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Hintergrund/Problemstellung: Durch die in den letzten Jahren immer weiter zunehmende Antibiotikaresistenz muss nach Alternativen, zu den derzeit verwendeten Antibiotika, gesucht werden. Antibiotika wie Ciprofloxacin erhöhen die Mutationsrate bei Bakterien, was zur Antibiotikaresistenz beiträgt. Daher würde die Optimierung der Antibiotika im Hinblick auf ihre Auswirkungen auf die Mutationsrate mitwirken, die Entstehung von Antibiotikaresistenzen zu reduzieren. Ein möglicher Lösungsansatz wäre der Einsatz von ionischen Flüssigkeiten (ILs) in Verbindung mit herkömmlichen Antibiotika, welche die potenziellen Probleme dieser verbessern bzw. einen zusätzlichen Wirkmechanismus einbringen könnten. Die Auswirkung solcher sogenannten API-ILs auf die Mutationsrate von Bakterien ist jedoch noch unklar und wird in dieser Arbeit behandelt. Das Ziel ist es, durch den Einsatz von API-ILs die Mutationsrate von Ciprofloxacin beeinflussen zu können. Forschungsfragen: Wo liegt die minimale Hemmkonzentration von verschiedenen Ciprofloxacin-ILs Kombinationen gegenüber Ciprofloxacin? Inwiefern beeinflussen Ciprofloxacin-ILs die Mutationsrate von Escherichia coli? Methodik: Von einem E. coli Stamm MG1655 wurde die minimale Hemmkonzentration gegen das reine Antibiotikum Ciprofloxacin und fünf verschiedenen Kombinationen an Ciprofloxacin mit ILs, welche aus verschiedenen Strukturen bestehen und deren antimikrobielle Aktivitäten von niedrig bis hoch reichen, ermittelt. Ausgehend von dieser wurden Wachstumskurven angefertigt und der Anteil aktiver Zellen bei verschiedenen Konzentrationen analysiert, um die geeignete Konzentration der Substanzen für die Bestimmung der Mutationsrate zu finden. Die Mutationsrate wurde durch Ausplattieren und Auszählen des mit dem Antibiotikum bzw. dem Antibiotikum in Kombination mit den ILs behandelten E. coli auf Nativagar und auf Agarplatten, welche Rifampicin enthalten, durchgeführt. Die Auswertung der Mutationsrate erfolgte mittels FALCOR Onlinerechner. Ergebnisse: Die minimale Hemmkonzentrationen der Kombinationen liegen mit Werten im Bereich von 0,038 µg/ml bis 0,063 µg/ml leicht über jener von Ciprofloxacin, welche 0,016 µg/ml beträgt. Weder bei den durchgeführten Wachstumskurven noch bei der Analyse bezüglich des Anteils der aktiven Zellen zeigt sich eine vollständige Hemmung. Alle Kombinationen weisen eine erhöhte Mutationsrate im Gegensatz zu der Kontrolle ohne Antibiotikum und nach Behandlung mit Ciprofloxacin auf. Schlussfolgerung: Es konnte belegt werden, dass die Mutationsrate bei der Etablierung solcher API-ILs nicht außer Acht gelassen werden sollte. Die Vorstudie zeigt auf, dass durch die Auswahl des Kations der Faktor der Mutationsrate verändert werden kann. Background: Due to the raising number of antibiotic resistance alternative treatments need to be explored. Antibiotics, such as ciprofloxacin, increase the mutation rate in bacteria, which contributes to antibiotic resistance. Therefore, optimising antibiotics in terms of their effects on the mutation rate would help to reduce emergence of antibiotic resistance. A possible solution could be the use of ionic liquids (ILs) in combination with currently used antibiotics. Maybe these combinations could solve the problems or introduce an additional mechanism to the substances. However, the influence from such combinations on the mutation rate from bacteria is still unclear and will be addressed in this study. The goal is, to be able to influence the mutation rate using such ILs in combination with antibiotics. Research questions: What is the minimum inhibitory concentration