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Einleitung: Skelettmuskeltraumata bei Unfällen oder Operationen können zu einer dauerhaften Funktionseinschränkung der Muskulatur führen. Die intrinsische Regenerationskapazität der Skelettmuskulatur ist beschränkt und kann im Besonderen bei ausgeprägten Verletzungen oder Gewebeverlust keine vollständige Wiederherstellung der Muskelmasse und Funktionalität garantieren. Bisherige Therapiestrategien unterstützen die Restitutio nur unzureichend. Bereits in vorangegangenen Studien konnte der positive Effekt von autologen, mesenchymalen Stammzellen auf die Muskelregeneration der Ratte belegt werden. Für eine suffiziente klinische Anwendung ist jedoch die ständige Verfügbarkeit der Zellen eine Grundvoraussetzung. Hier stellen postpartal aus der Plazenta gewonnen PLX- Zellen eine mögliche und effektive Option dar. In dieser Arbeit soll der Einfluss von menschlichen PLX-Zellen auf die Muskelregeneration der Ratte untersucht werden. Methodik: Für den Versuch wurden 40 Sprague Dawley Ratten in zwei Therapie- und zwei Kontrollgruppen unterteilt. Zur besseren Vergleichbarkeit mit vorherigen Studien dieser Arbeitsgruppe erhielten alle Tiere eine Punktion beider Tibiae mit Extraktion von Knochenmark und 14 Tage später die Traumatisierung des linken Musculus soleus unter Aussparung der Gefäß- und Nerveninsertion. Bei je einer Therapie- und Kontrollgruppe wurde unmittelbar nach Trauma die Transplantation der 2,5x106 PLX-Zellen oder von 20 μl einer 0,9%igen NaCl-Lösung ohne Zellen durchgeführt. Die beiden anderen Gruppen erhielten die Transplantation sieben Tage später. Vier Wochen nach Trauma erfolgte die Kraftmessung in Fast-Twitch- und tetanischer Stimulation in vivo sowie die histologische Auswertung aller Gruppen. Ergebnisse: Die sofortige Transplantation der PLX-Zellen führte zu einer signifikanten Verbesserung der Kraft für die Fast-Twitch-Stimulation (p=0,02), jedoch nicht bei tetanischer Stimulation (p=0,18). Nach verzögerter Transplantation war die Kraft sowohl bei Fast- Twitch- (p=0,03), als auch bei Tetanie-Stimulation (p=0,04) signifikant verbessert. Zwischen den Therapiegruppen bestand kein signifikanter Unterschied bei Fast-Twitch- (p=0,6) oder Tetanie-Stimulation (p=0,9). Die histologische Auswertung ergab sowohl für die sofortige (p=0,007), als auch die verzögerte (p=0,002) Transplantation eine signifikant erhöhte Gefäßdichte. Die T-Zellzahl war ebenso für die sofortige (p=0,0002) und verzögerte (p=0,001) Transplantation signifikant erhöht. Gewebsmakrophagen waren nach verzögerter Transplantation (p=0,016), jedoch nicht nach sofortiger Transplantation (p=0,054) vermehrt nachzuweisen. Der Anteil der Fast Myosin Heavy Chain-positiven Muskelfasern war signifikant erhöht nach einer verzögerten Transplantation (p=0,04). Nach sofortiger Transplantation sahen wir keinen signifikanten Unterschied zur Kontrollgruppe (p=0,33). Schlussfolgerung: In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl die sofortige als auch die verzögerte Transplantation von menschlichen PLX-Zellen in den traumatisierten Rattenmuskel einen positiven Effekt auf die Muskelregeneration hat. Somit stellen PLX- Zellen eine ständig verfügbare Therapieoption dar. Eine Translation in die klinische Anwendung sowie eine weitere Differenzierung der Wirkungsweise ist in weiteren Studien zu untersuchen., Introduction: Skeletal muscle trauma caused by accidents or surgery may lead to a permanent impaired muscle function. The intrinsic regenerative capacity of skeletal muscle is very limited and therapeutic strategies used so far are insufficient. By previous studies a positive effect of autologous mesenchymal stem cells on the regeneration of damaged skeletal muscle in rats was shown. For a wider clinical approach and availability on demand an off- the-shelf product is needed since harvesting and expanding the cells is rather time consuming. PLX-cells harvested from human placenta seem to be an alternate therapeutic option. The goal of this study was to investigate the effects of human PLX-cells on the skeletal muscle regeneration in rats. Methods: For this study 40 Sprague Dawley rats were divided into two therapy groups and two sham groups. For a better comparability to previous studies all rats underwent a cannulation of both tibiae and bone marrow extraction. 