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Die Hauterkrankung Epidermolysis bullosa (EB) zeichnet sich durch eine Blasenbildung der Haut und Schleimhäute aus, die mit immensem Leid für die betroffenen Patienten verbunden ist. Seit Jahrzehnten werden intensiv neue Behandlungsoptionen gesucht, wobei sich bisherige Strategien auf gentherapeutische und zellbasierte Ansätze konzentrieren. Bis heute umfassen diese Untersuchungen den Einsatz von retroviralen Vektoren, die intradermale Injektion von Fibroblasten bzw. mesenchymalen Stromazellen, die intradermale Applikation von rekombinant hergestellten Proteinen, sowie die Durchführung einer Knochenmarksstammzelltransplantation. Im Rahmen dieser Dissertation sollten die bisherigen therapeutischen Möglichkeiten dahingehend erweitert werden, dass mit Hilfe von synthetisch hergestellten mRNAs eine fehlende Genexpression in Hautzellen wiederhergestellt wird. Dabei ist es gelungen, für eine Kontroll mRNA (codierend für das Fluoreszenzprotein DsRed) und zwei verschiedene Adhäsionsmoleküle der Haut (Desmoglein-3 und Kollagen 7) entsprechende mRNAs in vitro zu synthetisieren und aufzureinigen. Nach Etablierung eines Protokolls zur erfolgreichen mRNA Transfektion von humanen und murinen Keratinozyten und Fibroblasten war es möglich die Dsg3 codierende mRNA in Dsg3 knockout Keratinozyten bzw. die Col7 codierende mRNA in Col7a1 hypomorphen Fibroblasten in vitro zu expri-mieren. Der Nachweis der Expression konnte sowohl auf mRNA-Ebene mittels RT-PCR erbracht werden, als auch auf Protein-Ebene mittels immunhistochemischer Färbungen. In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass Keratinozyten und Fibroblasten in Zellkultur mit mRNA transfiziert werden können und eine fehlende Genexpression dadurch kompensiert werden kann. Somit stellen diese Experimente den Ausgangspunkt für weiterführende in vivo Untersuchungen dar, mit dem Ziel, in den entsprechenden Mausmodellen eine Genkorrektur herbeizuführen. Sollte dies gelingen, stünde eine vielversprechende Therapieoption für Patienten mit EB zur Verfügung.

Immunsupprimierte Patienten besitzen ein erhöhtes Risiko für opportunistische Infektionen, die hauptsächlich durch das humane Cytomegalievirus (HCMV) und den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus verursacht werden. Aufgrund ihrer Lokalisation in den Geweben unterhalb von Lungenepithelien und des Gastrointestinaltraktes werden dendritische Zellen (DCs) als diejenigen Zellen betrachtet, die während der frühen Phase einer Infektion in Kontakt mit HCMV und A. fumigatus kommen und eine Aktivierung von angeborenen und adaptiven Abwehrmechanismen vermitteln. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die Bedeutung von humanen DCs bei der Bekämpfung von HCMV und A. fumigatus näher untersucht. Um mit dem klinisch relevanten HCMV Stamm TB40E arbeiten zu können, musste zuerst ein geeignetes Zellkultursystem zur Anzucht von HCMV etabliert werden. Die aus Fibroblasten aufgereinigten Viren eigneten sich zur erfolgreichen Infektion von DCs, was durch verschiedene Färbemethoden nachgewiesen werden konnte. Aus diesem Grund war es möglich, in Abhängigkeit der Zeit ein Expressionsprofil von Klasse I Interferonen (IFN-alpha, IFN-beta), ausgesuchten Cytokinen (CXCL10, CXCL11, Rantes) und den wichtigen Immunrezeptoren Toll-like Rezeptor 3 (TLR3) und dendritic cell-specific ICAM3-grabbing nonintegrin (DC-SIGN) zu erstellen. Nachdem ein RNA Interferenz (RNAi) System zur erfolgreichen Transfektion von DCs mit small interfering RNA (siRNA) etabliert werden konnte, gelang es die Expression von TLR3 signifikant herunterzuregulieren. Stimulationsexperimente mit dem synthetisch hergestellten Polymer poly I:C identifizierten TLR3 als den Rezeptor, der die Expression von IFN-beta vermittelt. Ferner konnte nachgewiesen werden, dass TLR9 bei ex vivo generierten DCs keine Funktion