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Surfactant Protein B Mangel ist ein angeborener Gendefekt, der dazu führt, dass der Surfactant der Lunge die Oberflächenspannung in den Alveolen nicht ausreichend herabsetzen kann. Infolgedessen kann die Lunge bei Neugeborenen mit dieser Mutation nicht arbeiten. Es kommt zu Atemversagen und die einzige derzeitig verfügbare Therapie ist eine Lungentransplantation. In dieser Arbeit sollte überprüft werden, ob sich lentivirale Vektoren für eine Gentherapie von Alveolaren Epithelzellen des Typs II (ATII) zur Behandlung von Surfactant Protein B Mangel einsetzen lassen. Eine vorhergehende Veröffentlichung hatte gezeigt, dass VSV-G pseudotypisierte LVV Alveolarepithel und alveolare Makrophagen bevorzugt infizieren. Um LVV für solche Studien herstellen zu können, wurde eine umfangreiche Produktionsoptimierung durchgeführt, an deren Ende Titer im Bereich von 2 c 108 IP/mL erreicht wurden. Die Besonderheiten der Optimierung lagen zum Einen in der Verwendung von PDL beschichteten Zellkulturplatten. Durch dieses Vorgehen konnten problemlos 7,5 c 106 Zellen in einer 10 cm Schale ausgesät werden, so dass am Tag der Transfektion mit lPEI eine 100% Konfluenz der Zellen vorlag. Die andere Besonderheit war die Verwendung einer Ultrafiltration anstelle einer Ultrazentrifugation zur Reinigung und Konzentrierung der lentiviralen Partikel. Im Anschluss wurde ein geeigneter interner Promotor für den Transfervektor gesucht. Diese Promotoren wurden verglichen: humaner Elongationsfaktor 1 a, Ubiquitin B & C, Cytomegalovirus und Surfactant Protein B. Die Wahl fiel auf den EF1a Promotor, da er eine stabile Langzeitexpression über 150 Tage in vitro und eine gute Produzierbarkeit aufwies. Diese stabile Langzeitexpression eines Luciferase- Reportergens konnte auch in vivo auf Lebenszeit der Mäuse nachgewiesen werden. Dafür wurden 10.000 IP intranasal instilliert, ohne eine sonst übliche Vorbehandlung durch bspw. Lysophosphatidylcholin. Eine in vitro Überprüfung des Transfervektors mit dem therapeutischen SP-B Gen ergab in HEK293T, A549 und MLE12 Zellen die Sekretion einer SP-B Vorstufe. Die in vivo Überprüfung dieses LVV war nicht erfolgreich. Selbst konditionale SP-B Knock out Mäuse, die eine dreimalige Dosis erhalten hatten, waren nicht überlebensfähig. Zur Überprüfung wurde ein Transfervektor mit LacZ Reportergen kloniert und wie der SP-B enthaltende LVV appliziert. Die Begutachtung durch einen Pathologen ergab zwar die erfolgreiche Transduktion der Zielzellen, wie auch schon in den in vivo Versuchen. Allerdings war die Transduktionseffizienz im alveolaren Deckepithel so gering, dass kein positiver Effekt in Erscheinung trat. Grund dafür war eine umfangreiche Transduktion des Bronchialepithels, so dass nicht mehr ausreichend Vektoren in die Alveolarregionen vordringen konnten. Für eine erfolgreiche SP-B Gentherapie muss die Applikationsroute entscheidend verbessert werden – was z.B. durch eine bronchoalveoläre Lavage oder eine Aerosolapplikation geschehen könnte., Surfactant Protein B deficiency is an inherited genetic disorder, causing the malfunction of pulmonary surfactant. The lung of newborn with this disorders cannot work correctly, leading to respiratory distress which can only be treated by a lung transplantation in the moment. Therefore, this work deals with the possible use of lentiviral vectors as a gene therapy vehicle to Alveolar Type II cells in order to treat SP-B deficiency. A previous publication showed that VSV-G pseudotyped LVV are predominantly transducing alveolar epithelium and macrophages. To be able to produce suitable amounts of LVV for doing these studies, an extensive production optimization took place, with final titers around 2 c 108 IP/mL. Special in the chosen production process were on the one hand the usage of PDL coated cell culture surfaces, which allowed a very good handling and high transfection efficiencies. On the other hand, it was special to replace the usual ultracentrifugation by an ultrafiltration for purification and concentration of the vector containing supernatants. Subsequently, a suitable internal promoter for the transfer vector was determined. The following elements were compared: human Elongation Factor 1 a, Ubiquitin B & C, Cytomegalovirus and Surfactant Protein B. The favored promoter was EF1a, due to its stable long term expression over 150 days in vitro and its good producibility. The stable