlaubt. Für ein effizientes Delivery in Zielzellen wurden diese in AAV-Vektoren verpackt und gewährleisten so eine schnelle und potente Expression einer oder mehrerer shRNA(s). Mit AAV-Vektoren, die die Expression einer gegen die RdRP des Echovirus 30 gerichteten shRNA in Kombination mit einer shRNA gegen DAF vermittelten, gelang es, die Ausbreitung des Virus stark einzuschränken. Die Kombination beider shRNAs kann außerdem das Risiko von auftretenden Escape-Mutanten minimieren. Die Erkenntnisse der vorliegenden Arbeit liefern einen wichtigen Anteil an der Entwicklung von RNAi-basierten Ansätzen gegen Picornaviren. Darüber hinaus sind die Ergebnisse von großer Bedeutung, denn sowohl die Selektion von effizienten siRNAs als auch der schnelle Aufbau von Mehrfach-shRNA-Expressionskassetten nach dem Baustein-Prinzip sind nicht nur auf andere Viren, sondern auch auf weitere Medizin-orientierte Projekte übertragbar. In recent years, RNA interference has proven to be a powerful tool to inhibit viruses. The present work describes the optimization of siRNA-based antiviral approaches as well as new methods, which can simplify therapeutic applications. 1. Picornaviruses are small non-enveloped viruses with a single stranded RNA genome in positive orientation (+ssRNA). During their replication, a minus strand is synthesized (-ssRNA) that serves as a template for the genomic plus strand. Using strand specific siRNAs, which were directed against the coxsackievirus B3 (CVB3, a member of the picornavirus family), a correlation of virus inhibition and the ability of a given siRNA to inhibit the genomic plus strand was observed. 2. For cellular entry, the decay accelerating factor (DAF or CD55) is required as a receptor by many but not all echoviruses. By using DAF-specific siRNAs, the controversial influence of cellular DAF-expression on the life cycle of echovirus 30 (EV-30) could be detected. An efficient downregulation of endogenously expressed DAF led to a significant inhibition of EV-30 spread. 3. In the context of this work, a method was developed that allows a rapid and cost effective design of highly efficient antiviral siRNAs. Based on a combination of different criteria that may affect the efficiency, siRNAs targeting the RNA-dependent RNA-Polymerase (RdRP) of EV-30 were selected. The gradual filtering of an in silico pre-designed siRNA-pool led to six siRNAs, five of which were efficient inhibitors of EV-30 spread. 4. Finally, the new parallel cloning method was developed that allows the simultaneous production of shRNA expression cassettes, which mediate a long-term expression of the respective siRNA. In addition, the method provides potential combination of efficient shRNA expression cassettes in a building block manner resulting in multiple shRNA expression plasmids. For efficient delivery into target cells, selected shRNA expression cassettes were packed into adeno-associated virus (AAV) vectors ensuring fast and powerful expression of one or more shRNA(s). Using AAV vectors that mediate the expression of an antiviral shRNA (against the RdRP of EV-30) and a DAF-specific shRNA resulted in a strong reduction of viral spread. The combination of both shRNAs may also reduce the risk of the emergence of escape mutants. The findings of the present work contribute to the development of RNAi-based approaches against picornaviruses. The procedure also has the potential to be generally applicable for silencing of multiple endogenous targets or viruses.