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Introduction: The A2A adenosine receptor (A2AAR) is expressed in brain, vasculature and immune cells. According to the alterations of the A2AAR expression in multiple diseases, it is a highly attractive diagnostic and therapeutic target. We developed the A2AAR-specific PET radiotracer [18F]FLUDA and investigated it in healthy mice and piglets, in a rotenone-based mouse model of Parkinson’s disease (RMMPD) and in transgenic mice overexpressing the human A2AAR in heart (TG) [1 3]. Methods: On the basis of a one-pot two-step radiofluorination procedure, a remotely controlled automated radiosynthesis of [18F]FLUDA using the TRACERlab FX2N synthesis module was developed. In vitro autoradiography was performed with cryosections of tissue from animal models. In vivo stability was investigated in mouse by radio-HPLC analyses of blood plasma and brain homogenates. The biodistribution was investigated by dynamic PET/MR studies in healthy mice and piglets under control and blocking conditions (vehicle vs. blocking with 2.5 mg/kg tozadenant and/or 1.0 mg/kg istradefylline) and in both mouse models. The binding potential (BPND) in vivo was calculated using the simplified reference tissue modelling with the cerebellum as reference region. A single dose acute toxicity study was performed in Wistar rats according to the ICH guideline M3(R2). PET-derived radiation dosimetry was estimated in piglets. Results: A reliable and reproducible procedure for the automated production of [18F]FLUDA was successfully established (Fig. 1A) [4]. In vitro autoradiography revealed highly selective binding and high affinity of [18F]FLUDA towards the A2AAR of the three species (KD values 0.7-5.9 nM, Fig. 1B). At 15 min after i.v. injection of [18F]FLUDA in mice, the parent fraction accounted for about 100% in brain and 71% in plasma. PET studies confirmed the specific binding of [18F]FLUDA in vivo to the striatal A2AAR in mice and piglets (BPND=3.9 and 1.3, Fig. 1C). The availability of A2AAR in the Parkinson’s disease model was not significantly different from the control. The cardiac overexpression of human A2AAR resulted in a significantly higher accumulation of activity compared to control (1.4-fold higher ratio of the area-under-the curves obtained for myocard and blood, 1-10 min p.i., p=0.001). Toxicity studies revealed no adverse effects up to a dose of 30 µg/kg of FLUDA (approx. 4,000-fold of expected human dose). The estimated effective dose of [18F]FLUDA in humans is 16.4 µSv/MBq, which is in the range of other 18F-labeled radiotracers [5]. Conclusion: We have demonstrated that [18F]FLUDA is suitable for the determination of the availability of A2AAR in the brain in vitro and in vivo. No safety concerns are expected upon administration of [18F]FLUDA according to toxicity and dosimetry data. These results encourage the clinical translation of [18F]FLUDA. Acknowledgement: This work (project no. 100226753) was funded by the European-Regional-Development-Fund (ERDF) and Sächsische-Aufbaubank (SAB). References: [1] T.H. Lai and M. Toussaint et al., EJNNMI 2021, 48:2727–2736; [2] D. Gündel and M. Toussaint, Pharmaceuticals 2022, 15; [3] D. Gündel et al., Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 1025; [4] T.H. Lai et al., J. Label. Compd. Radiopharm. 2022, 65:162–166; [5] B. Sattler et al., J. Nucl. Med. 2020, 61:1014.

The adenosine A2A receptor (A2AR) represents a potential therapeutic target for neurodegenerative diseases. Aiming at the development of a positron emission tomography (PET) radiotracer to monitor changes of receptor density and/or occupancy during the A2AR-tailored therapy, we designed a library of fluorinated analogs based on a recently published lead compound. Among those, the highly affine 4-fluorobenzyl derivate (PPY1; Ki(hA2AR) = 5.3 nM) and the 2-fluorobenzyl derivate (PPY2; Ki(hA2AR) = 2.1 nM) were chosen for 18F-labeling via an alcohol-enhanced copper-mediated procedure starting from the corresponding boronic acid pinacol ester precursors. Investigations of the metabolic stability of [18F]PPY1 and [18F]PPY2 in CD-1 mice by radio-HPLC analysis revealed parent fractions of more than 76% of total activity in the brain. Specific binding of [18F]PPY2 on mice brain slices was demonstrated by in vitro autoradiography. In vivo PET/magnetic resonance imaging (MRI) studies in CD-1 mice revealed a reasonable high initial brain uptake for both radiotracers, followed by a fast clearance.