14 days after, the left soleus muscle received an open crush trauma while preserving the insertion of the neurovascular bundle. One therapy and one sham group obtained their transplantation with 2.5x106 PLX-cells or 20 μl saline immediately after the trauma. The other groups underwent transplantation seven days later. Four weeks after the trauma in vivo functional muscle testing and a histological analysis were performed. Results: After immediate application of PLX-cells a significant improvement in muscle force for fast-twitch stimulation (p=0,02) but not for tetanic stimulation (p=0,18) was observed. For groups that received a delayed transplantation muscle force was significantly higher for both fast-twitch (p=0,03) and tetanic stimulation (p=0,04). Between the therapy groups there was no significant difference after fast-twitch (p=0,6) or tetanic stimulation (p=0,9). The histological analysis showed a significantly higher vessel density after immediate (p=0,007) and delayed (p=0,002) transplantation. Moreover, the T-cell-count was significantly higher for immediate (p=0,0002) and delayed (p=0,001) application of PLX-cells. For the delayed administration a significant difference for tissue macrophages (p=0,016) and Fast Myosin Heavy Chain-positive muscle fibers (p=0,014) was observed. Groups that underwent an immediate application of PLX-cells showed no significant difference in tissue macrophages count (p=0,054) and fast Myosin Heavy Chain-positive muscle fibers (p=0,33). Conclusion: Hereby the positive effects of an immediate and delayed application of human PLX-cells after trauma of skeletal muscle in rats was shown. Therefore PLX-cells seem to be a promising and constantly available therapeutic option. Further investigations on the effects and the clinical utilization are necessary.

Kardiovaskuläre Erkrankungen sind die führende Todesursache weltweit. Insbesondere Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz und Diabetes mellitus sind von einer vorzeitigen ausgeprägten Kalzifizierung von Arterien betroffen. Bei der Mediasklerose nehmen glatte Gefäßmuskelzellen (VSMC) durch Transdifferenzierung einen osteochondrozytären Phänotyp mit Produktion kalzifizierender extrazellulärer Matrix an. Mesenchymale Stromazellen (MSC), die u.a. im Gefäßbett als Vorläuferzellen für VSMC an Regenerationsprozessen beteiligt sind, sezernieren zahlreiche Faktoren mit parakriner Wirkung, deren therapeutisches Potenzial aktuell Gegenstand zahlreicher Studien ist. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob MSC durch parakrine Effekte die osteoblastäre Transdifferenzierung und Kalzifizierung von VSMC in einem in vitro-Modell für die Mediasklerose beeinflussen können. Hierzu wurde die Wirkung von MSC-konditioniertem Medium (MSC-KM) auf die Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) als frühem Marker der osteoblastären Differenzierung nach 7 Tagen und auf die Calciumablagerung nach 14 Tagen in VSMC untersucht, die zur osteoblastären Transdifferenzierung angeregt wurden. Im nächsten Schritt wurden Substanzen, die in das für die Differenzierung von MSC wichtige mTOR- Netzwerk eingreifen, auf ihre das MSC-Sekretom modifizierende Wirkung im Sinne einer pharmakologischen Präkonditionierung hin untersucht. Neben dem klassischen mTOR-Inhibitor Rapamycin wurden Metformin und Insulin mit inhibierender bzw. aktivierender Wirkung auf den mTOR-Signalweg verwendet. Außer Lösungsmittelkontrollen wurde von separat kultivierten VSMC konditioniertes Medium (VSMC-KM) als Kontrolle verwendet. Mittels Western-Blot-Analyse wurden die mTOR-Aktivität in den das Medium konditionierenden Zellen und Marker für