of different ciprofloxacin-ILs combinations in comparison to ciprofloxacin? How do ciprofloxacin-ILs affect the mutation rate of Escherichia coli? Methods: The minimum inhibitory concentration of ciprofloxacin and five different ciprofloxacin-ILs combinations of different functional structures with a range antimicrobial activity from low to high against the E. coli strain MG1655 were tested. Based on these results growth curves and the proportion of active cells were identified to find the ideal concentration of the substances for the mutation rate analysis. For the mutation rate E. coli which was treated with ciprofloxacin or with the combinations, was plated on plain agar and agar which contained Rifampicin. After incubation the colonies were counted, and the mutation rate calculated. The evaluation of the mutation rate was performed using the FALCOR online calculator. Results: The minimum inhibitory concentration of the five different ciprofloxacin-ILscombinations are between 0,038 µg/ml and 0,063 µg/ml. These numbers are higher than the one from ciprofloxacin, which is 0,016 µg/ml. None of the growth curve shows a full inhibition of E. coli. Also, the results from the proportion of active cells show no full inactivation. All combinations show an increased mutation rate in contrast to the control without antibiotics and after the treatment with ciprofloxacin. Conclusion: It was shown that the mutation rate should not be ignored when establishing such API-ILs. This preliminary study shows that the selection of the cation is an important factor and can influence the mutation rate.

Diese Arbeit befasst sich mit den Auswirkungen ionischer Flüssigkeiten (ILs) auf die Resistenzentwicklung gegenüber das Antibiotikum Ciprofloxacin (CIP) bei Escherichia coli (E. coli). Dabei wurden fünf ILs mit CIP modifiziert, um aktive pharmazeutische Inhaltsstoffe-ILs (API-ILs) zu bilden und die unterschiedlichen Stärken der antimikrobiellen Eigenschaften der ILs zu verbessern. In diesem Fall ist CIP das Anion und die ILs sind das Kation der API-ILs. Zum einen soll herausgefunden werden, ob die fünf API-ILs die Resistenzentwicklung von E. coli MG1655 beeinflussen und falls dies der Fall ist, wie schnell dies geschehen kann. Zum anderen soll die minimale Hemmkonzentrationen vor und nach der experimentellen Evolution verglichen werden, um mögliche Resistenzentwicklung bei den verwendeten Wirkstoffen zu ermitteln. Die Resistenzentwicklung wurde anhand verschiedener Assays bestimmt. Methode: Die experimentelle Evolution stellt die Hauptmethode dieser Arbeit dar. Hier wurden die Bakterien sechs aufeinanderfolgenden Tagen in flüssigen Luria-Bertani-Medium (LB) mit den jeweiligen Wirkstoffen (CIP und API-ILs) in unterschiedlichen Konzentrationen passagiert. Um die Konzentrationen zu bestimmen, wurde die minimale Hemmkonzentration (MHK) vor der experimentellen Evolution bestimmt. Diese MHK wurde dann mit der nach der experimentellen Evolution bestimmten MHK verglichen. Anschließend wurde eine zweitägige Stabilitätspassage durchgeführt, um sicherzustellen, dass die während der experimentellen Evolution beobachteten Veränderungen stabil waren. Ergebnisse: CIP zeigte bei drei von fünf E. coli-Subkulturen erwartungsgemäß innerhalb einer kurzen Zeitspanne von vier Tagen Resistenzen. Hingegen dauerte es bei einigen Subkulturen, die mit API-ILs behandelt wurden, etwas länger, bis sie Resistenzen zeigten. Drei API-ILs, nämlich API-IL2, API-IL3 und API-IL4, wirkten stark antimikrobiell und hemmten bzw. unterdrückten das Wachstum von vier – von insgesamt fünf – Subkulturen. Die beiden anderen API-ILs (API-IL1 und API-IL5) waren in der Lage, auf zwei von fünf Subkulturen eine hemmende Wirkung auszuüben. Zudem wiesen die MHKs vor und nach der experimentellen Evolution Unterschiede auf, die die Entstehung einer Resistenz bestätigen. Conclusio: Diese Studie zeigt, dass die Resistenzentwicklung von Bakterien durch die Wahl des Kations in API-ILs beeinflusst werden kann. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Eigenschaften des Kations eine wichtige Rolle bei der Modulation der antimikrobiellen Aktivität von ILs spielen und somit auch die Resistenzentwicklung bei Bakterien beeinflussen können. Obwohl die vorliegende Studie erste Hinweise darauf liefert, dass die Struktur von ILs die Resistenzentwicklung bei Bakterien beeinflussen kann, sind weitere Untersuchungen erforderlich, um diese Ergebnisse zu bestätigen. Insbesondere müssen künftige Studien eine größere Anzahl von Proben und verschiedene Selektionsregime umfassen, um die statische Signifikanz dieser Beobachtung zu bestätigen. This thesis focuses on the effects of ionic liquids (ILs) on resistance development to the antibiotic ciprofloxacin (CIP) in Escherichia coli (E. coli). Thereby, five ILs were modified with CIP to form active pharmaceutical ingredient-ILs (API-ILs) and improve different levels of antimicrobial properties of the ILs. The anion of API-ILs was CIP, which was paired with different cations of ILs in the experiment. The first goal was to find out whether the five API-ILs affect the resistance development of E. coli MG1655 and to assess the rate at which this phenomenon occurs. The second goal was to compare the minimum inhibitory concentration (MIC) before and after experimental evolution, to determine possible resistance development with the APIs used. Resistance development was determined using different assays. Methods: Experimental evolution is the main method used in this work. The bacteria here were passaged for six consecutive days in Luria-Bertani (LB) medium, containing the respective agents (CIP and API-ILs) at different concentration. To determine the concentrations, the MIC was determined prior to experimental evolution. This MIC was then compared to the MIC determined after experimental evolution. A two-day stability passage was then performed to ensure that the changes, observed in E. coli during experimental evolution, were stable. Results: CIP showed resistance in three of five E. coli subcultures within a short period of four days, as expected. In contrast some subcultures treated with API-ILs have been observed to exhibit a slightly delayed outset of resistance. Three API-ILs, namely API-IL2, API-IL3, and API-IL4, had strong antimicrobial effects and inhibited or suppressed the growth of four – out of a total of five – subcultures. The other two API-ILs (API-IL1 and API-IL5) were able to exert an inhibitory effect on two of five subcultures. Moreover, the MICs before and after experimental evolution showed difference confirming the emergence of resistance. Conclusion: This study demonstrates that the development of resistance in bacteria can be influenced by the choice of cation in API-ILs. The results suggest that the properties of the cation play an important role in modeling the antimicrobial activity of ILs and thus may also influence the development of resistance in bacteria. Although the present study provides preliminary evidence that the structure of ILs may influence resistance development in bacteria, further studies are needed to confirm these results. In particular, future studies will need to include a larger number of samples and different selection regimes to confirm the static significance of this observation.