besitzt. Eine direkte Aktivierung von TLR3 durch HCMV konnte mittels siRNA nicht nachgewiesen werden. Durch den Einsatz von genomweiten Microarray-Analysen konnten eine Vielzahl an Genen gefunden werden, die nach Co-Kultivierung von DCs und lebenden A. fumigatus Keimschläuchen (KS) differentiell exprimiert waren. Dabei wurde ein breites Spektrum an Cytokinen (TNF-alpha, IL-6, IL-10, IL-12), Chemokinen (IL-8, CCL20, CXCL10), Co-stimulatorischen Molekülen (CD40, CD80, CD83, CD86), Prostaglandin Synthese Genen (PTGS2) und Immunrezeptoren (PTX-3, TLR2, TLR4) gefunden, deren zeitabhängiges Expressionsprofil mittels qRT-PCR eindeutig bestätigt wurde. Als Wachen des Immunsystems müssen DCs Krankheitserreger zu einem frühen Zeitpunkt der Infektion erkennen. Die Erkennung von Pilzen wird durch die unterschiedlichen Rezeptoren vermittelt, die TLRs, C-Typ Lektine und Pentraxine umfassen, wobei ihre Bedeutung für humane DCs bisher nur unzureichend geklärt ist. Durch den Einsatz von siRNA konnte die Expression von TLR2, TLR4, myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88), DC-SIGN, Pentraxin-3 (PTX-3) und caspase recruitment domain family member 9 (Card-9) signifikant verringert werden. Für TLR2, TLR4, PTX-3 und DC-SIGN konnte durch den Einsatz der RNAi aufgezeigt werden, dass diese Rezeptoren nicht an der Induktion einer pro-inflammatorischen Immunantwort von DCs nach Infektion mit A. fumigatus beteiligt sind. Sowohl die Stimulierung mit den TLR Liganden Zymosan und LPS, als auch mit A. fumigatus, führte zu einer erhöhten Expression von TNF-alpha und IL-12 (Light Cycler), die sich in einer vermehrten Cytokinfreisetzung (ELISA) bemerkbar machte. Im Gegensatz zur TLR4 siRNA Transfektion und LPS-Stimulation war keine Reduktion der Expression von TNF-alpha und IL-12 nach TLR2 und TLR4 siRNA Transfektion und anschließender Pilzinfektion zu beobachten. Auch der Einsatz von gegen TLRs gerichteten Antikörpern konnte eine mögliche Signaltransduktion bei DCs nicht unterbinden. Anstelle von TLR2 und TLR4 wurde Dectin-1 als DC-Immunrezeptor für A. fumigatus KS identifiziert. Mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers gegen Dectin-1 war es möglich, die Freisetzung von TNF-alpha und IL-12 nach Pilzinfektion zu blockieren. In einem unabhängigen Experiment mit siRNA wurde Dectin-1 als Rezeptor für A. fumigatus bestätigt. Wie fortführende Experimente mit Candida albicans KS und Zymosan gezeigt haben, handelt es sich bei Dectin-1 auf humanen DCs um einen generellen Rezeptor für Pilze. Die durchgeführten SNP-Analysen (single nucleotide polymorphism) zur Ermittlung eines Zusammenhanges mit einem erhöhten Virus- und Pilzinfektionsrisiko für Patienten nach Stammzelltransplantation erbrachten die Erkenntnis darüber, dass zwei Marker (rs735240, rs2287886) in DC-SIGN mit einer erhöhten Empfänglichkeit für HCMV, und drei Marker (rs1554013, rs3921, rs4257674) in CXCL10 mit einem vergrößerten Riskio für eine invasive Aspergillose assoziiert waren. Ein Screening von Patienten auf das Vorhandensein dieser definierten SNPs könnte helfen, die individuelle Gefahr für HCMV und A. fumigatus nach nach allogener Stammzelltransplantation abzuschätzen., Patients after allogenic stem cell transplantation (alloSCT) have an increased risk to suffer from viral and fungal infections, which are mainly caused by the human cytomegalovirus (HCMV) and the mold Aspergillus fumigatus. Due to their localization in tissues under lung epithelia and the gastrointestinal tract, dendritic cells (DCs) are considered to be the first cells coming into close contact with HCMV and A. fumigatus for the activation of innate and adaptive immune mechanisms. Within the scope of this dissertation, the role of human monocyte-derived DCs in the abatement of HCMV and A. fumgatus was analyzed. In order to work with HCMV, a cell culture system for effective culturing of the clinical