Zellschicksalsprogramme in den kalzifizierenden VSMC untersucht. Die Behandlung von VSMC mit MSC-KM während der osteoblastären Transdifferenzierung reduzierte gegenüber VSMC-KM die ALP-Aktivität signifikant um ca. 25 % und die Calciumablagerungen signifikant um ca. 30 %. Durch Präkonditionierung der Spenderzellen mit Metformin und Rapamycin, nicht jedoch mit Insulin, konnte dieser Effekt signifikant gesteigert werden. Mittels Western-Blotting wurde eine stärkere basale Aktivität von AMPK und mehr an Position Serin-473 phosphoryliertes AKT in MSC verglichen mit VSMC nachgewiesen. Durch die Behandlung mit Rapamycin wurde die AMPK-Aktivität signifikant, mit Metformin in MSC zumindest tendenziell gesteigert. Die Behandlung mit Metformin und Rapamycin verminderte tendenziell die Menge von cleaved caspase 3 als Marker der Apoptose in kalzifizierenden VSMC. Auf gleiche Weise verminderte Rapamycin die Expression von p16 als Marker für zelluläre Seneszenz. Mit dieser Arbeit wurde gezeigt, dass MSC-KM glatte Gefäßmuskelzellen vor Kalzifizierung schützt. Die Präkonditionierung der MSC mit Rapamycin steigerte diesen protektiven Effekt ebenso wie die Behandlung mit Metformin. Hierbei schien Rapamycin das MSC-Sekretom positiv zu beeinflussen, während Metformin eher direkt in den Kalzifizierungsprozess eingriff. Die Verstärkung der protektiven Effekte des MSC-Sekretoms wurde vermutlich durch eine Aktivierung der AMPK hervorgerufen., Cardiovascular disease is the leading cause of mortality worldwide. Especially patients with diabetes mellitus and chronic kidney disease suffer from early vascular calcification. In the development of arteriosclerosis vascular smooth muscle cells (VSMC) transdifferentiate into osteochondrogenic cells and produce extracellular calcifying matrix, hence accelerating the calcification process. Mesenchymal stromal cells (MSC), among others serving as VSMC pregenitor cells in the vascular bed, are well known for their paracrine effects which are currently being studied. This study was designed to investigate MSC secretome’s effect on VSMC transdifferentiation and calcification in an in vitro model for arteriosclerosis. Therefore VSMC calcification was measured by alcaline phosphatase (ALP) activity – a marker for early osteoblast differentiation – after 7 days and calcium deposition after 14 days under treatment with MSC conditioned medium (MSC-CM). Further, MSC were preconditioned with drugs interacting with the mTOR pathway, a crucial signalling network for MSC differentiation. Rapamycin, a classic mTOR inhibitor, and antidiabetic drugs metformin and insulin were used, inhibiting or activating mTOR signaling, respectively. Controls were provided using conditioned media from separately cultured VSMC (VSMC-CM) with or without solvent as appropriate. Western blot analysis was performed to estimate mTOR signaling activity in media conditioning cells and cell fate markers were measured in calcifying VSMC. MSC-CM reduced ALP activity by 25 % and calcium deposition by 30 % approximately in calcifying VSMC compared to VSMC-CM. Preconditioning with metformin and rapamycin, but not with insulin, further attenuated VSMC calcification significantly. Signaling analysis showed stronger basal activity of AMPK in MSC than in VSMC and stronger 473-phosphorylation of AKT. Treatment with rapamycin significantly enhanced AMPK phosphorylation in MSC, treatment with metformin induced a trend to increased AMPK activation. Apoptosis seemed to be reduced by treatment with metformin and rapamycin, respectively, as seen in a reduction of cleaved caspase 3. Cellular senescence seemed to be alleviated by treatment with rapamycin as seen in a reduction of p16. This study showed that MSC-CM attenuates VSMC calcification. Preconditioning MSC with metformin or rapamycin enhanced beneficial effects. Whereas metformin seemed to directly protect VSMC from calcification, rapamycin modulated MSC-CM’s beneficial effects. MSC secretome seemed to be influenced by AMPK activation.