Das Vitek® 2 System ist ein automatisches System zur Resistenztestung und Identifikation von Bakterienspezies. Es handelt sich dabei um ein etabliertes System, welches in Laboratorien weltweit zum Einsatz kommt. Es gibt jedoch kaum Publikationen zur Resistenztestung am Vitek® 2 System unter Anwendung der EUCAST Interpretationsrichtlinien. Das Ziel dieser Studie war deshalb, die Richtigkeit und Präzision der, mit Hilfe des Vitek® 2 Systems ermittelten, minimalen Hemmkonzentrationen zu evaluieren. Zu diesem Zweck wurden die in Österreich für die Testung gramnegativer Spezies erhältlichen Vitek® 2 AST-Karten N195, N196 und N248 verwendet. Dazu wurden 32 gramnegative Isolate mittels Vitek® 2 auf ihr Resistenzverhalten bezüglich 17 unterschiedlicher Antibiotika untersucht. Die gemessenen MHK-Werte wurden mit den Ergebnissen aus Referenzlaboren verglichen. Die Präzision der Messwerte war sehr gut, da keiner mehr als eine Verdünnungsstufe vom gemessenen Medianwert der jeweiligen Messreihe abwich. Im Gegensatz dazu konnten bei der Richtigkeit der Ergebnisse, je nach Antibiotikum, teils erhebliche Differenzen festgestellt werden. Insgesamt wurden, je nach verwendeter Karte, Essential Agreements von 91,9% bis 93,4% und Categorical Agreements von 88,4% bis 92,3% erreicht. Die berechneten Fehlerraten betrugen durchschnittlich je Karte für Very Major Errors 0% bis 5,9%, für Major Errors 2,3% bis 4% und für Minor Errors 4,7% bis 8,7%. Bezieht man die berechneten Konfidenzintervalle für die einzelnen Antibiotika in die Auswertung mit ein, so war die Performance des Vitek® 2 im Allgemeinen akzeptabel. Die einzige Ausnahme bildet dabei Amoxicillin mit Clavulansäure. Bei diesem Antibiotikum traten bei einer Gesamtzahl von 15 resistenten Isolaten vier Very Major Errors auf. Dies entspricht einer Fehlerrate von 26,7% und ist damit zu hoch. Eine anschließend durchgeführte Vergleichstestung der Karte N195 mit der neuen, überarbeiteten Karte N387 zeigte für die neue Karte eine Reduktion der Very Major Errors um 50%. The Vitek® 2 system is an automated system that performs identification and antimicrobial susceptibility testing of bacteria. It is an established system and is used in laboratories around the world, but there are few publications regarding the use of the Vitek® 2 system for antimicrobial susceptibility testing while using the EUCAST breakpoints. The objective of this study was to evaluate the accuracy and precision of the minimum inhibitory concentrations obtained with the Vitek® 2 system. For this purpose the Vitek® 2 AST cards N195, N196 and N248, which are available for antimicrobial susceptibility testing of gram-negative species in Austria, were used. In this study the susceptibilities of 32 gram-negative bacterial isolates to 17 different antibiotics were tested, using the Vitek 2 system. The results were then compared to those obtained by reference laboratories. The precision of the obtained MIC values was quite good. None of them differed by more than one doubling dilution from the measured median of each series of measurements. Different from this, the accuracy of the Vitek® 2 system was quite variable, with accuracy varying strongly across the range of tested substances. Overall Essential Agreements between 91.9% and 93.4% and Categorical Agreements between 88.4% and 92.3% could be achieved, depending on the card that was used. The average calculated error rates ranged from 0% to 5.9% for very major errors, 2.3% to 4.0% for major errors and 4.7% to 8.7% for minor errors. When the calculated confidence intervals for all antibiotics are also taken into consideration, the overall performance of the Vitek® 2 in general was acceptable. The only exception to that point is the antibiotic amoxicillin with clavulanic acid. In this case out of 15 resistant isolates four very major errors occurred, resulting in a very major rate of 26.7%, which is far too high to be acceptable. In response to this the Vitek® 2 card AST-N195 was compared to the new card AST N-387, containing a reformulated version of the antibiotic. The substitution of the AST-N195 card with the new AST-N387 showed a 50% reduction in very major errors.