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Regardless of chronic lymphocytic leukaemia (CLL) being the most common adult leukemia, therapeutic approaches remain mainly palliative. Particularly in relapsed and refractory malignancies lenalidomide demonstrated promising efficacy and it is a therapeutic approach especially in elderly patients. Lenalidomide is a second generation analog of thalidomide and as such an immunomodulating drug (IMID) with various effects on the microenvironment of tumor cells. Direct cytotoxicity in CLL has been negated so far. The presented work investigates effects of lenalidomide on the tumor cell in vitro. Therefore peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of CLL patients and CD19 sorted tumor cells have been treated and compared. Beside cell viability, intracellular pathways and cell activation have been measured. In contrast to the present postulate lenalidomide had a direct cytotoxic effect on CLL cells. An effect that can only be observed after a few days though. After 96 hours lenalidomide reduced cell viability in 24 of 27 patients by an average of 25 % compared to the negative control (p < 0,0001) and reduced ATP in all measured patients. It had an even greater effect on the sorted tumor cells compared to the unsorted environment. Particularly high risk patients (unmutated IgVH, 17p deletion, TP53 mutation) showed good treatment response. An elevated caspase-3 activity suggests that apoptosis might play a role. However the fact that the effect could not be antagonized by caspase inhibition (z-VAD-FMK) indicated that caspase independent mechanisms are involved too. A suppression of the canonical NF-κB pathway as with the predecessor thalidomide could not be demonstrated. A direct cytotoxic effect of lenalidomide in CLL represents a completely new approach. Although underlying mechanisms remain to be revealed, the good response of high risk subtypes could help allocating therapy to patients. Furthermore understanding the role of pathways such as PI3K/Akt or NF-κB in this context could help to understand the pathophysiology of the malignancy itself., Trotzdem die Chronisch Lymphatische Leukämie (CLL) die häufigste Leukämie beim Erwachsenen darstellt, bleiben die verfügbaren Therapien weiterhin von vorwiegend palliativem Charakter. Besonders bei refraktären Patienten und Rezidiven hat Lenalidomid vielversprechende Ergebnisse erzielt und stellt gerade beim älteren Patienten einen Therapieansatz dar. Als Zweitgenerationsanalogon von Thalidomid gehört es zur Gruppe der Immunmodulatoren (IMID) mit einem vielseitigen Wirkungsspektrum auf das Mikroenvironment der Tumorzelle. Direkte zytotoxische Effekte wurden in der CLL bisher verneint. In der vorliegenden Arbeit wurden der Einfluss des Medikaments auf die Tumorzelle in vitro untersucht. Dazu wurden periphere mononukläre Zellen (PBMC) von CLL-Patienten und CD19-angereicherte Tumorzellen der selben Patienten behandelt und verglichen. Untersucht wurde neben der Viabilität, intrazelluläre Signalpathways sowie die Zellaktivierung. Im Gegensatz zum bisherigen Postulat konnte hierbei gezeigt werden, dass Lenalidomid einen direkten zytotoxischen Effekt auf die CLL-Zelle besitzt. Ein Effekt, der jedoch erst nach einigen Tagen zum Tragen kommt. Nach 96 Stunden Behandlungszeit zeigte sich bei 24 der 27 untersuchten Patienten eine Reduktion der Viabilität um durchschnittlich 25 % im Vergleich zur Negativkontrolle (p < 0,0001) sowie eine ATP-Reduktion bei allen untersuchten Patienten. Dieser Effekt war zudem ausgeprägter, als bei der Behandlung der Tumorzelle in PBMC-Umgebung. Besonders Hochrisikopatienten (fehlende IgVH-Mutation, 17p-Deletion, TP53-Mutation) zeigten ein gutes Ansprechen. Eine erhöhte Caspase-3-Aktivität in den behandelten Zellen lässt zudem vermuten, dass die Induktion von Apoptose dabei eine Rolle spielt. Eine fehlende Antagonisierbarkeit durch Caspase-Inhibition (z-VAD-FMK) legt jedoch nahe, dass weiter caspaseunabhängige Mechanismen beteiligt sind. Für eine Suppression des kanonischen NF-κB -Pathways, wie bei der Vorgängersubstanz Thalidomid, gab es indes keinen Hinweis. Ein direkter zytotoxischer Effekt in der CLL stellt einen völlig neuen Ansatz dar. Auch wenn die zugrunde liegenden Mechanismen zu klären bleiben, kann das gute Ansprechen prognostisch ungünstiger Subtypen ein Anstoß bei der Zuordnung von Patient und Therapie sein. Welche Rollen PI3K/Akt oder NF-κB dabei spielen bleibt zu klären, kann aber auch dabei helfen die Pathophysiologie der Erkrankung selbst zu verstehen.

Trotz großer Fortschritte in der Behandlung des Multiplen Myeloms in den letzten 20 Jahren kann nur in Ausnahmefällen eine Heilung erreicht werden. Immer häufiger ist es möglich, die Erkrankung bis auf eine minimale Resterkrankung (MRD) zurück zu drängen. Neue Therapiestrategien zur Kontrolle der MRD sind daher von großem Interesse. Dabei rücken zunehmend immuntherapeutische Strategien zur Anti- Tumor-Vakzinierung in das Interesse der Forschung. Neben der Vakzinierung der Patienten mit ex vivo generierten, mit Antigen-beladenen und nachfolgend gereiften Dendritischen Zellen (DZ) oder aber dem adoptiven Transfer Tumorantigenspezifischer T-Zellen kommt insbesondere die in vivo-Applikation von Antigen und Reifungsstimulus in Betracht. In dieser Arbeit wurden bispezifische Konstrukte entwickelt, um die Präsentation von Tumorantigen in DZ über eine gezielte Aufnahme über Endozytoserezeptoren zu verbessern und simultan eine Reifung der DZ über eine CD40-Aktivierungsdomäne zu induzieren.