relevant HCMV strain TB40E had to be established first. The viral particles up-cleaned from lung fibroblasts were used for infection of DCs and successful infection was approved by different staining methods. For this reason, it was possible to determine a time-dependent expression profile of class I interferons (IFN-alpha, IFN-beta), selected cytokines (CXCL10, CXCL11, Rantes) and immunoreceptors (TLR3, DC-SIGN). A RNA interference (RNAi) system for human DCs was established to significantly knock-down expression of TLR3 without the induction of an unwanted pro-inflammatory cytokine response. Stimulation experiments with the synthetic polymer poly I:C (which resembles dsRNA of infectious viruses) identified TLR3 as a receptor for triggering expression of IFN-beta. However, whether there is a direct activation of TLR3 through dsRNA intermediates, possibly emerging during replication of HCMV, can not be answered to date definitively, because TLR3 small interfering RNA (siRNA) transfection prior to HCMV infection did not result in minor expression of IFN-beta. Gene expression pattern of DCs after co-cultivation with living A. fumigatus germ tubes was studied by whole genome microarray analysis and real-time PCR, demonstrating an upregulation of a broad spectrum of cytokines (TNF-alpha, IL-6, IL-10, IL-12), chemokines (IL-8, CCL20, CXCL10), co-stimulatory molecules (CD40, CD80, CD83, CD86), prostaglandin synthesis genes (PTGS2), as well as genes involved in fungal recognition (PTX-3, TLR2, TLR4) and cytoskeleton organization / phagocytosis. As the sentries of the immune system, DCs must recognize fungi at an early step of infection. Pathogen detection is mediated by different receptors comprising TLRs, C-type lectins and Pentraxines (PTX), but only little is known about their relevance for DCs. Using specific siRNAs, expression of TLR2, TLR4, myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88), dendritic cell-specific ICAM3-grabbing nonintegrin (DC-SIGN), Pentraxin-3 (PTX-3) and caspase recruitment domain family member 9 (Card-9) was significantly diminished, respectively. In contrast to control experiments with TLR4 siRNA and LPS stimulation, A. fumigatus induced expression of pro-inflammatory cytokines (TNF-alpha, IL-12) was not reduced when TLR2 and TLR4 expression was knocked-down by specific siRNAs prior to infection. However, using siRNAs directed against Dectin-1 allowed demonstration of an interaction between Dectin-1 and A. fumigatus germlings, Candida albicans germ tubes and Zymosan. In an independent approach, cytokine secretion could be blocked by anti-Dectin-1 antibody treatement prior to fungal exposure. In conclusion, Dectin-1 was identified as an important fungal receptor on DCs whereas TLR2 and TLR4 seemed to play a negligible role. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) in various cellular receptor genes are associated with the susceptibility to and severity of infectious diseases. In this study, genetic polymorphisms in genes encoding for virus entry receptors have been analyzed for their association to HCMV reactivation and disease in patients after allogeneic stem cell transplantation. A comparison of different genotyping methods highlighted the advantages of the Light Cycler system, the cycle-suequencing and the matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry (MALDI-MS) when using small quantities of patients’ DNA. Two markers (rs735240, rs2287886) in the promoter region of DC-SIGN were found to be significantly associated with an increased susceptibility to HCMV. In addition, three SNPs (rs1554013, rs3921, rs4257674) in CXCL10 elevated the risk for the development of invasive aspergillosis. Screening of patients after alloSCT for the presence of these defined genetic polymorphisms may help to predict the individual risk to suffer from HCMV and A. fumigatus after alloSCT.

