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Titelblatt, Akürzungs-und Inhaltsverzeichnis, Anhang Einleitung Material Methoden Ergebnisse Diskussion Literaturverzeichnis, Hintergrund: Alternativ zu autologem arteriellen oder venösen Gefäßersatz bietet sich in der kardialen Bypasschirurgie die Verwendung kleinkalibriger PTFE-Prothesen mit Durchmessern von 3-4 mm an. Die Thrombogenität dieser sehr englumigen Gefäßprothesen ist allerdings hoch und die hohen Spontanverschlussraten erschweren derzeit eine Verwendung. Die Besiedlung solcher Gefäßprothesen mit Endothelzellen im Rahmen des Tissue-Engineering erhöht die Offenheitsraten deutlich und lässt künstlichen Gefäßersatz in die Nähe breiter klinischer Anwendung rücken. Oftmals besitzen jedoch Patienten mit vaskulären Erkrankungen kein adäquates Gewebe, um autologe Endothelzellen isolieren und kultivieren zu können. Allogene humane Nabelschnurvenen- Endothelzellen (HUVEC) wären aufgrund ihrer einfachen Verfügbarkeit eine gute Alternative, jedoch stellt sich in diesem Fall das Problem der Transplantatabstoßung aufgrund von MHC -Inkompatibilitäten. Spender MHC I-Moleküle, als eines der Hauptangriffsziele bei der zellulären Abstoßung stellen daher einen interessanten Ansatz für eine molekulare Immunmodulation dar. Eine MHC I Oberflächenreduktion der Transplantatzellen könnte die allospezifische Abstoßung drastisch minimieren und so ein Transplantatüberleben ohne Immunsuppression ermöglichen. Eine Reduktion der MHC I Oberflächenexpression kann durch ein Antikörperfragment ( Intrabody ), das MHC I bindet, erzielt werden. Durch eine Retentionssequenz wird der Intrabody im Endoplasmatischen Retikulum zurückgehalten und kann dort MHC I binden und so die Oberflächenexpression verhindern. Methoden: HUVEC wurden mit adenoviralen Vektoren für den anti-MHC I Intrabody, für ein EGFP-Reportergen und für die Kontrollvektoren (ß-Gal oder AAT) transduziert. Die MHC I Oberflächenexpression auf den Endothelzellen wurde nach den Transduktionen durchflusszytometrisch bestimmt. Ein Calcein-release Zytotoxizitätsassay wurde durchgeführt um eine funktionelle Wirksamkeit des Intrabodys im in vitro Abstoßungsmodell nachzuweisen. Ergebnisse: Eine Transduktionseffizienz von über 95 % beim adenoviralen Gentransfer zeigt die hohe Effektivität der adenoviralen Transduktion. Intrabody exprimierende HUVEC zeigen eine dramatische MHC I Oberflächenreduktion bis hin zum phänotypischen Knock-out . Dieser Effekt ließ sich durch eine Stimulation mit proinflammatorischen Zytokinen nicht aufheben. Intrabody exprimierende Zellen waren in einem Zytotoxizitätstest vor der Lyse durch allospezifische zytotoxische Lymphozyten geschützt. Schlussfolgerungen: Bei der Verwendung Intrabody exprimierender allogener HUVEC zur Besiedlung künstlicher Gefäßprothesen wären geringere Abstoßungsreaktionen zu erwarten. Das wäre ein Schritt in die Richtung, solche Zellen als Alternative zu autologen Endothelzellen zu nutzen., Background: The seeding of small calibre vascular polytetrafluoroethylene (PTFE) grafts with endothelial cells provides an increase of biocompatibility of the graft surface. The harvest and ex vivo culture of autologous endothelial cells is highly delicate. Allogeneic human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) could be a potential cell source - however, rejection might occur due to major histocompatibility complex (MHC) mismatches. Lowering cell surface MHC I expression on endothelial cells by gene transfer of an anti-MHC I intrabody might reduce graft failure. The intrabody consists of a single-chain variable fragment (sFv) of an anti-MHC I antibody, carrying a terminal KDEL sequence to retain the molecule together with the MHC I inside the endoplasmatic reticulum. Methods: Adenoviral gene transfer was used to express the intrabody in HUVEC. The MHC I surface expression was measured 48 h after transduction by flow cytometry. Functional effects of the intrabody expression were analyzed in a calcein release cytotoxicity assay. Results: A transduction efficiency of more than 95 % with EGFP-Adenovirus indicates a sufficient gene transfer into HUVEC. Intrabody- adenovirus transduced HUVEC show a massive reduction of MHC I surface expression creating almost a complete knockout phenotype. Stimulation with inflammatory cytokines could not overcome this effect. The cell lysis of anti- MHC I intrabody-expressing HUVEC in a cytotoxicity assay is reduced when compared to the level of a MHC mismatched control. Conclusion: Our data indicate that anti MHC I intrabody transduced HUVEC with reduced levels of surface MHC I show lower rates of allospecific rejection and might be used as allogeneic donor cells for the seeding of artificial vascular grafts.