long term expression of a Luciferase reporter gene could also be observed in vivo, for the whole life time of the mice. This life time expression is very promising, because it was achieved with only 10.000 IP, which were instilled nasally, without any pretreatment with i.e. Lysophosphatidylcholin. An in vitro testing of the transfer vector containing the therapeutic SP-B Gene showed a successful secretion of a SP-B preproprotein in HEK293T, A549 and MLE12 cells. But nethertheless, an in vivo study was not successful. Even conditional SP-B knock out mice, which received three doses of 1 c 108 IP on average, were not able to survive. As a control a transfer vector with a LacZ reporter gene was cloned and applied according to the protocol used for the SP-B in vivo study. The expert opinion of a pathologist made clear that there was successful transduction of the target cells, but on a far too low level. This was most possibly due to the extensive transduction of bronchial epithelium, sparing not enough vector to reach high transduction in alveolar region. According to this result VSV-G pseudotype is – at least in the used mouse model – not predominantly targeting alveolar cells. For a successful SP-B gene therapy it is vital to improve the application route. Possible would be i.e. a bronchoalveolar lavage or an application as an aerosol.

Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Zusammenfassung, Danksagung, Erklärung Einleitung Material und Methoden Ergebnisse Diskussion Literaturverzeichnis, Die Duchenne Muskeldystrophie (DMD) gehört zu den häufigsten erblichen Muskeldystrophien im Kindesalter. Gegenwärtig werden die Substitution von Dystrophin oder ähnlichen Proteinen sowie die Korrektur der Mutation und damit die Wiederherstellung der Dystrophinexpression als gentherapeutische Strategien verfolgt. Jedoch führt sowohl die Herstellung der Dystrophinexpression als auch die Verwendung von viralen Transfersystemen im adulten Organismus zu Reaktionen des Immunsystems. Zudem wird eine autologe ex vivo Therapie durch eine limitierte Zahl an Myoblasten eingeschränkt. Fetale und Dystrophin-Downstream Konzepte könnten Probleme der genannten Strategien umgehen bzw. sinnvoll unterstützen. Expressionsuntersuchungen in Dystrophin negativen (Dys-) Muskelzellen zeigten Veränderungen in Genen für Zellwachstum und Differenzierung. So wiesen Biopsien von DMD-Patienten ein erhöhtes Niveau an p21 mRNA auf, einem Cyklin-abhängigen Kinase-Inhibitor, der hoch reguliert das Fortschreiten der Zellen von der G1 zur S1 Phase im Zellzyklus und somit die Zellteilung inhibiert. Ein erhöhtes Niveau von p21 schränkt somit die Zielzellen für eine autologe ex vivo oder in vivo Gen- und Zelltherapie ein. Die Reduktion von p21 würde die Möglichkeit bieten das Reservoir an Myoblasten zu erhalten oder wiederherzustellen. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Etablierung der p21 Inhibition in vitro durch RNA-Interferenz. Hierfür wurden optimale Transfektionsbedingungen und funktionelle siRNAs ermittelt. Die effektiven siRNAs wurden in einem lentiviralen Vektorsystem verwendet, um einen möglichst vollständigen und stabilen p21 knockdown zu erzielen. Dies geschah für primäre humane Myoblasten und für murine C2C12 Zellen, um den Effekt der p21 Inhibition auf die Proliferation zu untersuchen. Die Austestung an murinen Zellen erlaubt die Entwicklung eines Systems für einen in vivo Versuch am mdx-Mausmodell. Zwei in humanen Myoblasten wirksame siRNAs gegen p21 kamen an Dys- Zellen zum Einsatz. Die siRNA induzierte p21 Proteinreduktion betrug 72 Stunden nach Transfektion 29% bis 78%. Die p21 Proteinreduktion resultierte in einer Proliferationssteigerung von 11% bis 47% gegenüber unbehandelten Kontrollen. Die Expression von siRNA im lentiviralen Vektor führte zu einer nachhaltigen p21 Proteinreduktion von 70% fünf Wochen nach Infektion in Zellen eines DMD Patienten. Die Proliferation der infizierten Zellen stieg um 127%. Wiederholte Infektionen von Zellen eines anderen Patienten zeigten einen Proliferationsanstieg von 35% bis 63%. Die Unterschiede in der p21-Reduktion und der Proliferationssteigerung weisen auf eine hohe Varianz des siRNA Effektes hin. Hierbei können Unterschiede im Integrationsort des lentiviralen Vektors und individuelle Schwankungen in der p21 Basisexpression eine Rolle spielen. Die p21 Inhibition verhinderte eine vollständige Differenzierung. Für murine Zellen wurde ebenfalls