Introduction: Despite intensive research in the last years etiology and pathogeneses of inflammatory bowel disease is still not clear. Immune regulating NKT cells express on the surface NK marker and a semi-invariant T cell receptor [1, 2]. We could show, that NKT cells activated through CD1.1 ameliorate colitis in SCID mice induced by transfer of CD62L+CD4+T cells [3, 4]. Aim of this study was to clarify the mechanism of the NKT- T cell interaction with the colitis induction CD62L+CD4+ T cells. Methods: CD4+CD62L+ and NKT cells were isolated of spleens of Balb/c mice with magnetic activated cell sorting (MACS). Lymphocytes of mice with colitis respectively healthy mice were isolated from mesenterial lymph nodes. Cells were labeled with membrane bound carboxyfluorescein-diacetat succinimidylester (CFSE) in order to determine cell proliferation in vitro. 0.3 millions of CD62L+CD4+ T cells respectively colitis cells were co-cultured in 1 ml with NKT cells. In an addition experiment transwell plates were used which permit the interaction through cytokines but no cell-cell contact. After three days cell count was analysed through FACS. For the specific blocking of receptor antibodies against CD1.1, CD40, CD154, B7−H1 (Fa. Bioscience) and an unselective caspase inhibitor (20 μ, Z-VAD-FMK, Fa. Promega) were given to the co-culture followed by FACS analyse. Results: The FACS analyse showed a significant loss of CD62L+CD4+ T cells (45% of the original cell count) and colitis cells (67%) after co-culture with NKT cells. The antiproliferative effect could not be detected after co-culture in cell-cell contact inhibiting transwell plates. Cell count of CD62L−CD4+ T cells, which are unable to induce colitis, was only slightly reduced (75%). The blocking of CD1.1 (66%), CD40 (69)%, CD154 (58%) and especially B7−H1 (87%) diminished the antiproliferative effect of NKT cells on CD62L+CD4+ T cells whereas the caspase inhibitor did not show a significant influence. Conclusion: In other studies of our group through CD1.1 activated NKT cells could ameliorate CD62L+CD4+ T cell induced colitis. The in vitro experiments showed a significant inhibition of proliferation of CD62L+CD4+ T cells an colitis cells through NKT cells. This requires cell-cell contact and the receptors CD1.1, CD40, CD154 and especially B7−H1. Consequently the following signal cascade in the colitis model is likely: Activation of the NKT cell through CD1.1 is followed by the antiproliferative effect of B7−H1 and the co-stimulatory pathway CD154−CD40. From this new information about the mechanism of the immune regulating function through NKT cells are revealed and with that a specific cell therapy of colitis.

IgE ist das Schlüsselmolekül Typ-I allergischer Erkrankungen.. Die Produktion von IgE wird durch die Interaktion des Oberflächenmoleküls CD40 auf B-Zellen mit seinem Liganden (CD40L), dass von aktivierten T-Zellen exprimiert wird, sowie über Signale durch die Zytokine IL-4 oder IL-13 von B-Zellen produziert. Die CD40/IL-4-abhängige IgE-Produktion in vitro kann einerseits als Modell zum Verständnis der Entstehung allergischer Erkrankungen eingesetzt werden; andererseits können potenziell therapeutisch wirksame Substanzen untersucht werden. Untersuchungen zum Verständnis allergischer Erkrankungen zeigen, dass LTa nach CD40/IL-4-Stimulation von humanen B-Zellen vermehrt produziert wird und dies in autokriner Weise zu einer Steigerung der CD40/IL-4-vermittelten Proliferation und IgE-Produktion führt. Darüberhinaus wurde eine vermehrte Produktion von LTa bei allergischen Patienten nachgewiesen, so dass eine funktionelle Relevanz von LTa in der Pathogenese allergischer Erkrankungen zu vermuten ist. Die Arbeiten zu den intrazellulären Mechanismen der LTa-Induktion nach CD40/IL-4-Stimulation demonstrieren, dass sowohl der Transkriptionsfaktor NF-kB als auch verschiedene Proteinkinasen hier eine wesentliche Rolle spielen. Untersuchungen mit Hilfe des CD40/IL-4-abhängigen Systems bei humanen B-Zellen, die einen therapeutischen Einsatz zur Behandlung allergischer Erkrankungen haben könnten, zeigen, dass Retinoide aber auch Vitamin D zu einer erheblichen Hemmung der IgE-Produktion in- vitro führen., IgE plays a key role for the development of type I related allergic diseases. Production of IgE by B cells is induced by the interaction of the surface molecule CD40 with its natural ligand (CD40L), which is expressed on activated T cells and signals which are provided by the cytokines IL-4 or IL-13. This model can be used for studies either to understand the development of allergic diseases or to investigate novel therapeutic approaches. In the context of the understanding the development of allergic diseases the present work shows that LTa is produced by B cells after CD40+IL-4 stimulation and that increased production of LTa results in enhanced CD40+IL-4 mediated B cell proliferation and IgE synthesis. Furthermore an increased production of LTa was shown in allergic patients indicating the potential role of LTa in allergic diseases. Analysis of the gene regulation of LTa after CD40 stimulation revealed an important role of the transcription factor NF-kB and showed the role of different protein kinases at the intracellular level. Studies using the CD40+IL-4 system in vitro which may have a therapeutical impact revealed that vitamin A and vitamin D are potent inhibitors of IgE production in vitro. Taken together the present work shows new mechanisms of CD40+IL-4 mediated IgE synthesis and also offers new potential therapeutical approaches of allergic diseases.