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Empfindlichkeitsprüfung des Antibiotikums Vancomycin gegenüber der planktonischen Form und Biofilmzellen des Bakteriums Finegoldia magna. Finegoldia magna wurde bis zum Jahr 1999 als Peptostreptococcus magnus bezeichnet, bis es in eine neue Gattung mit einer einzigen Spezies umklassifiziert wurde. Das Bakterium gehört zu den anaeroben grampositiven Kokken und besiedelt physiologisch die Haut und die Mukosa des Gastrointestinaltraktes. Bei verwundeten oder immunsupprimierten Patient*innen kann es als opportunistischer Krankheitserreger eine Reihe von Infektionen verursachen. Besonders bei orthopädischen Patient*innen nach Fremdkörperimplantationen, vor allem bei Gelenksimplantaten, kann Finegoldia magna sogenannte periprothetische Infektionen verursachen. Solche Infektionen sind oft problematisch und lassen sich sehr schwer behandeln. Der Grund dafür könnte der von Finegoldia magna gebildete Biofilm sein. Ein Biofilm ist eine Lebensgemeinschaft von Mikroorganismen, die in einer Biofilmmatrix eingebettet sind. Die Biofilmmatrix besteht aus Wasser und extrazellulären polymeren Substanzen, wie Exopolysaccharide, Proteine oder extrazelluläre DNA. Bakterien innerhalb eines Biofilmes verändern ihre Lebensweise im Gegensatz zu ihrer planktonischen Form. Aufgrund der vielen Resistenzmechanismen eines Biofilmes, sind Bakterien innerhalb eines Biofilmes viel widerstandsfähiger gegenüber der Immunantwort des Wirtes und antimikrobieller Substanzen als planktonische Bakterien. Im Zuge dieser Arbeit erfolgt der Vergleich der minimalen Hemmkonzentration (MHK) des Antibiotikums Vancomycin gegenüber Finegoldia magna mittels Epsilometer-Tests und Mikrodilution. Die MHK der getesteten planktonischen Bakterien von Finegoldia magna lag zwischen 0,125-0,25 μg/mL. Außerdem wurde der verwendete Kristallviolett-Biofilm-Assay zur Bestimmung der Empfindlichkeit der Biofilmzellen von Finegoldia magna gegenüber Vancomycin etabliert. Bei der Etablierung des Kristallviolett-Biofilm-Assays wurde festgestellt, dass sich die Brucella-Bouillon besser als Nährmedium eignet, als die Brain Heart Infusion (BHI-Bouillon) und, dass bei einem McFarland von 1 der stärkste Biofilm gebildet wurde. Mittels der etablierten Methode sollte die MHK50 von Vancomycin gegenüber dem Biofilm von Finegoldia magna ermittelt werden, jedoch waren die Ergebnisse nicht zufriedenstellend. This thesis deals with the susceptibility testing of the antibiotic vancomycin against the planktonic cells and the biofilm cells of Finegoldia magna. Finegoldia magna was known as Peptostreptococcus magnus until 1999, when it was reclassified into a new genus with a single species. The bacterium belongs to the anaerobic gram-positive cocci and it colonizes the skin and the mucosa of the gastrointestinal tract. It can act as an opportunistic pathogen and cause infections in immunodeficient patients. Finegoldia magna can cause a lot of infections but is especially known for causing infections in orthopedic patients after a foreign body implant, especially joint implants. This kind of infection is called periprosthetic joint infection and they are very difficult to treat. A biofilm formed by Finegoldia magna is responsible for the problematic treatment. A biofilm is a living community of bacteria embedded in a biofilm matrix, which consists of water and extracellular polymeric substances, such as exopolysaccharides, proteins or extracellular DNA. Due to the resistance mechanisms of a biofilm, bacteria within a biofilm are much more resistant to the immune response of the host and antibiotics. Throughout the course of this work a comparison of the minimum inhibitory concentration (MIC) of the antibiotic vancomycin against the planktonic cells of Finegoldia magna carried out using the Epsilometer test and microdilution is performed. The MIC of the tested planktonic cells of Finegoldia magna was between 0,125-0,25 μg/mL. Furthermore, the method of the crystal violet biofilm assay was established to determine the susceptibility of the biofilm cells of Finegoldia magna against vancomycin. During the establishment of the crystal violet biofilm assay, it was found out that the brucella broth was more suitable as a culture media than the Brain Heart Infusion (BHI). Furthermore, it was determined that the strongest biofilm was formed at a McFarland standard 1. Using the established method, the MIC50 of vancomycin against Finegoldia magna was to be determined, but the results were not satisfactory.