eine siRNA identifiziert, die nach transienter Transfektion zu einer p21 Inhibition von 61% nach 48 Stunden führte. Die abgeleitete, viral exprimierte shRNA erzielte jedoch nur eine Reduktion von 30% gegenüber Kontrollen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine stabile p21 Reduktion mittels viral vermittelter RNA- Interferenz in der Lage ist die Proliferation von Dys- Zellen zu steigen. Damit könnte der stetige Verlust von Myoblasten bei DMD Patienten eingeschränkt werden, was zum Erhalt der Zielzellen für eine Gen- und Zelltherapie führt. Weiterführende Arbeiten zur Regulation der p21 siRNA Expression müssen jedoch eine Redifferenzierung der Myoblasten sicherstellen und sich dem Infektions-bedingten Zellverlust stellen. Während eine p21 Reduktion alleine keine Ursache für eine Onkogenese zu sein scheint, müssen verbesserte retrovirale Systeme Integration-bedingte Risiken minimieren., Duchenne Muscle Dystrophy (DMD) is one of the most common heritable muscle disorders in childhood. Dystrophine substitution or gene fixing approaches to restore dystrophine expression are currently investigated as gene therapeutic strategies. But there are still obstacles to overcome like immune response to the re-established dystrophine expression as well to viral vector systems. And autologous ex vivo therapies are limited due to the small amount of available target cells. Fetal- or dystrophine-downstream concepts could bypass or assist some problems of these strategies. Comprehensive studies on expression of dystrophine negative (dys-) myoblasts showed altered expression of genes involved in cell proliferation and differentiation. Biopsies of DMD patients showed an increased level of cyclin dependent kinase inhibitor p21 mRNA compared to dystrophine positive controls. P21 regulates the G1 S1 progression within the cell cycle. An elevated level on p21 inhibits cell proliferation and limits the potential target cells for an autologous ex vivo as well as in vivo gene or cell therapy. Therefore a reduction in p21 could help to maintain or restore the reservoir of myoblasts. In the present study a p21 inhibition by RNA-Interference was established. Optimal transfection parameters were determined and potent p21 siRNAs were identified. The influences on cell proliferation were investigated. Effective siRNAs were used in a lentiviral vector system to achieve a long lasting, inducible and complete p21 knockdown. This was done in primary human myoblasts as well as in murine c2c12 cells. This parallel approach provides the opportunity to use this strategy in vivo in the mdx mouse model. Two effective siRNAs against human p21 were used on primary dystrophine negative myoblasts. P21 protein was reduced by 29% to 79% after 72 hours after transfection and resulted in an increase in proliferation by 11% to 47% compared to untreated controls. The siRNA expressed by a lentiviral vector lead to a prolonged reduction of p21 protein by 70% of myoblasts from a dys- patient five weeks after infection. The proliferation was elevated by 127%. Infection of myoblasts from a second patient resulted in a protein reduction by 35%-63%. The p21 knockdown prevented also a complete differentiation of myoblasts. Differences in p21 basis expression, or different integration sites of the lentiviral vector could be the reason for observed variances in the effect of siRNA inhibition. The p21 knockdown prevented also a complete differentiation of myoblasts. Additionally effective siRNAs for tests on murine myoblasts were identified. After transient transfection p21 protein was reduced by 61% after 48 hours. The same siRNA expressed by a lentiviral vector showed a decrease of p21 protein by only 30% compared to untreated controls. Differences in p21 basis expression, or different integration sites of the lentiviral vector could be a reason for the observed variances in the effect of siRNA inhibition. The present study shows that a stable p21 inhibition by RNA interference can lead to an increased proliferation of dys- myoblasts. This could prevent the continuous loss of myoblasts and preserve cells for an additional gene and cell therapy. Following studies which focus on regulation of siRNA expression should assure redifferentiation of treated myoblasts. Although the loss of p21 alone seemed no cause of oncogenesis, retroviral vector systems have to be improved to minimize the risk of oncogenesis by random integration.