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Das Torque Teno Virus (TTV) ist ein apathogenes Virus, das aus mehr als 30 Genotypen besteht und dessen Infektion asymptomatisch verläuft. In den letzten Jahren wird TTV als Marker für die funktionelle Immunkompetenz betrachtet, da beobachtet wurde, dass in der PCR-Diagnostik Gesunde eine niedrigere und Immunsupprimierte eine höhere TTV copy number (CN) aufweisen. Serologische Methoden sind aufgrund ihrer schlechten Sensitivität und komplizierte Umsetzung nicht so häufig in der Literatur vertreten wie die gängige PCR-Methode. Der Fokus dieser Arbeit liegt auf der Etablierung eines serologischen Multiplex-Assays, mit dessen Hilfe die Rolle der humoralen Komponenten IgG, IgM und die Aktivität des klassischen Pfades der Komplementaktivierung bei der Kontrolle von TTV im Menschen charakterisiert werden soll. Die Analyse von C4d und die Zusammenhanganalyse von C4d mit IgG und IgM mittels Regression sollen dabei Hinweise auf einen möglichen Komplementkomponentenverbrauch, während der virämischen Phase von TTV bei Immunsupprimierten geben. Dafür wurde pro magnetischer Mikrokügelchen-Sorte ein homologes TTV-Peptid -aus 18 verschiedenen Genotypen- immobilisiert und anschließend mit dem Luminex200 analysiert. Mit Seren von 34-Leber-transplantierten Patient*innen wurden IgG-, IgM- und Komplement-Assays zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach der Transplantation (und somit nach Beginn der damit verbundenen Immunsuppressionstherapie) durchgeführt. Bei der Untersuchung von IgG- und IgM-positiven Patient*innenanzahl vor (Prä-Transplantation [Tx]) und nach einer Tx (6 und 12 Monate) fiel auf, dass die Hälfte der anfänglich anti-TTV IgM-positiven Patienten nach 6 Monaten zu negativ konvertierten. Dies war allerdings, möglicherweise bedingt durch die nur mehr geringe Anzahl verbliebener Individuen in der Analyse, nur ein statistischer Trend. Bei der Analyse der positiven TTV-Peptide (bzw. Beads) pro Patient*in (vor und nach Tx) konnte man -ähnlich wie bei der Patient*innen-bezogenen- eine Abnahme der positiven IgM Beads pro Patient*in beobachten. Dieser ist für den Vergleich zwischen Prä-Tx und Monat 3 statistisch signifikant ausgefallen (statistischer Trend bei Vergleich 0 versus 6 Monate), während die IgG- und C4d -positiven Beads eher neutral bilanzierten. Grund dafür könnte eventuell die zusätzliche Induktionstherapie mit Antithymozytenglobulin (ATG) neben der Basis-Immunsuppressionstherapie sein, welche anfänglich vorhandene IgM-produzierende B-Zellen am immunologischen Klassenwechsel hindert. Wobei festgehalten werden muss, dass die Interpretation dieser Studienergebnisse ohne die Berücksichtigung von anderen wichtigen klinische Daten der Patienten wie beispielsweise genaues individuelles Immunsuppressionsschema, TTV PCR-Diagnostik, klinischer Zustand (Infektionen etc.) getätigt wurde. Bei der Analyse der medianen Fluoreszenzintensitäten (MFI) wurden ebenfalls abnehmende IgM-Reaktivitäten beobachtet. Hierbei sind die IgM-MFIs bis zum 6. Monat statistisch signifikant gesunken, haben sich aber bis zum 12. Monat wieder erholt. Dies steht ebenfalls im Einklang mit der nachlassenden ATG-Wirkung nach dem 6. Monat sowie einer möglichen Reduktion der Basisimmunsuppression in der 2. Jahreshälfte nach Transplantation. Bei der Analyse von IgG- und C4d-MFIs fällt ein leichter Anstieg der Signalstärke auf, der für die einzelne Vergleichszeitpunkte für IgG teilweise, für C4d zur Gänze signifikant ausfällt. Die Regressionsanalyse des C4d-Anstiegs belegt eine eindeutige Abhängigkeit von IgG MFI-Anstiegen. Als Ausblick auf die nahe Zukunft sollten die vorliegenden Resultate unter Einbeziehung der klinischen Daten betrachtet werden und funktionelle Komplement-Tests zur Bestimmung eines eventuellen Komplement-Verbrauchs angeschlossen werden. Torque Teno Virus (TTV) is an apathogenic virus consisting of more than 30 genotypes and its infection is asymptomatic. In recent years, TTV has been considered as a marker of functional immunocompetence, as it has been observed that in PCR diagnostics, healthy individuals have a lower and immunosuppressed individuals have a higher TTV copy number (CN). Serological methods are not as common in the literature as the common PCR method due to their poor sensitivity and complicated implementation. The focus of this study is to establish a multiplex serological assay to characterize the role of the humoral components IgG, IgM and the activity of the classical pathway of complement activation in the control of TTV in humans. In this regard, analysis of C4d and correlation analysis of C4d with IgG and IgM by regression should provide indications for possible complement component consumption during the viraemic phase of TTV in immunocompromised individuals. For this purpose, one homologous TTV-peptide from each of 18 different genotypes was immobilised per magnetic microsphere species and subsequently analysed by Luminex200. Sera from 34 liver-transplanted patients were used to perform IgG, IgM, and complement deposition assays at different time points before and after transplantation (and thus after initiation of the immunosuppressive therapy). When IgG- and IgM-positive patient numbers were examined before (pre-transplantation [Tx]) and after Tx (6 and 12 months), it was noticeable that half of the initially anti-TTV IgM-positive patients converted to negative after 6 months. However, this was only a statistical trend, possibly due to the small number of individuals remaining in the analysis. In the analysis of positive TTV peptides (or beads) per patient (pre- and post-Tx), a decrease in positive IgM beads per patient was observed, similar to the patient-related decrease. This is statistically significant for the comparison between pre-Tx and month 3 (statistical trend for comparison 0 versus 6 months), while the IgG- and C4d-positive beads balanced rather neutral. The reason for this could possibly be the additional induction therapy with antithymocyte globulin (ATG) besides the basic immunosuppression therapy, which prevents initially present IgM-producing B-cells from the immunoglobulin class switching. It should be noted that the interpretation of these study results was made without considering other important clinical data of the patients such as exact individual immunosuppression regimen, TTV PCR diagnostics, clinical condition (infections etc.). Decreasing IgM reactivities were also observed in the median fluorescence intensity (MFI) analysis. Here, IgM-MFIs decreased statistically significantly by month 6 but recovered by month 12. This is also consistent with the decreasing ATG effect after month 6 and a possible reduction in baseline immunosuppression in the 2nd half of the year after transplantation. When analysing IgG- and C4d-MFIs, a slight increase in signal strength is noticeable, which is partially significant for IgG and fully significant for C4d for the individual time points of comparison. The regression analysis of the C4d increase proves a clear dependence on IgG-MFI increases. As an outlook for the near future, the present results should be considered in the light of clinical data and functional complement tests should be added to determine possible complement consumption.

Gemeinsamer Beitrag in der Umweltzeitung zu biologischen Wegen der nachhaltigen Rückgewinnung von Selten Erd Elementen.

Die Tuberkulose ist die weltweit tödlichste bakterielle Infektionserkrankung. Sie fordert jährlich 1,6 Millionen Todesopfer. Dabei nehmen Infektionen mit antibiotika-resistenten Stämmen stetig zu. Ein neuartiges Konzept zur Therapie dieser Infektionen besteht in der Verwendung von endogenen Peptiden. Diese sollen Bakterien einerseits effektiv bekämpfen und zugleich eine Resistenzentwicklung verhindern. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob das endogene Protein Lysozym das Wachstum von Mycobacterium tuberculosis (Mtb) hemmt, ohne dabei neue Resistenzen zu induzieren. Dazu wurden zunächst die metabolische Aktivität und das kulturelle Wachstum von Mtb unter Einfluss von Lysozym gemessen. Zusätzlich wurde die Aktivität von Lysozym gegen einen Isoniazid-resistenten Mtb-Stamm und virulente nicht-tuberkulöse Mykobakterien ermittelt. In einem weiteren Schritt wurde die intrazelluläre Interaktion zwischen Mtb und Lysozym nach Infektion von Makrophagen mittels indirekter Immunfluoreszenz untersucht. Abschließend wurden zwei von Lysozym abgeleitete Peptide, die durch enzymatische Spaltung entstehen, auf ihre antimykobakterielle Aktivität getestet.

