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Die Entstehung, die Entwicklung und der Einfluß einer Daphnia-Dauereibank auf eine Daphnia-Population im Belauer See (Schleswig-Hostein) wurde mit molekularbiologischen Methoden (Mikrosatelliten; SSCP) untersucht. Eine Besonderheit des Belauer Sees ist das stratifizierte Sediment, so daß paläolimnologische Studien anhand älterer Dauereier (ca. 200 Jahre) durchgeführt werden konnten. Die Bedeutung von Daphnia-Dauereiern im Sediment wurde anhand zweier Hypothesen diskutiert. Hypothese 1 postuliert, daß die Dauereier im Sediment ein Spiegel vergangener Populationen sind, Hypothese 2 nimmt an, daß die aus den Dauereiern schlüpfenden Daphnien die Evolutionsrate der Population verlangsamen. Untersuchungen der Produktion, der Selektion und des Schlüpfens der Dauereier zeigten, daß beide Hypothesen nicht für den Belauer See zutreffend sind. Bei den drei im Belauer See koexistierenden Taxa ist eine zeitliche Veränderung in der genetischen Zusammensetzung in der Population zu erkennen. Die Ergebnisse zeigen, daß ein Einfluß von der Dauereibank ausgeht Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ___________________________________________________1 2 Material und Methoden _______________________________________7 2.1 Der Untersuchungsorganismus Daphnia ______________________________________ 7 2.2 Probenahmen ____________________________________________________________ 8 2.2.1 Das Untersuchungsgewässer__________________________________________ 8 2.2.2 Probenahmen von Daphnien aus dem Pelagial ____________________________ 9 2.2.3 Probenahmen von Dauereiern aus dem Sediment_________________________ 10 2.2.3.1 Probenahme von rezenten Dauereiern _____________________________ 10 2.2.3.2 Probenahme von alten Dauereiern ________________________________ 12 2.2.4 Probenahmen von Dauereiern aus dem Spülsaum ________________________ 13 2.3 Populationsdynamische Parameter__________________________________________ 13 2.3.1 Abundanzen von Dauereiern im Sediment ______________________________ 13 2.3.1.1 Abundanzen von rezenten Dauereiern _____________________________ 13 2.3.1.2 Abundanzen von älteren Dauereiern ______________________________ 15 2.3.2 Schwimmfähigkeit von Ephippien ____________________________________ 15 2.3.3 Schlüpffähigkeit von Dauereiern _____________________________________ 15 2.4 Genetische Analyse _______________________________________________________ 17 2.4.1 Probenvorbereitung und DNA-Isolierung_______________________________ 17 2.4.2 Charakterisierung der genetischen Struktur von Daphnien__________________ 20 2.4.2.1 Amplifikation von DNA-Sequenzen ______________________________ 20 2.4.2.2 Mikrosatelliten-Analyse ________________________________________ 23 2.4.2.3 Analyse mitochondrieller rDNA _________________________________ 27 2.4.2.4 Aufreinigung der mitochondriellen PCR-Produkte und Sequenzierung ___ 31 2.4.2.5 Allozym-Analyse _____________________________________________ 32 2.5 Datenanalyse ____________________________________________________________ 34 2.5.1 Genetische Variation_______________________________________________ 34 2.5.2 Hardy-Weinberg-Gleichgewicht (HWE) _______________________________ 35 2.5.3 Test auf Genkopplung (Linkage Equilibrium) ___________________________ 36 2.5.4 Simpson Index____________________________________________________ 37 2.5.5 Exakter Test zur Populationsdifferenzierung ____________________________ 38 2.5.6 Genetische Distanz und Konstruktion genetischer Bäume __________________ 38 2.5.7 Wright’s F-Statistik________________________________________________ 40 2.5.8 Multivariate Statistik_______________________________________________ 40 2.5.8.1 Prinzipielle-Komponenten-Analyse (PCA) _________________________ 41 2.5.8.2 Multidimensionales-Skalieren (MDS) _____________________________ 41 3 Ergebnisse _________________________________________________42 3.1 Auswahl und Etablierung der genetischen Methoden___________________________ 42 3.1.1 Methode zur Bestimmung der Haplotypen ______________________________ 42 3.1.1.1 SSCP-Analyse mit fluoreszenzmarkierten PCR-Produkten_____________ 43 3.1.1.2 SSCP-Analyse mit radioaktiven Isotopen __________________________ 46 3.1.1.3 SSCP-Analyse nach einer Silberfärbung ___________________________ 47 3.1.2 Mikrosatelliten-Analyse zur Bestimmung der klonalen Struktur _____________ 48 3.1.2.1 Auswahl von Mikrosatelliten-Primern _____________________________ 48 3.1.2.2 Optimierung der Mikrosatelliten-Analyse __________________________ 54 3.1.2.3 Einfluß des Probenumfangs auf die Genauigkeit der genetischen Analyse _ 55 3.1.2.4 Vergleich von Allozym- und Mikrosatelliten-Analyse ________________ 56 Inhaltsverzeichnis ii 3.2 Saisonale Entwicklung der genetischen Struktur von Daphnia im Belauer See ______ 60 3.2.1 Unterteilung der saisonalen Entwicklung anhand der