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Einleitung Die Infusion tumorspezifischer T-Zellen (sog. adoptiver T-Zell-Transfer (ATT)) ist eine vielversprechende, jedoch nicht bei allen Behandelten erfolgreiche Krebstherapie. Gründe dafür könnten sein, dass die adoptiv transferierten T-Zellen nicht zum Tumor migrieren oder im Bereich des Tumors nicht aktiviert werden. Die Laktatazidose im Tumormikromilieu ist möglicherweise an letzterem Phänomen beteiligt. Diese Dissertation beschäftigt sich mit einem dualen Biolumineszenz-Reportersystem, das es ermöglichen soll adoptiv transferierte T-Zellen in einem Mausmodell in vivo zu überwachen. Des Weiteren soll es aufklären, wie Bikarbonat in vitro auf die Inhibition von T-Zellen durch eine Laktatazidose wirkt. Methodik Bei der Biolumineszenz wird im Rahmen einer enzymatischen Reaktion durch sog. Luziferasen Licht freigesetzt. Luziferase-positive CD4+-T-Zellen, die zudem transgene tumorspezifische T-Zell-Rezeptoren besitzen, sollen sich so nach einem ATT per Biolumineszenz-Bildgebung in den Empfängertieren nicht-invasiv detektieren lassen. Die biolumineszenten T-Zellen exprimieren sowohl konstitutiv eine Renilla Luziferase (Rluc), als auch eine NFAT-abhängige (nuclear factor of activated t cells) click beetle red Luziferase (NFAT-CBR). Erstere soll es ermöglichen zu beurteilen, wie und ob die adoptiv transferierten T-Zellen migrieren, expandieren und persistieren. Letztere soll anzeigen, ob sie dabei aktiviert werden. Ergebnisse Nach dem ATT in tumortragende Mäuse waren zunächst im gesamten Körper der Tiere keine Biolumineszenzsignale ermittelbar. Innerhalb weniger Tage wurde ein Rluc-Signal in einem tumornahen Lymphknoten ersichtlich, gefolgt von einem Signal im Tumor, welches über einige Wochen hinweg sehr intensiv war. Das NFAT-CBR-Signal war dagegen nur an zwei Tagen intensiv messbar und die übrige Zeit kaum zu detektieren. Der erste Höhepunkt dieses Signals ging der Remission des Tumors dabei um wenige Tage voraus. In vitro wiesen T-Zellen, die in einem laktatazidotischem Milieu aktiviert wurden, stark reduzierte Signale der NFAT-CBR auf und produzierten kein IFN-γ. Bikarbonat konnte diese Wirkungen der Laktatazidose verhindern. Schlussfolgerungen Das duale Biolumineszenz-Reportersystem ist hervorragend geeignet, um in vivo adoptiv transferierte T-Zellen zu überwachen. Wie und ob die tumorspezifischen T-Zellen migrieren, expandieren und persistieren, macht es genauso erkenntlich, wie ihre Aktivierung. Des Weiteren konnte ermittelt werden, unter welchen Bedingungen diese transgenen CD4+-T-Zellen, die gegen ein tumorspezifisches Minor- Histokompatibilitätsantigen gerichtet sind, einen Tumorrückgang auslösen. Ob der ATT wirkt, hängt dabei maßgeblich davon ab, wie groß der Tumor zum Zeitpunkt der Behandlung ist und wie stark das Zielantigen durch die Tumorzellen exprimiert wird. Zudem konnte gezeigt werden, dass eine Laktatazidose die Aktivierung dieser T-Zellen hemmt und Bikarbonat dies verhindert., Introduction The infusion of tumor-specific T cells (so-called adoptive cell therapy (ACT)) is a promising, but not always successful cancer treatment. Possible explanations for this would be that the adoptively transferred T cells do not migrate to the tumor or are not activated within the tumor site. The lactic acidosis within the tumor might contribute to the latter phenomenon. This dissertation focuses on a dual bioluminescence reporter system, designed to monitor adoptively transferred T cells in vivo in a mouse model. Additionally, it was used to determine which effect bicarbonate has on the inhibition of T cells by lactic acidosis in vitro. Methods Bioluminescence is the emission of light by so-called luciferases trough an enzymatic reaction. Luciferase-positive