Jeder lebende Organismus wird durch Zellteilung aufgebaut. Basierend darauf können bestimmte Krankheiten auf die Störung jener zurückgeführt werden. Die Zelloberfläche, welche mit der Glycocalyx ummantelt ist, spielt dabei eine entscheidende Rolle. Aufgebaut aus verschiedenen Glycanen und Glycokonjugaten wie u. A. Glycoproteinen, dienen die Kohlenhydrat-Reste als Rezeptoren für andere Zellen und Mikroorganismen für zahlreiche intra- und interzelluläre Erkennungsprozesse. In der Diagnostik können diese Glycoproteine für die Erkennung von Krankheiten wie Alzheimer oder Krebs genutzt werden. Außerdem erstreckt sich das pharma-zeutische Forschungsgebiet von Glycokonjugaten und deren Mimetika auf die Entwicklung von neuen Impfstoffen, Antibiotika und zur Behandlung von Diabetes. Eine Isolierung und Qualifizierung aus biologischem Material ist trotz fortschrittlicher Analytik-Methoden erschwert, weshalb ein synthetischer Zugang von äußerster Wichtigkeit ist.In dieser Arbeit wird in vier Projekten die Synthese und Charakterisierung neuer N-Glycopeptide und Neoglycopeptide als potentielle Peptidmimetika vorgestellt, bei denen verschiedene Kohlenhydrat-Bausteine über natürliche und nicht-natürliche Glycosylierungsmuster an ein Tripeptid-Rückgrat gebunden werden. Hierbei wird über einen sowohl linearen wie konvergenten Ansatz die Durchführbarkeit eines generellen Syntheseschemas bewiesen, um eine Vielzahl möglicher Kohlenhydrat- und Aminosäure-Bausteine für zukünftige Untersuchungen nutzen zu können.

In dieser kumulativen Doktorarbeit wurde der sanfte Desorptionsmechanismus der clusterinduzierten Desorption/Ionisation (engl.: Desorption/Ionization induced by Neutral Clusters, DINeC) untersucht und in Kombination mit der Massenspektrometrie (MS) für die Analyse ioneninduzierter Fragmentierung von Oligopeptiden angewendet. Eine fragmentationsarme Desorption ist hierbei entscheidend, um die zu untersuchenden Fragmentationsprozesse nicht durch die Analyse zu verfälschen. Durch die in dieser Arbeit dargestellten Untersuchungen konnte ein enger Zusammenhang zwischen der ioneninduzierten Fragmentierung und den fundamentalen Wechselwirkungsprozessen zwischen den einfallenden Ionen und den untersuchten Molekülen hergestellt werden. In Bezug auf den Desorptionsmechanismus wurde mittels Molekulardynamik- Simulationen (MD-Simulationen) gezeigt, dass die clusterinduzierte Desorption auf einem Lösungsprozess des adsorbierten Moleküls im auftreffenden SO2-Cluster basiert. Die Desorption erfolgt dann in einem Fragment des zerspringenden Clusters. Für polare und geladene Moleküle ergibt sich aus dem Lösungsvorgang eine energetische Stabilisierung und damit eine Reduzierung der effektiven Energiebarriere für die Desorption. In der Folge kann die Desorption bei kleinen Energiedichten erfolgen und führt daher nicht zu Fragmentierung der Moleküle. Der Lösungsprozess selbst ist zusätzlich entropisch getrieben und wird durch die erhöhte Temperatur des Clusters bei der Kollision unterstützt, wodurch die clusterinduzierte Desorption auch für nicht-polare Moleküle anwendbar ist. Experimentell wurde dies für Polystyrol-Moleküle bestätigt. MD-Simulationen mit Polystyrol-Molekülen unterschiedlicher Kettenlängen zeigen weiterhin, dass die Größe isolierter Adsorbate auf der Oberfläche nur einen geringen Einfluss auf die Desorptionseffzienz hat. Insgesamt wird aus den Untersuchungen zum Desorptionsmechanismus deutlich, dass es sich um eine sanfte und zugleich vielseitig anwendbare Desorptionsmethode für die Massenspektrometrie handelt. Für die Untersuchung ioneninduzierter Fragmentierung wurden Oligopeptid-Proben mit Ionen in unterschiedlichen Energiebereichen bestrahlt und anschließend mittels DINeC-MS analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Bestrahlung mit Ionen mit keV-Bereich zu nicht-spezifischer Fragmentierung führt; Bindungsbrüche treten teilweise im Peptidrückgrat, hauptsächlich aber in den Seitenketten der Moleküle auf. Dies wurde auf den bei dieser Energie dominanten nuklearen Energieverlust der Ionen im Material zurückgeführt. Die Energie wird lokal in den atomaren Freiheitsgraden deponiert, was zum Bruch kovalenter Bindungen in der Nähe des Stoßes führt. Für Ionen im MeV-Bereich wurde überwiegend spezifische Fragmentierung des Peptid-Rückgrats beobachtet. In diesem Energiebereich werden zunächst nur die Elektronen des Materials angeregt. Diese Anregung verteilt sich über das Molekül und führt dann über die Kopplung mit dem atomaren System zu Molekülschwingungen und schließlich zur beobachteten spezifischen Fragmentierung.

Survivin ist ein Protein, das in den meisten Krebszellen überexpressioniert ist und deshalb ein interessantes Ziel für neuartige Therapiemöglichkeiten. Bis jetzt konnte noch keine Anti-Survivin-Therapie bis jetzt einen Mehrwert für Patienten in klinische Phase II Studien erbringen. Um neue Liganden für Survivin zu entwickeln, wurden Peptide, die auf den N-Terminus von Histon H3 basieren, mit dem bekannten Oxo-Anionenbinder Guanidiniocarbonylpyrrol modifiziert. Ihre Bindungseigenschaften zu Survivin mittels Isothermer Titrationskalorimetrie untersucht. Es wurde bewiesen, dass eine Histon H3 Sequenz, die auf fünf Aminosäure gekürzt wurde, eine nanomolare Affinität besitzt und somit um den Faktor 10 bis 100 mal stärker bindet als die bereits bekannte 12er Sequenz bei einem vergleichbaren pH-Wert. Zusätzlich reduzierte sich die Stöchiometrie von zwei Liganden pro Survivindimer auf ein Ligand pro Survivindimer. Bei einer anschließenden Modifikation mit Guanidiniocarbonylpyrrol konnte sowohl die Bindungsstärke als auch die Stöchiometrie erhalten bleiben., Survivin is a protein over expressed in most cancer-cells. This makes Survivin to an interesting target protein for new therapeutics. Up until now no anti-Survivin-therapy was proven to have any significant improvements for patients in clinical phase II studies. To generate new ligands for survivin, peptides based on the N-terminus of Histone H3 were modified with the known oxo-anion binder guanidinio-carbonyl-pyrrole. Their binding parameter to survivin were measured via isothermic titration calorimetry. It was proven, that a Histone H3 peptide shortened to five amino acids binds to Survivin with a nanomolar affinity. This is 10 to 100 times stronger as the known 12 amino acids long sequence at a comparable pH-value. Furthermore the stoichiometry of the binding was reduced from two ligands per survivin-dimer to one ligand per survivin-dimer. An additional modification with guanidinio-carbonyl-pyrrole was able to conserve the binding affinity and stoichiometry.