The adenosine A2A receptor (A2AR) has emerged as a potential non-dopaminergic target for the treatment of Parkinson’s disease and thus, the non-invasive imaging with positron emission tomography (PET) is of utmost importance to monitor the receptor expression and occupancy during an A2AR-tailored therapy. Aiming at the development of a PET radiotracer, we herein report the design of a series of novel fluorinated analogs based on the structure of the A2AR antagonist tozadenant, and the preclinical evaluation of [18F]TOZ1. Autoradiography proved A2AR-specific in vitro binding of [18F]TOZ1 to striatum of mouse and pig brain. Investigations of the metabolic stability in mice revealed parent fractions of more than 76% and 92% of total activity in plasma and brain samples, respectively. Dynamic PET/magnetic resonance imaging (MRI) studies in mice revealed a brain uptake but no A2AR-specific in vivo binding.

A2AR-Liganden sind bei ischämischen Reperfusionsschäden kardioprotektiv wirksam (1). Somit ist eine Diagnose der kardialen A2AR-Verfügbarkeit für die Behandlung von Patienten mit koronaren Erkrankungen bedeutsam. Unser Ziel war es, anhand eines transgenen Mausmodells mit einer kardialen Überexpression des humanen A2AR das Potential von [18F]FLUDA als potentielles Radiopharmakon für die Darstellung des A2AR zu evaluieren. Es wurden 4-6 Monate alte FVB/N Mäuse mit einer Kardiomyozyten-spezifischen Überexpression des humanen A2AR (A2AR TG) bzw. Kontrolltiere untersucht. Die Bestimmung der KD- und Bmax-Werte von [18F]FLUDA erfolgte autoradiographisch an Kryoschnitten von Herzexplantaten. Die In-vivo-Untersuchungen fanden unter Isoflurannarkose in einem Kleintier-PET/MRT-Scanner (nanoscan, Mediso) statt. [18F]FLUDA (7,4±3,4 MBq) wurde i.v. über die Schwanzvene 20 s nach Start der 90-minütigen PET-Messung appliziert. Die A2AR-Spezifität von [18F]FLUDA wurde durch Applikation von 2,5 mg/kg Tozadenant 10 min vor der Tracer Gabe bestimmt. Für die anatomische Korrelation und Schwächungskorrektur der PET-Aufnahmen erfolgte eine T1-gewichtete MRT. Die dynamische Rekonstruktion der Listenmodus-Daten erfolgte durch einen 3D-OSEM-Algorithmus. Die Quantifizierung der aufgenommenen Aktivität erfolgte mit PMOD. Mittels In-vitro-Autoradiografie von [18F]FLUDA konnten in den A2AR-TG Herzen die Rezeptorparameter KD (5,9 ± 1,6 nM) und Bmax (455 ± 78 fmol/mg Protein) bestimmt werden, während in den Herzen der Kontroll-Tiere die Rezeptordichte unter der Nachweisgrenze lag. Mittels PET/MR wurde 15–30 min p.i. für die A2A-R TG Tiere ein SUV-Verhältnis (SUVR) Myokard/Herzventrikel von ≥1,0 bestimmt. Tozadenant verminderte das SUVR um 6 % (p < 0.05). [18F]FLUDA ist ein vielversprechender Radiotracer zur Untersuchung der A2AR Verfügbarkeit im Herzen. (1) Boknik P, et al., Front Pharmacol. 2018; 9:1–12.

Die Erfindung betrifft eine Verbindung der allgemeinen Formel I (Formel I) worin Ar eine Phenylgruppe oder eine Pyridylgruppe ist; R1 Wasserstoff oder eine Nitrogruppe ist; und R2 Fluor oder eine Abgangsgruppe ist, wobei die Abgangsgruppe aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Nitrogruppe, einem Halogen, einem Diazoniumion oder -salz, einem Trialkylammoniumion oder -salz, einem Dialkoxyaren, einem Sulfoxid, einer Boronsäure, einem Boronsäureester, Alkylzinn, Arylzinn, einem Iodoniumion oder -salz, einem Iodonium-Ylid und einem Sulfonsäureester besteht.

Die Erfindung betrifft eine Verbindung der allgemeinen Formel I worin die Reste X1a, X1b, X2a, X2b, X3a, X3b, X4a, X4b, X5a und X5b unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff oder Deuterium sind, mit der Maßgabe, dass zumindest einer der Reste X1a, X1b, X2a, X2b, X3a, X3b, X4a, X4b, X5a und X5b Deuterium ist.