Die Expression von Haupthistokompatibilitätsantigenen auf der Zelloberfläche kernhaltiger Zellen ist die Hauptursache für die Detektion durch das Immunsystem und die Rejektion allogener Transplantate. Eine vielversprechende Strategie, die MHC-I-Expression auf der Zelloberfläche zu senken, ist der Einsatz intrazellulär lokalisierter Antikörpern, sogenannter Intrabodies. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals versucht, eine die Expression an MHC-I-Molekülen auf der Zelloberfläche durch den Einsatz von anti-MHC-I-Intrabodies zu verhindern. Ein Hauptproblem in der Transplantation ist der Mangel an geeignetem Spendermaterial. Um diesem Zustand entgegenzuwirken, wird versucht, adäquaten Organersatz durch Tissue Engineering bereitzustellen. Die in vitro-Züchtung autologer epithelialer Zellen zur Generierung transplantierbarer Hautstücke spielt heute bereits eine große Rolle bei der Transplantation artifizieller Gewebe. Ferner werden diverse vollsynthetische Materialien für diesen Zweck hergestellt. Eine Verbesserung in diesen Bereich würde die Generierung von nicht-immunogenen allogenen Keratinozyten darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden primäre Rattenkeratinozyten mit anti-MHC-I-Intrabodies transfiziert. Diese Zellen zeigten einen MHC-I-"knock-out"-Phänotyp - eine starke Expression der Intrabodies war jedoch essentiell für die vollständige Zurückhaltung aller MHC-I-Moleküle in der Zelle. Neben der Applikation von Intrabodies in Rattenkeratinozyten konnte die MHC-I-Expression auf der Zelloberfläche von 293-Zellen und primären humanen Keratinozyten ebenfalls durch die Expression von anti-MHC-I-Intrabodies vermindert werden. Im Vergleich mit dem ebenfalls MHC-I-bindenden adenoviralen Protein p19 bewirkten die eingesetzten anti-MHC-I-Intrabodies bei gleich starker Expression eine wesentlich stärkere "Downregulation" der MHC-I-Oberflächenexpression von 293-Zellen. Intrabody-exprimierende Zellen zeigten keine signifikanten morphologischen oder physiologischen Veränderungen gegenüber untransfizierten Zellen: Wachstum, die Expression anderer Oberflächenmoleküle und morphologische Erscheinung waren unverändert. Es konnte lediglich eine verstärkte intrazelluläre Akkumulation von MHC-I-Molekülen detektiert werden. Die funktionelle Bedeutung der MHC-I-"Downregulation" durch Intrabodies konnte durch die stark verminderte zytolytische Aktivität zytotoxischer T-Zellen gegenüber Intrabody-exprimierender Rattenkeratinozyten im Vergleich zu unmodifizierten Zellen gezeigt werden. In der vorliegenden Arbeit ist es erstmals gelungen, Zellen mit einem vollständigen MHC-I-"knock-out"-Phänotyp zu erzeugen - bisherige Modifikationen der MHC-I-Oberflächenexpression durch die Generierung _2-Mikroglobulin- oder TAP-defizienter Mäuse führte zu keinem restlosen Verlust der Klasse-I-Moleküle auf der Zelloberfläche. MHC-I-"downregulierte" Keratinozyten könnten in der Hauttransplantation anstelle der limitiert zur Verfügung stehenden autologen Zellen eingesetzt werden oder in Kombination mit synthetischen Materialien verwendet werden, wo sie durch die Sekretion von heilungsfördernden Faktoren eine Verbesserung des Wundheilungsprozesses bewirken würden. The expression of major histocompatibility antigens on the surface of eucaryotic cells is the predominant reason for immunologic detection and the rejection of allogeneic transplants. A promising strategy to lower the MHC I expression on the cell surface is the use of intracellular localized antibodies, termed intrabodies. In this work it has been tried for the first time to prevent the expression of MHC class I molecules on the cell surface by intrabody expression. A major problem in transplantation is the shortage of suitable donor material. To overcome this situation tissue engineering has and will continue to enlarge the scope of organ grafting. Today, the in vitro culture of autologous epithelial cells to generate transplantable skin sheets plays an important role in the transplantation of artificial tissues. Furthermore various fully synthetic materials are produced for transplantation. An improvement in this field could be the generation of non-immunogeneic allogeneic keratinocytes. Within this work primary rat keratinocytes have been transfected with anti-MHC-I-Intrabodies. These cells show a MHC I "knockout" phenotype - yet a strong intrabody expression was essential for the complete retention of all MHC I molecules inside the cell. Besides the application of intrabodies in keratinocytes the MHC I expression on the surface of 293 cells and human primary keratinocytes could be reduced by anti-MHC I intrabodies as well. In comparison with the also employed adenoviral protein p19 the applied intrabodies generated at the same expression level a much stronger down-regulation of the MHC I surface expression of 293 cells. Intrabody expressing cells did not show any significant morphologic or physiologic alterations compared to untransfected cells: growth, the expression of other surface molecules and the morphological appearance were unaltered. Merely an enhanced intracellular accumulation of MHC I molecules could be detected. The functional relevance of the MHC I down-regulation by intrabodies could be shown by the strong diminished cytolytic activity of cytotoxic T cells to intrabody expressing rat keratinocytes in comparison to unmodified cells. In this work cells with a completely MHC I knock-out phenotype has been successfully generated for the first time - modifications of the MHC I surface expression by generation of _2-microglobulin or TAP deficient mice did not lead to a complete loss of all MHC I molecules on the cell surface so far. MHC I down-regulated keratinocytes could be employed in skin transplantation instead of the limited available autologous cells or utilized in combination with synthetic materials where they would induce an improvement of the healing process by the secretion of cytokines.