A root cause for the development and progression of primary open-angle glaucoma might be the loss of the Schlemm’s canal (SC) cell function due to an impaired Angiopoietin-1 (Angpt-1)/Tie2 signaling. Current therapeutic options fail to restore the SC cell function. We propose Angpt-1 mimetic nanoparticles (NPs) that are intended to bind in a multivalent manner to the Tie2 receptor for successful receptor activation. To this end, an Angpt-1 mimetic peptide was coupled to a poly(ethylene glycol)-poly(lactic acid) (PEG-PLA) block co-polymer. The modified polymer allowed for the fabrication of Angpt-1 mimetic NPs with a narrow size distribution (polydispersity index < 0.2) and the size of the NPs ranging from about 120 nm (100% ligand density) to about 100 nm (5% ligand density). NP interaction with endothelial cells (HUVECs, EA.hy926) as surrogate for SC cells and fibroblasts as control was investigated by flow cytometry and confocal microscopy. The NP–cell interaction strongly depended on the ligand density and size of NPs. The cellular response to the NPs was investigated by a Ca2+ mobilization assay as well as by a real-time RT-PCR and Western blot analysis of endothelial nitric oxide synthase (eNOS). NPs with a ligand density of 25% opposed VEGF-induced Ca2+ influx in HUVECs significantly which could possibly increase cell relaxation and thus aqueous humor drainage, whereas the expression and synthesis of eNOS was not significantly altered. Therefore, we suggest Angpt-1 mimetic NPs as a first step towards a causative therapy to recover the loss of SC cell function during glaucoma.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Aufklärung der korrelierten Dynamik verschiedener bioorganischer Systeme mit unterschiedlichen Zeitskalen, wobei sowohl synthetische als auch analytische und theoretische Methoden zum Einsatz kamen. Zunächst wurde die Charakteristik der Bewegung eines dimeren Tetradisulfid beschrieben. Zuvor durchgeführte experimentelle Studien postulierten eine gerichtete Scharnierbewegung der V-förmigen Struktur, die sich aus zwei β-hairpin-Motive zusammensetzt und als kodierbare Dimerisierungsdomäne verwendet wurde. NMR-Strukturberechnungen, gefolgt von MD-Simulationen erlaubten die initiale Erfassung der Gesamtdynamik. Die dominanten Bewegungen, das Öffnen und Schließen sowie die Verdrillung der β-hairpins wurden durch Hauptkomponentenanalyse identifiziert. Um das begrenzte sampling zu überwinden, wurden kollektive Variablen in Analogie zu den Hauptkomponenten ausgewählt, die anschließend in einer wt-Metadynamik zur Beschleunigung der Simulation eingesetzt wurden. Die daraus resultierende freie Energiefläche erlaubte die Identifikation eines Bewegungsmechanismus für das Scharnier-Peptid. Neben der Charakterisierung der Dynamik des isolierten Scharnier-Peptids, wurde dieses Strukturmotiv in einer Proteinumgebung, dem vier-Helix-Bündel betrachtet. Anschließend wurde die Dynamik des hydrophoben Kerns eines Zinkfingerpeptides durch eine Kombination aus experimentellen und theoretischen Methoden untersucht. Strukturberechnungen und MD-Simulationen enthüllten eine eingeschränkte Rotation des zentralen Phenylalanins um χ2, die dennoch die Ausbildung eines AA'BB'C-Spin-Systems im NMR-Spektrum erlaubt. Um die Orientierung des Phenyls im hydrophoben Kern präzise beschreiben zu können, wurden Tolyl/Xylyl-Derivate synthetisiert, die zum Symmetriebruch der Rotation führten. Dieses Methyl-Hüpfen um den aromatischen Ring zeigte, dass ε-Substitutionen zum Ausfrieren der Dynamik führten, während Modifikationen der δ-Position eine eingeschränkte Rotation erlaubten. Das Energieprofil konnte erneut durch Metadynamiken erhalten werden und steht in guter Übereinstimmung mit den experimentellen Ergebnissen. Abschließend wurde die Dynamik von β,β-Diaryl-α-Aminosäurehybriden untersucht. NMR-Spektroskopische Studien lieferten Hinweise für eine abhängige Rotation der Seitenketten, dem sogenannten gearing. Die Kombination aus MD-Simulation und Metadynamiken enthüllte zwar eine Erhöhung der Energiebarriere im Vergleich zu den entsprechenden natürlichen Aminosäurevorläufern, jedoch verhindert die geringe Verzahnung der aromatischen Ringe kontinuierliches gearing. Stattdessen konnte der Zahnradschlupf als dominierende Bewegungsform identifiziert werden. Auf der Basis von ab initio Berechnungen wurden Substitutionsmuster innerhalb der Seitenkette postuliert, die nicht nur eine adäquate Energiebarriere und Verzahnung für molekulares gearing besitzen, sondern auch synthetisch zugänglich wären. Die vorliegende Arbeit liefert entscheidende Beiträge zur Charakterisierung korrelierter Dynamiken von bioorganischen Systemen und erweitert somit die Grundlagen zum gezielten Designen von Strukturmotiven.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Generierung eines synthetischen Zugangs zu α-Aminosäurehybriden, die aus codierten α-Aminosäuren gebildet wurden. Ausgehend von Alanin wurde durch die dirigierte C–H Aktivierung die β-Position sequentiell modifiziert, sodass neben einigen weiteren Derivaten, Hybride aus Tryptophan und Phenylalanin dargestellt werden konnten. Mit Hilfe der NMR-Spektroskopie wurde gezeigt, dass durch die β-Disubstitution konformationell organisierte Aminosäuren erhalten wurden, die eine präsynthetische Planung der räumlichen Orientierung der Substituenten zulassen. Ferner wurden neue Konzepte erarbeitet, die die Abspaltung amidbasierter, dirigierender Gruppen erlaubten. Die so generierten, nicht-planaren Amide konnten in Transamidierungsreaktionen eingesetzt und durch kristallographische und computerchemische Methoden charakterisiert werden. Weiterhin wurde durch die Remodellierung der Amidgeometrie eine effiziente, C-terminale Modifikation der Aminosäurehybride erzielt. Es wurden die synthetischen Konzepte der C–H Aktivierung weiterentwickelt und die Chemie der amidbasierten, dirigierenden Gruppen überdacht, wodurch lagerbare Hybridaminosäuren in Gramm-Maßstäben für die automatisierte Synthese maßgeschneiderter Peptidhormone zugänglich gemacht wurden. So ist es gelungen, Sekundärstrukturen wie im Trp-cage, sowie biologische Wirkungen von ACTH- und kurzen Ghrelin-Peptiden, maßgeblich zu beeinflussen., This work covers the development of a synthetic access to α-amino acid hybrids composed of encoded α-amino acids. The sequential modification of the β-position of alanine using directed C–H activation mainly gave rise to hybrids of tryptophan and phenylalanin, among other derivatives. The anti-periplanar χ-space arrangement of the amino acid hybrids was defined through β-disubstitution, which allowed the pre-synthetic spacial planning of substituent orientation. Furthermore, new concepts were introduced to enable the mild and selective cleavage of amide-based, C-terminal directing groups. Using this new method, non-planar amides could successfully be used in unusual transamidation reactions and were characterized by crystallographic and in silico methods. Moreover, the altered amide geometry facilitated the C-terminal derivatization of the α- amino acid hybrids. In conclusion, the synthetic concepts of C–H activation were improved and the chemistry of amidebased directing groups was revisited to access gram-scale quantities of novel α-amino acid hybrids. These ready-to-use building blocks for automated peptide synthesis enabled the formation of tailored peptide hormones with distinct structural changes and unique biological profiles.