Der Adenosin-A2A-Rezeptor (A2AR) ist ein vielversprechendes Target für die molekulare Bildgebung sowohl von neurodegenerativen Erkrankungen als auch von Tumoren mittels PET. Bis zum jetzigen Zeitpunkt ist [18F]MNI 444 [Ki(hA2AR) = 2,8 nM] der einzige 18F-markierte Radiotracer, welcher in einer klinischen Studie an gesunden Probanden untersucht wurde (1). Ausgehend von dem literaturbekannten [18F]FESCH [Ki(hA2AR) = 0,6 nM] sollte durch chemische Modifikation ein deuteriertes Analogon mit einer erhöhter metabolischer Stabilität entwickelt werden (2,3). Die Synthese von FLUDA basiert auf der Einführung einer deuterierten Fluoroethoxy-Gruppe. Für die Radiosynthese von [18F]FLUDA wurde eine zweistufige Eintopfmethode ausgehend von einem Phenol- und [2H4]Ethylenditosylat-Präkursor entwickelt. Die In vitro- und In-vivo-Evaluierung erfolgte mittels Autoradiographie-, Metaboliten- und PET-Studien in CD-1 Mäusen. Es wurde eine Radiosynthese von [18F]FLUDA [Ki(hA2AR) = 0,6 nM] mit einer radiochemischen Ausbeute von 19±3% (n = 9) etabliert. Im Vergleich zu [18F]FESCH zeigt das deuterierte [18F]FLUDA eine deutlich gesteigerte In-vivo-Stabilität (15 min p.i., Gehirn: 91% intaktes [18F]FLUDA). Die In-vitro-Autoradiographie von [18F]FLUDA weist eine spezifische Aktivitätsanreicherung im Striatum nach, die durch die Rezeptorparameter KD = 4,3±0,7 nM und Bmax = 556±143 fmol/mg charakterisiert ist. In den PET-Studien wurde ein SUV-Verhältnis (SUVR) Striatum/Cerebellum von >8 (15-30 min) nachgewiesen. Selektive A2AR-Blockadestudien mit 2,5 mg/kg Tozadenant führten zu einem signifikanten Rückgang dieses SUVR um 35%. Die Radiosynthese des neuen Radiotracers [18F]FLUDA wurde erfolgreich etabliert. Aufgrund der vielversprechenden präklinischen Ergebnisse wird derzeit die Translation von [18F]FLUDA in die Klinik vorbereitet. (1) Barret et al., J Nucl Med 2015, 56, 586-91 (2) Bhattacharjee et al., Nucl Med Biol 2011, 38, 897-906 (3) Khanapur et al., J Med Chem 2014, 57, 6765-80

Objectives: The adenosine A2A receptor (A2AR) is a promising target for the development of PET radiotracers for molecular imaging of neurodegenerative diseases and cancer. Based on binding-affinities the 4 and 2-fluorobenzyl derivatives 1 (Ki(hA2A) = 5.3 nM) and 2 (Ki(hA2A) = 2.1 nM) were chosen for radiofluorination. Methods: Three different strategies for the synthesis of [18F]1 have been investigated. The first two are using [18F]fluorobenzaldehyde, which was applied either in a reductive amination or in a reduction followed by an Appel and benzylation reaction. The third strategy is based on a one-step radiolabelling starting from a boronic acid pinacol ester precursor employing [18F]TBAF and Cu(OTf)2(py)4 in n-BuOH/DMA. The specific binding of [18F]1 and [18F]2 on mice brain slices was evaluated by in vitro autoradiography. Results: The two- and four-step labelling strategies resulted in a radiochemical yield (RCY) of only 1.4% or 10% [18F]1 (non-isolated). Thus, [18F]1 and [18F]2 were prepared by a one-step procedure with a RCY of 52+7 or 9+1% (EOB), a molar activity of 135+64 or 132 GBq/µmol (EOS) and a radiochemical purity of >98%. In vitro autoradiography performed with [18F]2 demonstrated high binding to the striatum, a brain region with high density of A2AR, which could be blocked by selective A2A ligands. Conclusions: An efficient copper-mediated one-step radiolabelling procedure was established for two new highly affine A2A radiotracers. The first in vitro study with [18F]2 demonstrated excellent potential for the imaging of adenosine A2AR. Current work focuses on further in vitro and in vivo investigations.

Die Erfindung betrifft eine Verbindung der allgemeinen Formel I worin eine Phenylgruppe oder eine Pyridylgruppe ist, R1 aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, Halogen und -CN besteht; R2 aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fluor, einer fluorierten Alkylgruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, einer fluorierten Alkoxygruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen und einer fluorierten Ethergruppe besteht; Z -(CH2)n- oder -(CH2)m-C(O)-(CH2)p- ist, wobei n eine Ganzzahl von 1 bis 12 ist und wobei m und p gleich oder verschieden sein können und jeweils 0 oder eine Ganzzahl von 1 bis 12 sind.