Endothelzell-basierte Therapien vermitteln regenerative Effekte hinsichtlich der Revaskularisierung von ischämischen Geweben. Doch ist die Verfügbarkeit von autologen Endothelzellen aufgrund einer krankheitsbedingt reduzierten Frequenz im peripheren Blut oder einer verminderten Integrität der endogenen Endothelzell-Populationen eingeschränkt. Hingegen ist es möglich, allogene endotheliale Vorläuferzellen aus der Nabelschnur in zelltherapeutisch relevanten Mengen zu isolieren. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst die Eigenschaften allogener humaner Nabelschnur (NS)-abgeleiteter sog. Endothelial Colony-Forming Cells (ECFCs) mit denen von venösen NS-abgeleiteten Endothelzellen verglichen. Aufgrund der nachgewiesenen Immunogenität von allogenen ECFCs wurde eine weiterführende Strategie zur Reduktion dieser immunogenen Eigenschaften durch die Koapplikation mit Mesenchymalen Vorläuferzellen (MSCs) verfolgt. Humane ECFCs wurden mit MSCs desselben Spenders kombiniert und in funktionellen in vitro- und in vivo-Assays untersucht. Dadurch konnte nachgewiesen werden, dass IFNγ-stimulierte ECFC/MSC-Kokulturen eine reduzierte Expression von HLA-Molekülen zeigen. Entsprechend induzierten spezifische CD8+ T-Zellen eine reduzierte Lyse der kokultivierten ECFCs und MSCs. Die Kokultur von ECFCs und MSCs mit allogenen Immunzellen führte zu einer nahezu vollständigen Inhibition der T-Zell-Proliferation. Um die reduzierte Immunogenität von ECFC und MSC in vivo zu verifizieren, wurden die Zellen in immundefiziente Mäuse injiziert, welche nachfolgend mit humanen PBMCs rekonstituiert wurden. So konnte nachgewiesen werden, dass die Koapplikation von ECFCs und MSCs nicht nur die Entstehung von stabilen Gefäßnetzwerken begünstigt, sondern zudem in den Transplantaten zu einer verringerten Immunzell-Infiltration führte. Die Koapplikation von ECFCs mit MSCs könnte daher eine klinische Nutzung dieser allogenen Quelle für die therapeutische Unterstützung der Vaskularisierung ermöglichen., Endothelial cell-based therapies promote tissue regeneration and vascularization after ischemic damage. The availability of autologous endothelial progenitor cells is restricted in diseased patients, however therapeutically relevant numbers of allogeneic Endothelial Progenitor Cells can be isolated from an umbilical cord (UC). In the present study, the immunogenic properties of these Endothelial Colony Forming Cells (ECFCs) were first compared to human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Both cytokine-treated endothelial cells induced CD4+ and CD8+ T cell proliferation after coculture with allogeneic immune cells. So far, the potential interactions between ECFCs and Mesenchymal Stem/Progenitor Cells (MSCs) concerning their immunological features is poorly understood, but we hypothesize that MSCs might improve the immune compatibility and vessel building characteristics of ECFCs. Therefore, human UC-derived ECFC and MSC cocultures from the same donor were analyzed using various functional in vitro and in vivo assays. Stimulation of these cocultures with IFNγ caused strongly reduced expression levels of HLA-molecules compared to ECFC monocultures. The decreased molecular density on the cocultured ECFCs resulted in reduced cytotoxic CD8+ T cell-mediated lysis. Further, during IFNγ stimulation, the combination of ECFCs with MSCs prevented initiation of allogeneic T cell proliferation. To verify this concept in vivo, ECFCs and MSCs were co-transplanted in a humanized allograft mouse model in immunodeficient mice in order to effectively induce stable microvessels. These experiments demonstrate that when MSCs are co-applied with ECFCs, they not only support the formation of stable blood vessels, but also lead to fewer HLA-DR+ human vascular structures and fewer infiltrating human leukocytes. The data presented indicate that crosstalk between UC-derived ECFCs and MSCs might lower the risk of allogeneic ECFC rejection.