Bereits der Arzt und Forscher Paul Ehrlich stellte die These auf, dass das Immunsystem nicht nur Infektionen bekämpft, sondern auch gegen Krebs vorgehen kann. Über die möglichen positiven Auswirkungen einer simultanen Infektion auf den Verlauf einer Krebserkrankung wurde bereits im alten Ägypten ca. 2600 v. Chr. berichtet. Jedoch wurde erst ab den 1960er-Jahren klar, dass das Immunsystem Krebszellen gezielt bekämpfen kann, und erst ab den 1990er-Jahren wurde langsam aufgeklärt, wie dies vor sich geht. Vor diesem Hintergrund sollen deshalb die Bemühungen der letzten 30 Jahre hinsichtlich der Entwicklung therapeutischer Impfungen gegen Krebserkrankungen kurz zusammengefasst und deren bisherige Erfolglosigkeit beleuchtet werden. Außerdem werden in einem Ausblick zukünftige eventuell Erfolg versprechende Entwicklungen in diesem Kontext diskutiert. Dabei werden die verfügbare wissenschaftliche Literatur, aber auch eigene Ergebnisse berücksichtigt. Es ergeben sich ganz zentrale Fragen, etwa: Wie unterscheiden sich Krebszellen von normalen Zellen? Wie kann das Immunsystem diese Unterschiede erkennen? Was sind tumorspezifische Antigene? Warum müssen tumorspezifische Antigene in individueller Weise ausgesucht und angewendet werden? Wie induziert man eine effiziente Immunantwort? Welche pharmazeutischen Formulierungen, Adjuvanzien und Impfrouten sind effektiv? Letztlich stellen wir dar, warum es sich möglicherweise doch lohnt, die bisher völlig erfolglose Peptidimpfung (gemessen an bisher zugelassenen Therapeutika) weiterzuverfolgen.

Aktuell werden extraktbasierte Therapieallergene aus natürlichen Allergenquellen (z. B. Hausstaubmilben, Baum- und Gräserpollen) zur allergenspezifischen Immuntherapie (AIT) eingesetzt, dem einzigen kausalen Therapieansatz, der durch Toleranzentwicklung allergische Erkrankungen positiv verändern und langfristig eine Krankheitsprogression verhindern kann. Aufgrund von Schwankungen in der natürlichen Zusammensetzung der Ausgangsmaterialien und unterschiedlichen Herstellungsprozessen ergeben sich Varianzen in Proteingehalt, Allergenkomposition und allergener Aktivität gleichlautender Produkte, was spezifische Herausforderungen an ihre Standardisierung stellt. Die Aufklärung der Nukleotidsequenzen allergieauslösender Proteine führte zur Entwicklung molekularer AIT-Ansätze. Dies ermöglicht die Applikation von ausschließlich allergologisch relevanten Strukturen und schließt chemisch synthetisierte Peptide, rekombinante Einzelallergene und Therapiemoleküle mit hypoallergenen Eigenschaften ein, die potenziell eine Auftitration mit höheren Allergendosen ohne allergische Nebenwirkungen und schnelleres Erreichen der wirksamen kumulativen Dosis ermöglichen. Zudem lassen sich weitere Modifikationen der AIT-Ansätze zur Verbesserung der allergenen und immunogenen Eigenschaften, wie zum Beispiel durch Verwendung von Virus-like Particles (VLP), erreichen. Bis dato sind die hier beschriebenen AIT-Ansätze ausschließlich in der klinischen Erprobung. Dieser Artikel gibt eine Übersicht über die publizierten, in klinischen AIT-Studien eingesetzten molekularen Allergietherapeutika. Ihr Mehrwert sowie Herausforderungen gegenüber etablierten Therapieallergenen werden diskutiert. Ziel ist die Entwicklung hochwirksamer und verträglicher AIT-Präparate mit einer verbesserten Patientenakzeptanz und -adhärenz.

Die Nachfrage der Konsumenten nach frischen und natürlich behandelten Lebensmitteln sowie die hohen Anforderungen in der Lebensmittelsicherheit fordern neue und innovative Strategien zur Detektion und Eliminierung von Lebensmittelpathogenen. Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) zählt zu den häufigsten und gefährlichsten durch Lebensmittel übertragenen Pathogenen und ist der Verursacher von Listeriose, die trotz Antibiotika-behandlung eine Mortalitätsrate von bis zu 30 % aufweist. Derzeit verfügbare Methoden zur Listeria-Detektion sind kostspielig und zeitintensiv. Ziel dieser Arbeit war es, innovative Ansätze zu entwickeln, die zur Detektion des Bakteriums und zur Prävention der Listeria-Infektion beitragen sollen. Frühere Studien mit Antikörpern gegen L. monocytogenes lieferten eine unzureichende Selektivität und Spezifität. Die Verwendung spezifischer Peptide bietet hierbei eine Alternative und eignet sich besonders durch die hohe Stabilität und die kostengünstige standardisierte Produktion der Peptide. Hierfür wurde die Selektion L. monocytogenes-bindender Peptide erstmals mit einem Protein-basierten Phagen-Display durchgeführt. Bisher publizierte Peptide wurden unter Verwendung ganzer Zellen selektioniert, wodurch das Target der resultierenden Peptide unbekannt ist. In dieser Arbeit wurden Peptide aus 12 Aminosäuren identifiziert, die an L. monocytogenes-spezifische Oberflächenproteine Internalin A und Internalin B binden. Internalin A und Internalin B induzieren durch ihre Interaktion mit humanen Rezeptoren, E-Cadherin bzw. c-Met, die Invasion des Bakteriums in humane Wirtszellen und sind für den Infektionszyklus essenziell. Für die Selektion wurden zunächst rekombinante Proteine Internalin A(36-496) und Internalin B(36-321) gereinigt und ihre Bindung an den jeweiligen humanen Rezeptor verifiziert. Anschließend konnten in dieser Arbeit Internalin A-bindende Peptide mit den Aminosäuresequenzen GLHTSATNLYLH (JB1) und DSQFNKYSIATV (JB2) selektioniert werden. Ihre Bindung an sowohl rekombinantes Internalin A als auch an ganze Zellen L. monocytogenes wurde erfolgreich untersucht. Zudem konnte gezeigt werden, dass durch die Bindung von JB1 und JB2 an Internalin A die Interaktion zwischen Internalin A und E-Cadherin verhindert wird, wodurch die Internalisierung in epitheliale Wirtszellen verhindern werden könnte. Außerdem konnte erstmals gezeigt werden, dass Internalin A und Internalin B neben E-Cadherin bzw. c-Met mit dem humanen hepatischen Rezeptor IGF2R (insuline like growth factor 2 receptor) interagieren. Die Bindung des Bakteriums mit IGF2R ermöglicht die Invasion in Hepatozyten, der listeriale Interaktionspartner war bislang jedoch nicht bekannt. In einem weiteren Phagen-Display wurden die Peptide YSLRLTSVTAPT (JB6) und LTPHKHHKHLHA (JB8) gegen Internalin B selektioniert. Die Interaktion beider Peptide mit rekombinantem Internalin B und L. monocytogenes konnte erfolgreich gezeigt werden. JB8 wurde anschließend für die synthetische Kopplung an eine antimikrobiell wirkende Hopfenkomponente verwendet. Hopfenkomponenten aus der weiblichen Hopfenpflanze Humulus lupulus sind für ihre antimikrobielle Aktivität gegen grampositive Bakterien bekannt. Sie wirken als Ionophore und schädigen die bakterielle Zellmembran oder den Transmembran-Protonengradienten. Hopfenextrakte werden bereits in der Konservierung von Lebensmitteln eingesetzt, um das Wachstum von L. monocytogenes zu verhindern. Konzentrationsbedingte negative Geschmacksveränderungen sollen durch eine Verringerung der Dosierung vermieden werden. Durch die Verknüpfung der Hopfenkomponente mit einem Internalin B-bindenden Peptid sollte die Substanz gezielt an die Bakterienmembran lokalisiert und damit die anti-listeriale Wirkung verstärkt werden. Die Auswahl einer für die Verknüpfung geeigneten Hopfenkomponente sowie die Bestimmung optimaler Versuchsbedingungen erfolgten durch Messungen der minimalen Hemmkonzentration (MHK) dreier Substanzen: Hulupinsäure, Xanthohumol und Lupulon. Dabei wurde für Xanthohumol eine MHK von 2,5 µg/ml bei pH 6,0 und 30 °C ermittelt und diese Hopfenkomponente mit Peptid JB8 verknüpft. Xanthohumol und Lupulon erwiesen sich als weniger geeignet. Eine antimikrobielle Aktivität des Konjugats Xanthohumol-JB8 konnte zwar gezeigt werden, die postulierte Verringerung der MHK im Vergleich zu Xanthohumol konnte allerdings zunächst nicht erzielt werden. Allerdings sind hierbei viele Parameter, wie die Art der Verknüpfung, entscheidend und können weiterführend optimiert werden. Die erstmals gegen Oberflächenproteine von L. monocytogenes selektionierten Internalin A- und Internalin B-bindenden Peptide JB1, JB2, JB6 und JB8 liefern jedoch einen entscheidenden Beitrag für die Entwicklung neuer Detektionsmethoden von L. monocytogenes sowie zur Verhinderung des pathogenen Mechanismus. Markierungen der spezifischen Peptide mit beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffen könnten eine schnelle Detektion des Bakteriums in humanen Zellen oder Lebensmittelproben ermöglichen. Zusätzlich könnten diese spezifischen Peptide zur Inhibition der Interaktion zwischen den Internalinen und den humanen Rezeptoren verwendet werden, um den Eintritt des Pathogens in Wirtszellen zu verhindern.