abiotischen Parameter im Belauer See ___________________________________________________ 60 3.2.2 Saisonale Entwicklung der genetischen Variation der Daphnien im Belauer See 61 3.2.3 Saisonale Entwicklung der Mikrosatelliten-Allelfrequenzen ________________ 65 3.2.4 Saisonale Entwicklung der Populationsstruktur __________________________ 68 3.3 Die Populationsstruktur von Daphnien während der Phase der sexuellen Reproduktion____________________________________________________________ 72 3.3.1 Populationsstruktur von D. galeata im Mai ’99 __________________________ 72 3.3.1.1 Anteil der treibenden Ephippien__________________________________ 72 3.3.1.2 Genetische Variation bei D. galeata_______________________________ 73 3.3.1.3 Einfluß der sexuellen Reproduktion auf die Heterozygosität____________ 74 3.3.1.4 Klonale Zusammensetzung in der D. galeata-Population ______________ 75 3.3.1.5 Genetische Differenzierung innerhalb der Population _________________ 76 3.3.2 Populationsstruktur von D. hyalina im Herbst ’99 ________________________ 77 3.3.2.1 Genetische Variation bei D. hyalina_______________________________ 77 3.3.2.2 Einfluß der sexuellen Reproduktion auf die Heterozygosität____________ 78 3.3.2.3 Klonale Zusammensetzung in der D. hyalina-Population ______________ 80 3.3.2.4 Genetische Differenzierung innerhalb der Population _________________ 81 3.3.2.5 Entwicklung der Populationsstruktur im Herbst _____________________ 83 3.4 Dauereier im Sediment und im Spülsaum ____________________________________ 87 3.4.1 Abundanzen von Dauereiern im Sediment ______________________________ 87 3.4.2 Gleichmäßigkeit der Verteilung der Dauereier im Sediment ________________ 88 3.4.3 Schlüpferfolg von Daphnia-Dauereiern ________________________________ 90 3.4.3.1 Schlüpferfolg von Daphnia-Dauereiern aus dem Sediment ohne SedimentÜberschichtung_______________________________________________ 90 3.4.3.2 Schlüpferfolg von Daphnia-Dauereiern aus dem Sediment mit SedimentÜberschichtung_______________________________________________ 91 3.4.3.3 Schlüpferfolg von Daphnia-Dauereiern aus dem Spülsaum ____________ 93 3.4.4 Vergleich der Dauereier im Sediment und der geschlüpften Daphnien ________ 94 3.4.4.1 Taxonomische Zusammensetzung der Dauereier im Sediment und der geschlüpften Daphnien_________________________________________ 94 3.4.4.2 Genetische Variation der Dauereier im Sediment und der geschlüpften Daphnien ___________________________________________________ 95 3.4.4.3 Klonale Zusammensetzung der Dauereier im Sediment und der geschlüpften Daphnien_________________________________________ 96 3.5 Paläolimnologische Ergebnisse _____________________________________________ 99 3.5.1 Abundanzen von älteren Dauereiern___________________________________ 99 3.5.2 Genetische Variation von älteren Dauereiern im Sediment ________________ 100 3.5.3 Vergleich der Allelfrequenzen von älteren und jüngeren Dauereiern_________ 101 4 Diskussion_________________________________________________103 4.1 Methodendiskussion _____________________________________________________ 103 4.1.1 Bestimmung der maternalen Linien __________________________________ 103 4.1.2 Bestimmung der klonalen Struktur ___________________________________ 106 4.1.3 Einfluß des Probenumfangs auf die Genauigkeit der genetischen Analyse ____ 109 4.1.4 Vergleich von Allozym- und Mikrosatelliten-Analyse____________________ 110 4.1.5 Hybride im Belauer See ___________________________________________ 111 4.1.6 Bestimmung der klonalen Struktur bei älteren Dauereiern_________________ 113 Inhaltsverzeichnis iii 4.2 Populationsstruktur der Daphnien im Belauer See____________________________ 114 4.2.1 Bedeutung der Dauereier im Sediment ________________________________ 115 4.2.1.1 Bildung der Dauereier in der Daphnien-Population__________________ 116 4.2.1.2 Bedeutung der maternalen Linien für die Populationsstruktur von D. cucullata ________________________________________________ 118 4.2.1.3 Bedeutung von treibenden Dauereiern für die Dauereibank ___________ 119 4.2.1.4 Schlüpferfolg und Abundanzen _________________________________ 120 4.2.1.5 Selektion beim Schlüpfen______________________________________ 123 4.2.1.6 Bedeutung der Dauereier im Sediment - Synthese___________________ 124 4.2.2 Einfluß der Daphnia-Dauereier auf die genetische Struktur der Population im Pelagial______________________________________________________ 127 4.2.3 Auswirkung der sexuellen Reproduktion auf das HWE ___________________ 129 4.2.4 Bedeutung der Dauereier im Sediment als paläolimnologische Datenbank ____ 130 4.3 Schlußbetrachtung ______________________________________________________ 132 5 Zusammenfassung __________________________________________134 6 Literaturverzeichnis ________________________________________137 7 Anhang _____________________________________________________I