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Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Fermentationsprozesses für die Produktion der Cytrochrom P450 Monooxygenase in Escherichia coli. Dieses Enzym findet Anwendung in der chemischen Industrie für die Herstellung bio-basierender Polymere. Es aktiviert O2-Moleküle und fügt ein Sauerstoffatom in das Substrat ein. Diese Eigenschaft macht die Produktion des Enzyms schwierig, da mit steigendem Sauerstoffeintrag auch die Enzymaktivität steigen könnte. Die Oxidationsreaktion kann den Metabolismus der Zelle schädigen und so zu niedrigeren Produktausbeuten führen. Daher war es wichtig den Einfluss des Sauerstoffeintrages auf den Prozess zu untersuchen. Als Stamm wurde der E. coli K-12 HMS174(DE3) verwendet, der ein pET Plasmid, auf dem die Monooxygenase sowie die dazugehörige Reduktase kodiert ist (pET28a_Cyp153-CPR_M.aq.), enthält. Zuerst wurde mit Schüttelkolbenversuchen der Einfluss der Temperatur untersucht, bei denen die Kultivierung bei 30 °C gegenüber 37 °C einen stabileren Biomasseverlauf zeigte. Anschließend erfolgten Fermentationen in einem Bioreaktor. In diesen Fermentationsversuchen wurde der Einfluss des Sauerstoffeintrages (10% pO2 vs. 30%), der Induktionsmethode (Puls(Voll)-induktion vs. Teilinduktion), der Induktionsstärke (0,5 µmol vs. 0,9 µmol IPTG * g-1 BTS), als auch der Einfluss der Fermentationsmethode (Standard Fedbatchprozess mit 40 g * L-1 BTS vs. Hochzelldichte-Fermentation (HCD) mit 100 g * L-1 BTS) auf die Produktbildung untersucht. Die gemessenen Parameter umfassten den Biomasseverlauf, Restsubstrat- und Nukleotidanalyse mittels HPLC, Kohlenstoffbilanzen sowie spezifische Sauerstoffaufnahme und Produktbildung. Da E. coli vor allem bei hoher Expressionsrate zur Bildung von Inclusion Bodies (IBs) neigt, wurde zusätzlich die Verteilung des Produktes in lösliche bzw. unlösliche Fraktion mittels Gelelektrophorese analysiert. Beim Vergleich des Einflusses verschiedener Belüftungsraten auf das Wachstum und die Produktbildung, zeigten sich nur geringe Unterschiede. Die Erhöhung der Induktionsstärke hatte einen schwachen Einfluss auf das Wachstum, brachte aber keine signifikante Produktsteigerung. Der Vergleich der Induktionsmethoden zeigte jedoch große Unterschiede in Hinsicht auf Wachstum und Produktivität. Die Fermentationen mit Teilinduktion bewiesen Stabilität und höhere Produktivität gegenüber der Fermentation mit Vollinduktion. Bei der Vollinduktion wurde durch die stärkere Induktion die Zelle dermaßen überlastet, dass es zu einem kompletten Einbruch des Wachstums kam. Auch der HCD Fermentationsprozess zeigte nur schwache Produktbildung verglichen mit dem Standard Fedbatchprozess und erwies sich daher als nicht wirtschaftlich. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Teilinduktionsprozess mit schwacher Induktion am besten für die Produktion der Monooxygenase mit diesem System geeignet war. The goal of this work was the design of a fermentation process for the production of cytochrome P450 monooxygenase in Escherichia coli. This enzyme is used for the production of bio-based polymers in chemical industry. It activates oxygen molecules and inserts one oxygen atom into a substrate. This behavior could influence the production of monooxygenases because the oxygen flux may also result in higher enzyme activity. Additionally, oxidation reactions driven by the monooxygenase activity may cause adverse effects on host metabolism, thereby resulting in lowered product yields. Hence, the influence of the aeration rate onto the process outcome was investigated. The selected expression host E. coli K-12 HMS174(DE3) contains a pET plasmid encoding the monooxygenase and the corresponding reductase (pET28a_Cyp153-CPR_M.aq.). In a first step the influence of the temperature on growth behavior was tested in shaking flask experiments and 30 °C turned out to be superior to 37 °C in terms of stability. Subsequently fermentations in a bioreactor were performed and the influence of oxygen saturation (10% pO2 vs. 30%), induction strength (0.5 µmol vs. 0.9 µmol IPTG * g-1 DM), the induction method (single-pulsed vs. limited), and the fermentation strategy (standard fed batch process with 40 g * L-1 DM vs. high cell density fermentation (HCD) with 100 g * L-1 DM) on process performance and product yield were investigated. The generated data include biomass formation, HPLC analysis of organic by-products and nucleotides, product formation, calculation of carbon balance as well as specific oxygen uptake rate. Additionally, the distribution of the soluble and insoluble product fractions were quantified by SDS-page as high-level expression often leads to inclusion body (IB) formation. The influence of different oxygen saturations on growth behavior and product yield showed only little diversities. The variation of the induction level showed also minor influence on cell growth and no influence on the product yield. The comparison of the induction method resulted in significant differences in cell growth and productivity. The fermentation processes with limited induction showed stable cell growth and higher product titers compared to the single-pulse induction. The full induction strategy led to extremely high gene expression rates which exceeded host physiology and consequently cell metabolism got overstrained and growth ceased. The HCD fermentation showed similar volumetric yields compared to the standard fed batch process and is therefore noncompetitive in terms of cost effectiveness. In summary, the fed batch process with limited induction and low induction strength proved to be the optimal setup for the production of the investigated monooxygenase system. vorgelegt von: Martin Schönlieb Masterarbeit Wien, FH Campus Wien 2012