Von neuralen Stammzellen (NSC) und deren autologer Transplantation erhofft man sich, dass sie genetisch identische, gesunde Gewebe kreieren können, die zerstörtes ZNS (Zentrales Nervensystem)-Gewebe ersetzen, indem neurotrophe Faktoren sezerniert, neuroinflammatorische Prozesse reduziert und die Neurogenese sowie nichtneuronaler Zellersatz gefördert werden. Insbesondere im Rahmen neurodegenerativer Erkrankungen wie Morbus Parkinson, Chorea Huntington oder Morbus Alzheimer, aber auch nach ischämischen/traumatischen ZNS-Erkrankungen bzw. Gehirntumoren könnten sie Therapieoptionen darstellen. Neurogenese ist modifizierbar; diverse physiologische, pathologische, chemische bzw. ex- und intrinsische Faktoren haben Einfluss auf Proliferation und Differenzierung. Die Differenzierbarkeit einer Stammzelle ist nicht auf Zelllinien ihres Keimblattes begrenzt, sie kann auch in eine Zelle, die nicht der ursprünglichen Zelllinie zugehört, differenzieren (Transdifferenzierung). Mesenchymale Knochenmarksstromazellen (MSC) können in Neurone differenzieren (mNSC). MSC haben auch direkt Einfluss auf die Neurogenese. Der direkte Effekt von mNSC wurde bis dato noch nicht untersucht. In dieser Arbeit wurde das Proliferations- und Differenzierungsverhalten embryonaler neuraler Ratten- (ratNSC) bzw. Mäusestammzellen, die einen gelb fluoreszierenden Farbstoff überexprimierten (YFP-mouseNSC) unter Zellkulturbedingungen mittels indirekter Immunfluoreszenzfärbung untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Hypoxie (3% O2) die Proliferation von NSC hochsignifikant reduziert (von 20,6% auf 8,5%), möglicherweise durch Verringerung der Zelldichte und dadurch verringerte Zellvitalität. Gegebenenfalls bildete auch die als Maß für die Proliferation verwendete Bromodesoxyuridin (BrdU)-Inkorporation die Ergebnisse falsch ab, da BrdU auch in apoptotische Zellen inkorporiert wird und somit falsch hohe Proliferationsraten liefert. Folgeversuche sollten ergänzende FACS-Analysen des Zellzyklus beinhalten. mNSC-Überstand reduzierte in Suspensionskultur sowohl Zelltod (im Falle der ratNSC von 17,9% auf 6,4%, im Falle der YFP-mouseNSC von 21,6% auf 7,4%) als auch Proliferation (ratNSC: von 37,4% auf 23,9%; YFP-mouseNSC: von 64,6% auf 48,9%) von NSC signifikant. In adhärenter Kultur hingegen steigerte er die Zellproliferation signifikant (von einer Wachstumsrate von 0,04 pro Tag auf mindestens 0,34 pro Tag). Reduzierter Zelltod und gesteigerte Proliferation beruhen am ehesten auf während der Transdifferenzierung sezernierten löslichen Faktoren, während die mutmaßlich reduzierte Proliferationsrate in Suspensionskultur erneut der Proliferationsmessung mittels BrdU geschuldet gewesen sein könnte, welche die spontane Apoptose der NSC durch Anoikis als hohe Proliferationsrate zeigte, während der Zelltod reduzierende Effekt des Überstandes eine mutmaßlich geringere Proliferation ergab. In direkter Kokultur von mNSC mit NSC kam es zu hochsignifikant gesteigerten Proliferationsraten im Vergleich zu Kontrollen (Steigerung der Wachstumsrate von 0,03 auf 0,27 pro Tag bei Zugabe von 19000 Zellen). Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass es dabei auf mRNA- und Proteinebene zu einer Hochregulierung von zytotrophischen Faktoren kommt, die zum Teil neuroprotektiv wirken. Insgesamt jedoch ist die neuronale Differenzierungskapazität von MSC limitiert. Mittlerweile können mit Verfahren, die die heterologe Expression verschiedener Transkriptionsfaktor-Kombinationen nutzen, NSC aus Fibroblasten generiert und expandiert werden – sog. induzierte pluripotente Stammzellen-, die die Haupteigenschaften primärer NSC besitzen. In zukünftigen Studien sollte der Effekt dieser Zellen in Kokultur mit primären NSC untersucht werden. Interleukin-1ß, Interleukin-11, Leukemia inhibitory Factor und Forskolin begünstigten eine neuronale Differenzierung von NSC. IL-1ß z. B., inhibiert unter anderem die Differenzierung hippokampaler neuronaler Vorläuferzellen in serotonerge Neurone, gleichzeitig fördert es im Rahmen von Schlafentzug die neuronale Zellproliferation. Bekannte Effekte dieser Faktoren konnten somit bestätigt werden. Retrospektiv wäre es jedoch sinnvoller gewesen, klar synergistisch wirkende Faktoren zu verwenden, um deren Effekt besser spezifizieren zu können. Die in dieser Arbeit verwendeten in vitro Kulturbedingungen können die Situation in vivo naturgemäß nur begrenzt widerspiegeln, weshalb es in folgenden Arbeiten sinnvoll wäre, anhand von in vivo Modellen zu überprüfen, inwieweit die untersuchten Effekte auf Differenzierung und Proliferation Bestand haben.