Das wesentliche Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, hochaffine Peptide zur Bindung des Lanthanoides Europium zu selektieren, zu identifizieren und hinsichtlich ihrer Affinität zu charakterisieren. Die Elemente der Seltenen Erden (REE) sind aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften von enormer Wichtigkeit in Zeiten der modernen Technologie. Die Selektion von Peptid-Biosorbenzien mit hoher REE-Affinität würde den ersten Schritt bilden, um die Herstellung von sogenannten Biokollektoren zu verwirklichen. Diese sollen zukünftig für das Recycling von Seltenen Erdmetallen wie Europium aus Elektroschrott oder für deren Extraktion aus primären Rohstoffgemischen angewendet werden. Für die Realisierung dieser Zielstellung kam zunächst die Technik des Phage Surface Display zum Einsatz, mit dessen Hilfe gut bindende Phagenvarianten über mehrere Runden einer Affinitätsselektion angereichert und schließlich mittels Sanger-Sequenzierung identifiziert wurden. Die ermittelten Peptidsequenzmotive wurden in einem kompetitiven Bindeversuch weiter reduziert und die daraus resultierten besten Binder in Einzelbindeversuchen sowie in der zeitaufgelösten Laser-induzierten Fluoreszenz-spektroskopie (TRLFS) auf ihre Bindungsaffinität für Europium-Ionen hin untersucht. Die EF-Hand 4 des Calmodulins diente als Modellsystem zur Bestimmung der Bindungsparameter unter Verwendung der TRLFS sowie der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC). Die am stärksten gebundenen Peptidmotive sind durch eine hohe Anzahl an basischen Aminosäuren (AS), insbesondere Histidin, wie auch durch eine vergleichsweise hohe Anzahl an hydrophoben Resten und einen relativ geringen Anteil an sauren AS charakterisiert. Die Histidine deuteten aufgrund der freien Elektronenpaare ihrer Stickstoffatome auf eine vielversprechende Europium-Komplexierung hin. In der TRLFS stellte sich jedoch heraus, dass keines der sechs ausgewählten und synthetisierten Peptide die Europium-Ionen komplexiert. Auch in den Einzelbindeversuchen zeigte keiner der selektierten Phageneinzelklone eine gegenüber dem Phagenwildtyp verbesserte Bindung an die Zielmoleküle. Mögliche Gründe dafür werden diskutiert und sollen in fortführenden Versuchen überprüft werden. Die TRLFS- sowie ITC-basierten Modelluntersuchungen der EF-Hand 4 des Calmodulins ergaben zwei Komplexspezies mit einer 1:1- und einer 1:2-Stöchiometrie. Es wurde die Parallele Faktoranalyse angewandt, um die Einzelkomponenten aus den experimentellen TRLFS-Spektren zu extrahieren und ihre Bindungsaffinität zu bestimmen. Anhand der ermittelten Dissoziationskonstanten von 5,66*10-6 M bzw. 1,00*10-4 M für den 1:1- bzw. 1:2-Eu(III)-EF-Hand-4-Komplex konnte eine hohe Affinität der EF-Hand 4 für Europium-Ionen nachgewiesen werden. Dies steht grundsätzlich in Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Komplexbildungsstudie zum Calmodulin (Drobot et al. 2019). Eine Ausnahme bildet jedoch der 1:2-Eu(III)-EF-Hand-4-Komplex, da er in dieser Form nicht im nativen Calmodulin-Protein vorkommt. Die wesentliche Fragestellung, ob es Peptidmotive gibt, die noch besser an Europium-Ionen binden als die EF-Hände des Calmodulins, kann in der vorliegenden Arbeit nicht beantwortet werden. Aufgrund dessen sollte zukünftig das Peptidmotiv der EF-Hand 4 modifiziert und weiter optimiert werden, um eine noch höhere Europium-Affinität zu erhalten und somit dem Anwendungsziel, dem Recycling oder der Extraktion von Europium aus Elektroschrott bzw. primären Rohstoffquellen, einen Schritt näher zu kommen.