Inhalt: 1. Einleitung 2. Theoretische Grundlagen 2.1 Die Hamiltonfunktion binärer Legierungen 2.2 Statistische Mechanik binärer Legierungen 2.3 Röntgenstreuung 3. Experiment 3.1 Das System Ni-Pd 3.2 Ordnung in Ni-Pd Legierungen 3.3 Probenpräparation 3.4 Messmethode 3.5 Experimenteller Aufbau 3.6 Durchführung der Experimente 4. Auswertung 4.1 Normierung 4.2 Datenanalyse 4.3 Numerische Berechnung diffuser Streuung 4.4 Anpassung durch Simulated Annealing 4.5 Numerische Ergebnisse 5. Diskussion und Ausblick 5.1 Diskussion 5.2 Ausblick ------------------------------------------------ Zusammenfassung In dieser Arbeit wurde die diffuse Röntgenstreuung von Ni-Pd Legierungen untersucht und mit Hilfe theoretischer Modelle zur Beschreibung von kurzreichweitiger Ordnung (SRO) (engl.: Short-Range-Order) und Verzerrung in Legierungen analysiert. Die experimentellen Daten wurden mit der noch jungen Methode der monochromatischen Laue-Streuung in Transmissionsgeometrie, unter Verwendung von Hochenergie-Synchrotronstrahlung und Flächendetektoren (Bildplattendetektor oder CCD-Kamera), gewonnen. Als Proben standen, in der hauseigenen Abteilung für Kristallzucht gewonnene, Legierungseinkristalle der eutektischen Mischung Ni55Pd45 und der Konzentration Ni25Pd75 zur Verfügung. Die Experimente wurden während zweier Messzeiten am Hochenergiemessplatz ID15A an der European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble durchgeführt. Das System Ni-Pd bietet sich aufgrund verschiedener Eigenschaften als Modellsystem zur systematischen Untersuchung von SRO und Gitterverzerrungen in Legierungen an. Da Ni-Pd Legierungen im gesamten Konzentrationsbereich mischbar sind, eignen sie sich besonders zur Untersuchung von Konzentrationsabhängigkeiten. Die Differenz von ungefähr 10% in der Gitterkonstante lässt Effekte, aufgrund von Verzerrungen im Kristallgitter, erwarten. An ausgewählten Orten des reziproken Raumes wurde, für die beiden untersuchten Konzentrationen, der Temperatureinfluss auf SRO und Gitterverzerrungen untersucht. Die theoretische Beschreibung der diffus gestreuten Röntgenintensitäten erfolgte mit Hilfe des Spherical-Models und der, von V. Bugaev entwickelten, Ring-Approximation. Ausgehend von bereits vorhandenen Computer-Programmen wurde ein Algorithmus entwickelt, welcher es ermöglicht, unter Verwendung eines Simulated-Annealing Verfahrens, aus den Streudaten direkt interatomare Wechselwirkungsparameter zu bestimmen. Für die Legierungen Ni55Pd45 und Ni25Pd75 wurden hierzu erste Rechnungen durchgeführt. Die in der Röntgenstreuverteilung beobachteten charakteristischen Strukturen lassen sich damit direkt auf ihren physikalischen Ursprung zurückführen.