Obwohl Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) die häufigste Todesursache weltweit darstellen, fehlen trotz intensiven Bemühungen durchgreifende Behandlungskonzepte und überzeugende Präventionsstrategien. Ziel dieser Arbeit war es, die zugrunde liegenden Mechanismen der vaskulären Kalzifizierung, eine der wichtigsten Ursachen für CVD, zu analysieren und eine therapeutische Option auszuarbeiten. Um den fehlgeleiteten Prozess der extraossären Kalzifizierung in der Gefäßwand zu ergründen, wurde in einem in vitro Modell untersucht, wie Programme kontrolliert werden, welche die Differenzierung und Entwicklung von humanen Vorläuferzellen des vaskulären Systems steuern. Als potente und zentrale Regulationseinheit der Zelle um auf Stress,Wachstumsfaktoren und Nährstoffe zu reagieren wurde das mTOR-Netzwerk mit seinen beiden strukturell und funktionell verschiedenen Multiproteinkomplexen für die steuernden Befehle in Betracht gezogen und zur Beeinflussung der Prozesse anvisiert. Rapamycin diente der gezielten pharmakologischen Modulation des Netzwerks während der osteoblastären Differenzierung, die ebenso wie die Menge der Kalziumablagerung, die Aktivität der mTOR-Komplexe und die der Zellschicksalsprogramme während des 21-tägigen Prozesses der Kalzifizierung kontinuierlich analysiert wurden. Die Blockade von mTORC1 offenbarte eine zentrale Rolle von mTORC2 für die Induktion protektiver Zellprogramme, die durch den Einsatz eines pharmakologischen Inhibitors und durch genetischen Knockout bestätigt wurde. Der benefizielle Einfluss der mTORC2-Aktivität auf die zellulären Prozesse der Gefäßwand konnte in-vivo durch die Behandlung von Mäusen mit Rapamycin über 37 Tage mit anschließender immunohistologischer Untersuchung der Aorten bestätigt werden. In einem Medium-Transfer-Modell wurde außerdem der durch Rapamycin ausgelöste günstige parakrine Effekt von MSCs auf glatte Muskelzellen bei osteoblastärer Differenzierung untersucht. Die Modulation des mTOR-Netzwerks führte über die Induktion von Autophagie und Verminderung von Seneszenz und Apoptoseprozessen zu einer Reduktion der Kalzifizierung, die durch gezielte Inaktivierung des mTOR-Komplexes 2 verhindert werden konnte. Die Kontrolle der mTORC1-Aktivität zusammen mit einer Verstärkung der mTORC2-Funktionen bietet die Möglichkeit, schützende Zellprogramme und endogene parakrine Effekte für die Behandlung fortschreitender Arteriosklerose einzusetzen. Außerdem konnte festgestellt werden, dass die Modulation des mTOR-Netzwerks das zelleigene regenerative Potential schützt, was, ebenso wie die gezielte Aktivierung von mTORC1, bedeutsam für die spezifische Induktion von Knochenbildung im Rahmen einer lokalen Therapie zur Knochenregeneration bei Osteoporosefrakturen sein könnte., Cardiovascular disease (CVD) is the most prominent contributor to global mortality and concepts for treatment as well as compelling prevention strategies are missing. In our study, we provide new insights in the underlying processes for vascular calcification, one basic pillar of CVD, by analysing cell fate programs and their regulation in human cells involved in vascular biology. Accelerated calcifying arteriosclerosis features osteoblastic transformation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) and their progenitors, mesenchymal stromal cells (MSCs). Targeting signaling pathways controlling cell differentiation could shift maladaptive cell fate programs towards protective and prevent from vascular calcification. mTOR kinase contained in two functionally and structurally distinct multiprotein complexes mTORC1 and mTORC2 integrates extracellular stimuli into cell differentiation and growth responses. We hypothesize distinct roles for mTORC1 and mTORC2 in regulation of cell fate programs