In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurden die kardialen Effekte des C-Typ natriuretischen Peptids (CNP) an wildtypischen Mäusen (Studie 1) und an einem neuen genetischen Mausmodell, mit einer Kardiomyozyten-spezifischen Deletion des Guanylyl-Cyclase B (GC-B) Rezeptors (Studie 2) untersucht. In Studie 1 wurden die Wirkungen von exogenem, synthetischem CNP auf eine durch Druckbelastung-induzierte Herzinsuffizienz in wildtypischen Mäusen (C57Bl6 Hintergrund) untersucht. Dafür wurde CNP parallel zu einer operativen transversen Aortenkonstriktion (TAC) über osmotische Minipumpen in einer Dosierung von 50 ng/kg/min über 14 Tage appliziert. Die 14 Tage TAC führten zu einer ausgeprägten Linksherzhypertrophie. Diese wurde durch exogenes CNP auf zellulärer (verringerte Kardiomyozytenflächen) und molekularer (verringerte BNP mRNA Expression) Ebene signifikant gehemmt. Auch die durch TAC-induzierte linksventrikuläre Dilatation wurde durch exogenes CNP fast vollständig verhindert. Diese kardialen protektiven Effekte von CNP traten ohne eine wesentliche Veränderung des arteriellen Blutdrucks auf. Mögliche mechanistische Ursachen für die schützende Wirkung von CNP könnte die PKG-abhängige Phosphorylierung des sarkomerischen Proteins Titin sein. Eine gesteigerte Phosphorylierung von Titin an der elastischen N2B-Domäne verringert die Steifigkeit der Kardiomyozyten und verbessert somit deren Relaxationsfähigkeit (Hudson 2011). Die erhöhten linksventrikulären Volumina nach TAC (end-diastolische und end-systolische Volumina) wurden möglicherweise durch eine erhöhte Steifigkeit der Kardiomyozyten provoziert. Dies könnte durch den akuten IL-6 mRNA Anstieg nach TAC begünstigt werden, da Kruger et al. einen Zusammenhang zwischen passiver Steifigkeit der Kardiomyozyten und IL-6-Expression postulierten (Kotter 2016, Kruger 2009). Diese Veränderungen wurden durch exogenes CNP verhindert. Es ist wahrscheinlich, dass die CNP-induzierte Phosphorylierung von Titin an Serin 4080 in die Relaxationsfähigkeit der Kardiomyozyten und somit die diastolische Funktion des linken Ventrikels verbesserte. Aufgrund dieser Beobachtungen wurde in Studie 2 untersucht, ob auch endogenes CNP als parakrines Hormon im Herzen eine TAC-induzierte Herzhypertrophie und die kontraktile Funktion von Kardiomyozyten bei einer hypertensiven Herzerkrankung beeinflussen kann. Dafür wurde ein neues genetisches Mausmodell mit einer Kardiomyozyten-spezifischen Deletion des GC-B Rezeptors generiert (CM GC-B KO). Da vorangegangene Studien in unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass die basale CNP-Expression im Herzen sehr gering ist, nach 3-tägiger TAC aber akut ansteigt und nach 14-tägiger TAC wieder abfällt, haben wir CM GC-B KO Mäuse und deren Geschwister-Kontrolltiere an beiden Zeitpunkten nach TAC untersucht. Die TAC führte Genotyp-unabhängig zu einem Anstieg der kardialen Nachlast nach 3 Tagen und weiter nach 14 Tagen. Diese Druckbelastung provozierte eine progressive, signifikante Linksherzhypertrophie. Allerdings reagierten die CM GC-B KO Mäuse im Vergleich zu den Kontrolltieren bereits nach 3-tägiger TAC mit einer ausgeprägten Kardiomyozyten-Hypertrophie. Zudem beobachteten wir nach 3-tägiger TAC in den Knockout-Mäusen eine Abnahme der Ejektionsfraktion und gleichzeitig eine signifikante Zunahme der beiden linksventrikulären Volumina (end-diastolische und end-systolische Volumen). Diese frühe linksventrikuläre Dilatation wurde in den Kontrolltieren nicht beobachtet. Daraus schlussfolgerten wir, dass endogenes kardiales CNP, dessen Expression zu frühen Zeitpunkten nach Druckbelastung ansteigt, das Herz vor kontraktiler Dysfunktion und Dilatation schützen kann. Um mögliche Mechanismen für die protektive Wirkung von endogenem CNP zu erklären, untersuchten wir die IL-6 mRNA Expression sowie die Titin-Phosphorylierung im Herzen. Der akute Anstieg der IL-6 mRNA Expression nach 3-tägiger TAC in den CM GC-B KO Mäusen korreliert mit der verminderten Phosphorylierung von Titin an der PGK-spezifischen Phosphorylierungsstelle (Serin 4080). Somit könnte der CNP/GC-B/cGMP-Signalweg zu einer Inhibition pro-inflammatorischer Gene beitragen, da der akute IL-6 mRNA Anstieg in den Kontrollen nicht beobachtet wurde. Auch die gesteigerte NOX4 Expression 3 Tage nach TAC, könnte zu der frühen dilatativen Kardiomyopathie in den Knockout-Mäusen beigetragen haben. Die verringerte STAT3 Aktivierung in den CM GC-B KO Mäusen würde laut Literatur zu vermehrter Apoptose führen, indem pro-apoptotische Gene wie Bcl oder Bax vermehrt transkribiert werden. Auch die erhöhte Cxcl-1 mRNA Expression in den Knockout-Mäusen deutet zusammen mit dem IL-6 Anstieg auf vermehrte Entzündungsreaktionen 3 Tage nach TAC hin. Zusammengenommen deuten die Ergebnisse dieser Dissertationsarbeit darauf hin, dass der CNP/GC-B/cGMP-Signalweg in frühen Stadien einer erhöhten kardialen Druckbelastung und der Entstehung einer dilatativen Kardiomyopathie entgegenwirken kann. Die Phosphorylierung des sarkomerischen Proteins Titin und die Hemmung der Expression pro-inflammatorischer Zytokine (speziell IL-6) könnten zu diesem protektiven Effekt beitragen., Here we investigated cardiac effects of c-type natriuretic peptide (CNP) in wildtype mice (study 1) and in a newly generated mouse model with cardiomyocyte-specific deletion of the guanylyl cyclase B (GC-B) receptor (study 2). In study 1 the effects of exogenous, synthetic CNP were investigated in wildtype mice (C57Bl6 background) after heart failure induced by pressure overload. Therefore, additionally to transverse aortic constriction (TAC) CNP (50 ng/kg/min) was administered via osmotic minipumps for 14 days. TAC provoked progressive heart hypertrophy. The TAC-induced hypertrophy was accompanied by enlarged cardiomyocyte areas and increased left ventricular mRNA levels of BNP. CNP significantly reduced cardiomyocyte areas and mRNA levels of BNP. Also, the TAC-induced left ventricular dilatation was almost prevented through synthetic CNP. These cardiac protective effects of CNP were accompanied by increased phosphorylation of the sarcomeric protein titin. Titin plays a critical role in maintaining the sarcomere structure and elasticity and thereby influences myocyte contraction and especially relaxation. The left ventricular end-diastolic and end-systolic volumes were significantly increased after TAC. The increased left-ventricular (end-diastolic and end-systolic) volumes after TAC are maybe provoked by an increased cardiomyocyte stiffness. The acute rise in IL-6 mRNA levels after TAC may favour these change, since Kruger et al postulate a relationship between passive cardiomyocyte stiffness and IL-6 expression. These changes were prevented by exogeneous CNP. Presumably, the CNP induced phosphorylation of titin on Serin 4080 within its elastic domain improves the cardiomyocyte relaxation and therefore the left-ventricular diastolic function. Because of these observations, we investigated in study 2, whether endogenous CNP as a paracrine hormone can affect TAC-induced hypertrophy and contractile function of cardiomyocytes. Therefore, we generated a new genetic mouse model with a cardiomyocyte specific deletion of the GC-B receptor (CM GC-B KO). Since previous studies in our group demonstrated that cardiac baseline expression levels of CNP are very low, but they markedly increased 3 days after TAC and decline to baseline levels 14 days after TAC, CM GC-B KO mice and control littermates were investigated at both timepoints after TAC. TAC resulted in increased cardiac afterload after 3 days, and more after 2 weeks, which was similar in both genotypes. Pressure overload provoked a progressive and significant cardiac hypertrophy, shown by the increased heart weight/body weight ratios, and were confirmed by histology. More severe myocyte hypertrophy was shown 3 days after TAC in CM GC-B KO mice, compared with control mice. Left ventricular contractile functions were also investigated by invasive catheterization in anesthetized mice. Notably, while in control mice subjected to TAC the LV ejection fraction was only mildly decreased, the KO mice reacted with a very marked and early decrease of the ejection fraction at three days after TAC, which tend to improve later on. Even more, the left ventricular end-diastolic and end-systolic volumes were markedly increased in the KO mice 3 days after TAC, indicating left ventricular dilatation. Again, this acute dilatation seems to reverse or improve at later stages. Such changes were not observed in control mice. To clarify possible downstream signalling pathways mediating these protective effects of CNP, we investigated titin-phosphorylation and IL-6 expression after 3 days of TAC. The acute increased IL-6 mRNA expression correlates well with the diminished phosphorylation of titin (serin 4080) in CM GC-B KO mice. Also, the increased NOX4 expression 3 days after TAC, could be one of the reasons of the early dilatation in KO mice. The diminished phosphorylation of STAT3 in CM GC-B KO mice may induce apoptosis by transcription of Bcl or Bax genes. Also, the increased mRNA expression of Cxcl-1 and IL-6 after 3 days of TAC can lead to more inflammation the hearts of the KO mice. In summary, these results show, that the CNP/GC-B/cGMP pathway can prevent cardiac dilatation in early stages. The phosphorylation of titin and the inhibition of the pro-inflammatory cytokines can contribute to this protective effects of CNP in the heart.

Ziel der vorliegenden Dissertation war es, spezifische Peptidsequenzen hinsichtlich ihrer Immunogenität bei Patienten mit Multiplem Myelom zu untersuchen. Hierzu wurden die aus Mutationen der Protoonkogene n-ras und c-kit abgeleiteten Epitope N-RAS 12, N-RAS 13, N-RAS 61 und C-KIT bei 24 Patienten mit Multiplem Myelom und 13 gesunden Probanden hinsichtlich ihrer Immunogenität untersucht und verglichen. Als Marker einer erfolgreichen Proliferation zytotoxischer T-Zellen und deren spezifischer Aktivität wurde mittels Enzyme Linked Immuno Spot (ELISPOT)-Assay die Sekretion von Interferon ɤ und Granzyme B erfasst. Es konnte gezeigt werden, dass die untersuchten Peptidsequenzen bei Patienten mit Multiplem Myelom keine erhöhte Immunogenität aufweisen, und sich daher nicht für eine tumorimmunologische Therapiestrategie, wie beispielsweise eine Peptidvakzinierung, eignen.