CD4+ T cells, which additionally possess a transgenic tumor specific T cell receptor, should be detectable non-invasively in the recipient animals after ACT via bioluminescence imaging. The bioluminescent T cells constitutively express a Renilla luciferase (Rluc) and a NFAT-dependent (nuclear factor of activated t cells) click beetle red luciferase (NFAT-CBR). The former should allow monitoring, how and if the adoptively transferred T cells migrate, expand and persist. The latter should reveal whether they are activated. Results After ACT in tumor bearing mice at first no bioluminescence was detectable throughout the body of the animals. Within a few days, however, an Rluc signal in a lymph node near the tumor appeared, followed by a signal within the tumor, which was very intense for weeks. The NFAT-CBR signal was intense on two separate days only and otherwise barely detectable. The first peak of this signal occurred a few days before the tumor regressed. In vitro T cells activated in the presence of lactic acid showed strongly reduced NFAT-CBR signals and did not produce IFN-γ. Bicarbonate prevented these effects of lactic acid. Conclusions The dual bioluminescence reporter system is perfectly suited to monitor adoptively transferred T cells in vivo. It reveals how and if tumor-specific T cells migrate, expand and persist, and whether they are activated. It was also determined under which circumstances transgenic CD4+ T cells, directed against a tumor specific minor histocompatibility antigen, cause tumor regression. Whether the ACT is effective, depends on the size of the tumor at the time of treatment and on the degree of target antigen expression by the tumor cells. Additionally, this dissertation demonstrates that lactic acid inhibits the activation of those T cells and that bicarbonate prevents this.

Minor Histocompatibility Antigens (mHag) are polymorphic peptides arising from Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) in cytosolic proteins. When presented by class I or II MHC molecules, mHag can induce cellular immune responses such as transplant rejection, graft-versus-host-disease (GvHD) and the curative graft-versus-leukaemia-effect (GvL) after HSCT in individuals lacking the same allelic variant. We determined the allelic dimorphisms of the mHag HA-1, HA-2, HA-3, HA-8, HB-1, ACC-1, ACC-2, PANE-1 and UGT2B17 as well as SNP’s in the cell adhesion molecules CD31 and CD62L by PCR-SSP typing (mHag TS-PCR-SSP Minitray Kit, CTS Heidelberg) in 320 HSCT patients and their unrelated donors. Overall survival, grades II-IV acute GvHD (aGvHD), treatment related mortality (TRM) and relapse/disease recurrence were correlated with the mHag matching grade. In the HLA-B44-positive group (n=77), patients with a single ACC-2 GvH Mismatch had an increased overall survival (p=0,04, HR:2,44, CI:1,06-5,62), due to a lower TRM rate (p=0,03, HR:0,34, CI:0,13-0,87). The same finding (overall survival: p= 0,003, HR:2,4, CI:1,34-4,36, TRM: p= 0,03, HR:0,45, CI: 0,22-0,92) was detected for patients with CD62L Codon 206 Mismatch in the HLA-A3 superfamily group (n=140). After correction for multiple testing, only CD62L Codon 206 GvH Mismatch remained as a significant factor positively influencing the overall survival rate in mismatched donor recipient pairs (p=0,04). This observation could not be attributed to any secondary outcome factor such reduced risk for TRM (p= 0,09) or disease recurrence (p= 0,93). Based on this analysis, we conclude that mHag mismatches at HA-1, HA-2, HA-3, HA-8, HB-1, ACC-1, ACC-2, PANE-1, UGT2B17 and CD31 have no important effect on the clinical outcomes after unrelated HSCT. In contrast, mismatches on the adhesion molecule CD62L are significantly associated with a higher overall survival.