Ziel: Die Bildgebung des Adenosin-A2A-Rezeptors mittels PET gilt hinsichtlich der Frühdiagnostik neurodegenerativer und neuroonkologischer Erkrankungen als vielversprechend. Für die Entwicklung neuer 18F-Tracer basierend auf einer Pyrazolo[2,3-d]pyrimidin-Leitverbindung [1] wurden 21 fluorierte Derivate synthetisiert. Aufgrund der Affinitätswerte wurden die 2- bzw. 4-Fluorbenzylderivate 1 (Ki(hA2A) = 5,3 nM; Ki(hA1) = 220 nM) und 2 (Ki(hA2A) = 2,1 nM; Ki(hA1) = 147 nM) als potentielle A2A-Radiotracer ausgewählt. Methodik: Für die Radiosynthese von [18F]1 wurden drei verschiedene Markierungsstrategien entwickelt. Strategien A und B erfolgten über 2 bzw. 4 Stufen unter Verwendung von [18F]Fluorbenzaldehyd. Dieser wurde für die reduktive Aminierung (A) bzw. nach Reduktion und Bromierung für die finale Benzylierung (B) verwendet. Strategie C basiert auf einer einstufigen 18F Markierung eines Boronsäurepinacol-Präkursors mit [18F]TBAF in Gegenwart von Cu(OTf)2(py)4 in DMA/n-BuOH und wurde sowohl für die Radiosynthese von [18F]1 als auch [18F]2 angewendet. Die In vitro-Evaluierung erfolgte mittels Autoradiographie in Hirnschnitten von der Maus. Ergebnisse: Die mehrstufigen Markierungsverfahren A und B ergaben radiochemische Ausbeuten von lediglich 1,4 bzw. 10% [18F]1 (nicht isoliert). Mittels der einstufigen Strategie C konnten [18F]1 und [18F]2 mit einer RCA von 51+6 bzw. 8+1% (EOB), einer AM von 135+64 bzw. 132 GBq/μmol (EOS) und einer RCR >98% erhalten werden. In-vitro-Autoradiographiestudien zeigten nur für [18F]2 eine spezifische Bindung im Striatum, die mit A2A- Liganden blockierbar war. Schlussfolgerung: Es wurde eine effiziente einstufige 18F-Markierung von zwei neuen hochaffinen A2A-Radiotracern etabliert. In ersten In-vitro-Studien erwies sich [18F]2 für die bildgebende Darstellung des Adenosin-A2A-Rezeptores als geeignet. Gegenstand aktueller Arbeiten sind weitere In-vitro- und In-vivo-Untersuchungen. Literatur: [1] Gillespie et al., Bioorg Med Chem Lett 2008, 18, 2924-2929.

Ziel: Adenosinrezeptoren wurden jüngst als potentielle neue Targets bei der Immuntherapie von Hirntumoren identifiziert. [1] Die Autoren haben sich das Ziel gesetzt, hochaffine und selektive Radioliganden für den A2A-Rezeptor-Subtyp zu entwickeln, mit deren Hilfe Hirntumoren bildgebend molekular charakterisiert und entsprechende adjuvante Therapien verbessert werden können. Methodik: Basierend auf einer Pyrazolo[2,3-d]pyrimidin Leitverbindung [2] wurden 21 fluorierte Derivate synthetisiert. Die Bindungsaffinitäten zum A2A- und zum A1-Rezeptor wurden mittels CHO-Zellen bestimmt, welche die relevanten humanen Rezeptoren hoch exprimieren. Zwei Derivate mit hoher Affinität und Selektivität wurden ausgewählt, um entsprechende Präkursoren zu synthetisieren, welche für die Radiofluorierung durch aromatische nukleophile Substitution eingesetzt werden. Ergebnisse: Strukturelle Modifikationen der Leitverbindung führten zu neuen Derivaten mit Affinitäten zwischen 0,93 nM und 369 nM (A2A) bzw. zwischen 31,3 nM und 2298 nM (A1). Das 4 Fluorbenzylderivat 1 (Ki(A2A) = 5,3 nM; Ki(A1) = 220 nM) und das 1-Brom-3-fluorbenzylderivat 2 (Ki(A2A) = 2,4 nM; Ki(A1) = 162 nM) wurden für die Radiofluorierung ausgewählt. Die Herstellung von [18F]1 erfolgte in ersten Experimenten über ein zweistufiges Verfahren ausgehend von 4 [18F]Fluorbenzaldehyd durch reduktive Aminierung mit dem Pyrazolo[2,3-d]pyrimidin-Baustein. Die Radiofluorierung von 2 wird unter Verwendung des entsprechenden Nitro-Präkursors realisiert. Schlussfolgerung: Es wurden zwei fluorierte Pyrazolo[2,3-d]pyrimidin-Derivate mit hoher Affinität und Selektivität zum A2A-Rezeptor synthetisiert, welche die weitere Entwicklung für effiziente F-18-Markierungsverfahren und erste präklinische Untersuchungen rechtfertigen. Literatur: [1] Allard et al., Immunol Cell Biol. 2017, 95(4), 333-339. [2] Gillespie et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18, 2924–2929.