Die medizinische Anwendung mesoporöser Silikapartikel für Therapien und diagnostische Verfahren werden seit dem Beginn des Jahrhunderts intensiv erforscht. Aufgrund der Vielfalt möglicher Partikelgrößen und -morphologien, Porengrößen und verschiedener Oberflächenfunktionalisierungen können sie gezielt an biologische und medizinische Fragestellungen angepasst werden. In der vorliegenden Arbeit werden die Entwicklung neuer Synthesen von hohlen mesoporösen Silikapartikeln und die Anwendung von mesoporösen Silikapartikeln als Träger für Wirkstoffe in der Therapie gegen Tuberkulose und für Kontrastmittel in der Magnetresonanztomographie vorgestellt.

Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Anbindung von Aminosäuren sowie Peptiden an Organozinnsulfidcluster über zwei verschiedene synthetische Ansätze untersucht. Ziel sollte es sein, die Löslichkeit dieser Cluster zu erhöhen und eine bessere Stabilität gegenüber Luftsauerstoff und Wasser zu erreichen. Der erste Ansatz stellte eine neuartige Syntheseroute zur Darstellung von organisch funktionalisierten Zinnsulfidclustern dar.Bisherige Arbeiten beschrieben die Synthese eines ketofunktionalisierten Clusters, welcher im Nachhinein organisch mit einer Hydrazidverbindung funktionalisiert wurde. Da das bei der Funktionalisierung entstehende Wasser unter Umständen zur Zersetzung des Clusters führt, wurde hier das weniger sensible Organozinntrichlorid funktionalisiert. Die Reaktionen wurden mit verschiedenen unpolaren (L-Alanin, L-Valin, L-Leucin, L-Phenylalanin und L-Methionin) sowie polaren (L-Tyrosin und L-Serin) und basischen (L-Histidin) Aminosäuren durchgeführt. Um eine intramolekulare Kondensationsreaktion zu verhindern, wurde zusätzlich das Amin der Aminosäure durch eine Boc-Schutzgruppe geschützt, welche mit Trifluoressigsäure zumindest teilweise entschützt werden konnte. Die Umsetzung der funktionalisierten Organozinntrichloride mit Bistrimethylsilylsulfid führte zur Bildung von Organozinnsulfidclustern mit defektheterokobanartiger Struktur. Dies konnte über 1H-NMR-, 13C-NMR- sowie 119Sn-NMR-Spektroskopie und ESI(+)-Massenspektrometrie nachgewiesen werden. Durch Umsetzung des Organozinntrichlorids mit Natriumsulfid konnte der doppeldeckerartige Cluster synthetisiert werden. Eine Abgrenzung zum defektheterokubanartigen Cluster konnte über 119Sn-NMR-Spektroskopie getroffen werden, da 1H-NMR- und 13C-NMR-Spektroskopie sowie ESI(+)-Massenspektrometrie in dieser Hinsicht keine aussagekräftigen Ergebnisse lieferten. Es wurde zudem die Hydrolyse von keto- und phenylalaninfunktionalisierten Zinnsulfidclustern unter sauren Bedingungen untersucht. Durch Zugabe von Salzsäure im Überschuss konnte das Organozinntrichlorid unter Freisetzung von H2S ohne Nebenprodukte zurückgebildet werden. Dies wurde über 1H-NMR-Spektroskopie sowie massenspektrometrisch bewiesen. Die Verwendung von Bromwasserstoffsäure führte laut ESI(–)-Massenspektrometrie zu einem Gemisch aus chlorid- (X) und bromidsubstituierten (Y) Organozinnverbindungen (RSnX3-nYn). Bei Umsetzung mit Schwefelsäure kommt es zur Zersetzung des Clusters unter Bildung von Polysulfiden und Zinnsulfid. Zugabe von Essigsäure oder Ammoniumchlorid führt laut ESI(+)-Massenspektrometrie sowie 1H-NMR-Spektroskopie nicht zur Zersetzung des Clusters, auch wenn im Fall von Essigsäure ein Überschuss zum Ausfall eines schwarzen, nicht charakterisierten Niederschlags führt. Für den zweiten Ansatz zur Anbindung von Biomolekülen wurde von Jan-Philipp Berndt (Arbeitskreis Schreiner) ein Adamantylazidhydrazid synthetisiert, das erfolgreich an den defektheterokubanartigen Organozinnsulfidcluster angebunden werden konnte. Die weitere Umsetzung dieses funktionalisierten Clusters an der terminalen Azid-Funktion über „Click-Chemie“ mit einem Alkin führte ebenfalls zum gewünschten Produkt. Lediglich im Fall der Reaktion mit einem unsymmetrisch aufgebauten Alkin, welches eine terminale Amin-Funktion trägt, konnte eine Nebenreaktion beobachtet werden. Hier kam es zu einem Ringschluss, wodurch zwei Zinnatome des Organozinnsulfidclusters über den organischen Substituenten intramolekular verbrückt wurden. Diese Struktur eröffnet die Möglichkeit einer selektiven Funktionalisierung an der Peripherie eines organischen Substituenten. Durch das Anbringen von Tripeptiden durch Jan-Philipp Berndt an das unsymmetrisch aufgebaute, wie auch ein weiteres symmetrisch aufgebautes Alkin konnten größere Biomoleküle an den Cluster angebunden werden. Es kam zur gewünschten dreifach substituierten Zielverbindung. Im Fall der Reaktion mit dem symmetrisch aufgebauten Alkin konnte das Produkt über ESI(+)-Massenspektrometrie sowie 13C-NMR- und 119Sn-NMR-Spektroskopie charakterisiert werden. Durch diese Arbeit wurde ein Grundstein zur Anbindung von großen Biomolekülen an Organozinnsulfidcluster gelegt, wodurch die Löslichkeit dieser Cluster in polaren und donierenden Lösungsmitteln wie Dimethylformamid, Methanol und Acetonitril deutlich verbessert werden konnte. Dies könnte bis hin zur potentiellen biologischen Anwendung ausgebaut werden., Within the framework of this doctoral thesis, the attachment of amino acids and peptides to the surface of organotin sulfide clusters were investigated via two different synthetic approaches. The main goal was to improve clusters’ solubility and stability against air and moisture. The first approach followed a novel strategy for the synthesis of organo-functionalized tin sulfide clusters. Up to date, keto-functionalized clusters were prepared and post-functionalized with organic substituents. The presence of water, which arises during this functionalization, decomposition of the clusters took place in some cases. Therefore, is was decided to functionalize the less sensitive organotintrichloride reactant. This was realized with non-polar (L-alanine, L-valine, L-leucine, L-phenylalanine und L-methionine) as well as polar (L-tyrosine und L-serine) and basic (L-histidine) amino acids. To avoid an intramolecular condensation reaction, the amino group of the amino acid was protected with a boc protection group. Later on, we were also able to partially cleave this protection group off the ligands by addition of trifluoroacetic acid. The reaction of the functionalized organotintrichlorides with bistrimethylsilylsulfide led to the formation of defect-heterocubane-type organotin sulfide clusters. This was proven by 1H-NMR, 13C-NMR and 119Sn-NMR spectroscopy, and ESI(+) mass spectrometry. Reactions of the organotintrichlorides with sodium sulfide yielded the related “doppeldecker”-type clusters. Discrimination from the defect-heterocubane-type cluster was allowed by 119Sn-NMR spectroscopy, whereas 1H-NMR and 13C-NMR spectroscopy as well as ESI(+) mass spectrometry showed no significant differences. Moreover, the hydrolysis of keto- and phenylalanine-functionalized organotin sulfide clusters was investigated under acid conditions. Upon addition of hydrochloric acid, the organotintrichloride was re-constituted under the release of H2S without any further side products. This was demonstrated by means of 1H-NMR spectroscopy and mass spectrometry. The use of hydrobromic acid led to a mixture of chloride (X) and bromide substituted (Y) organotin compounds (RSnX3-nYn), as shown by ESI(–) mass spectrometry. Reaction with sulfuric acid caused complete decomposition of the clusters under formation of polysulfides and tin sulfide. The addition of acetic acid as well as ammonium chloride did not lead to decomposition of the clusters according to ESI(+) mass spectrometry and 1H-NMR spectroscopy. In the presence of an excess of acetic acid, a black solid precipitated, which was not further investigated due to low solubility. The second approach addressed the attachment of biomolecules. It was realized in cooperation with Jan-Philipp Berndt (Schreiner group). Jan-Philipp Berndt synthesized an adamantylazide moiety, which we were able to attach to the surface of organotin sulfide clusters. Subsequent reactions of the terminal azide group of the functionalized cluster with an alkyne via “click-chemistry” led to the desired product. In the case of an unsymmetrical alkyne containing a terminal amine function, a side reaction took place. By ring-closing during an intramolecular condensation reaction, two tin atoms were linked via an organic substituent. However, this structure may allow selective functionalization at one organic substituent. Through the attachment of tripeptides (by Jan-Philipp Berndt) at the side chain of the unsymmetrical and at another, symmetrical, alkyne, larger biomolecules were attached to the tin sulfide cluster. The target product was a threefold-substituted compound, which we were able to detect. For reactions with the symmetrical alkyne, the product could be characterized by means of ESI(+) mass spectrometry and 13C-NMR and 119Sn-NMR spectroscopy. This work showcased the attachment of large biomolecules to the surface of organotin sulfide clusters. This way, the clusters’ solubility in polar and donor solvents like dimethylformamide, methanol and acetonitrile, was improved considerably. This may be the base for potential biological applications in the future.

Natural collagen is a posttranslational highly modified Scleroprotein. The influece of specific modification on the triplehelical structure was investigated with collagen model peptides. This model peptides were synthesized using an optimized solid phase peptide synthesis protocol and dihydroxylated diastereoselectivly, similar to a posttranslational modification. A correlation between Hydroxylation pattern, conformarmation of the pyrrolidine and stability of the triple helical structure, determined with NMR-spectroscopical methods, was observed. A 1,2-diol, able to bind boronic acid or benzoboroxoles reversibly, was used to link the three single strands of a benzoboroxole modified collagen model peptide. This ist he first example of a covalent reversible capped collagen triple helix. Different cap-structures led to a stabilization oft he triple helical structure in all cases. A variation of the charge pattern led to the formation of different supramolecular aggregates.Soluble aggregates with broad or narrow size distribution as well as unsoluble aggregates were observed. The ability of precipitating silica of collagen model peptids is only little investigated. In this work, a link between aggregation or charge pattern and the ability of silica precipitation was observed. This is a significant progress in the synthesis of organic-inorganic-hybrid material based on collagens., Natürliches Kollagen ist ein posttranslational hochmodifiziertes Strukturprotein. Der Einfluss spezifischer Modifikationen auf die tripelhelikale Struktur wird mittels Kollagen-Modellpeptiden untersucht. Mittels optimierter Festphasen-Peptidsynthese wurden Modellpeptide dargestellt welche, ähnlich einer posttranslationalen Modifikation, diastereoselektiv dihydroxyliert werden konnten. Hier konnte ein Zusammenhang zwischen Hydroxylierungsgrad, Konformation des dihydroxylierten Prolinrings und Stabilität der gebildeten Tripelhelix, welche mittels NMR-spektroskopischer Methoden quantifiziert wurde, beobachtet werden. Eine Diolstruktur, welche in der Lage ist Boronsäuren bzw. Benzoboroxole reversibel zu binden, wurde zudem genutzt um ein Benzoboroxol-modifiziertes Kollagen-Modelpeptid zu verknüpfen. Dies ist zudem das erste Beispiel für eine kovalent reversibel verknüpfte (capped) Kollagen-Tripelhelix. Verschiedene cap-Strukturen führten in allen Fällen zu einer Stabilisierung der tripelhelikalen Struktur. Eine Modulierung der Ladungsstruktur führte zudem zu verschiedenen supramolekularen Aggregaten. Diese Aggregation reichte von löslichen Aggregaten mit schmaler bzw. breiter Größenverteilung, bis hin zu unlöslichen Aggregaten. Durch Untersuchungen hinsichtlich der Fähigkeit zur Fällung von Kieselsäure, über die für Kollagen-Modelpeptide nur wenig bekannt ist, konnte in dieser Arbeit ein Zusammenhang zwischen Ladungsstruktur bzw. Aggregation und der Kieselsäurefällung hergestellt werden. Dies stellt einen deutlichen Fortschritt in der Synthese organisch-anorganischer-Hybridmaterialen auf Basis von Kollagen dar.

The cyclopentene-based α,α-disubstituted α-amino acid Ac5c= and its homopeptides, up to nonapeptides, were synthesized. The side-chain cyclopentene was expected to become symmetric, the Cα-carbon to be puckered, and other Cβ, Cβ', Cγ, Cγ'-carbons to be coplanar. As expected, side-chain cyclopentene conformations became symmetric and Cα-carbons were puckered. Conformational studies using FT-IR absorption, 1H NMR spectra, and X-ray crystallographic analyses revealed that Ac5c= homopeptides did not form a planar conformation, but assumed a 310-helical structure, similar to cyclopentane-based α,α-disubstituted α-amino acid homopeptides.

Clostridium (C.) difficile assoziierte Durchfallerkrankungen haben in der vergangenen Dekade einen besorgniserregenden epidemiologischen Wandel durchlaufen. Die zunehmende Inzidenz und die erhöhte Mortalität werden unter anderem mit dem Auftreten neuer, hypervirulenter Stämme assoziiert, die durch eine erhöhte Produktion der beiden Hauptvirulenzfaktoren Toxin A und Toxin B, sowie durch die zusätzliche Bildung eines dritten Toxins, der Clostridium difficile Transferase (CDT), gekennzeichnet sind. Antibiotikatherapien gelten als Hauptauslöser der Erkrankung, sind zugleich aber auch der aktuelle therapeutische Goldstandard. Metronidazol und Vancomycin stellen zwar wirksame Mittel gegen C. difficile dar, beeinflussen jedoch nicht die krankheitsauslösenden Toxine, welche zum Zeitpunkt der Erkrankung bereits im Darmlumen vorliegen. Anhand von Vergiftungsversuchen mit Toxin A und CDT auf epithelialen Zellreihen konnten im Screening einer Peptidbank drei Peptidfraktionen (E3F10, E5F18 und E7F16) mit Hemmwirkung gegen die beiden Toxine identifiziert werden. Vergiftungen konnten unter Inkubation der hemmenden Peptidfraktionen nicht verhindert, jedoch mitunter erheblich verzögert werden. Am Beispiel der Peptidfraktion E6F18 und dem binären Toxin CDT wurden weitere Auftrennungszyklen sowie Versuche zur Analyse der Hemmwirkung durchgeführt. Adverse Eigeneffekte im Sinne einer durch die Peptidlösung ausgelösten Zytotoxizität konnten auf Vero-Zellen ausgeschlossen werden. Unter Einbuße der ursprünglichen Hemmstärke konnte der Hemmeffekt von E6F18 über drei rechromatographische Auftrennungszyklen weiterverfolgt und die Isolation einzelner Peptide mit Hemmwirkung unter anderem gegen CDT ermöglicht werden. Versuche zur Analyse des Hemmmechanismus von E6F18 liefern starke Hinweise auf eine Hemmung der frühen Schritte der Toxinprozessierung. Eine Interaktion mit einer der beiden Toxinkomponenten, dem Toxinrezeptor oder der Porenbildung wären denkbare Angriffspunkte. Ob der unspezifische Hemmeffekt von E6F18 auf ein einzelnes Peptid zurückzuführen ist oder das komplexe Gesamtbild vielmehr durch einen Synergismus unterschiedlicher Peptide zu erklären ist, bleibt vorerst offen.