in a temporally controlled sequence. Rapamycin served for pharmacologic mTOR targeting during osteoblastic differentiation of MSCs. Matrix calcium deposition, mTORC1 and mTORC2 targets, and cell fate programs were followed for 21 days. Central role of mTORC2 in induction of protective cell fate programs was determined by AKT blockade, genetic disruption of mTORC2 function and autophagy inhibition. Beneficial Effects of mTORC2 acitivation on vascular cells induced by mTORC1 blockade were confirmed in vivo by low dose-rapamycin injection into mice and immunohistochemical analysis of aortas after 37 days treatment. Paracrine effects of rapamycin conditioned MSCs on VSMCs undergoing osteoblastic transformation were assessed by medium transfer. Attenuation of mTORC1 and activation of mTORC2 downstream signaling effectors inhibited calcification via induction of autophagy and down-regulation of proteins mediating apoptosis and cell senescence. Negative interference with mTORC2 function or autophagy disrupted protective programs via induction of apoptosis and cell senescence. Secretome of rapamycin conditioned MSCs mitigated osteoblastic transformation of VSMCs. Control of mTORC1 activation together with enhancement of mTORC2 function leads to induction of autophagy and maintenance of protective cell fate programs during osteoblastic transformation. Regenerative approaches aiming to translate our findings hold promise for treatment of accelerated arteriosclerosis. Furthermore, modulation of the mTOR signalling protects the endogenous regeneration capacity of osteoblast precursor cells and provides new options for specific induction of bone formation in osteoporosis.

Mesenchymale Stammzellen (MSC) sind adulte Stammzellen, die in diversen Geweben des menschlichen Körpers wie beispielsweise dem Fett, dem Knochenmark und der Haut vorkommen. Sie besitzen die Fähigkeit zur multilineären Differenzierung und wecken aus diesem Grund große Hoffnung in der regenerativen Medizin. In dieser Arbeit wurde eine neue MSC-Subpopulation in der humanen Dermis beschrieben, die den Adenosintriphosphat- (ATP-) Transporter ATP-bining cassette transporter 5 (ABCB5) in der Zellmembran exprimiert und dessen Erkennung in vitro und in vivo anhand dieses Antigens erfolgte. Die Charakterisierung der Zellen erfolgte anhand der Morphologie und des Verhaltens in Kultur, des Profils an Oberflächenmarkern und der Differenzierungsfähigkeit in die drei mesenchymalen Linien. Die neue ABCB5+ MSC-Subpopulation erfüllte alle Kriterien für mesenchymale Stammzellen (Morphologie, Adhärenz an Plastik, Expression bestimmter Pberflächenmarker, Differenzierungspotential). Es wurde gezeigt, dass die dermale ABCB5+ MSC-Subpopulation in der Haut in Nischen lokalisiert ist, die im Laufe des Lebens wechseln. Zellen junger Individuen zeigten gehäuft eine perivaskuläre Lokalisation, Zellen alter Individuen liegen meist interfollikulär. Weiterhin fiel eine starke Abnahme der Zellzahl in alten Individuen auf. Um die mögliche Ursache dieser Abnahme zu identifizieren, wurde das Apoptoseverhalten dieser Zellen untersucht. Die Anzahl apoptotischer Zellen steigt im Alter sowohl spontan, als auch nach induziertem Zellstress deutlich an. Zur Ursachenklärung wurden verschiedene DNA-Schadensantworten in den ABCB5+ MSC überprüft. Es wurde gezeigt, dass in Zellen alter Individuen DNA-Doppelstrangbrüche akkumulieren und die Expression von Genen ansteigt, die eine Rolle im Nukleotidexzisionsreparatur-System spielen. Die Expression des anti-apoptotischen und -proliferativen Gens BTG2 (B cell translocation gene 2) sinkt hingegen in der Expression in Zellen alter Individuen.

Hexagonally arranged gold nanoparticles with controllable diameters and interparticle distances were deposited on thick SiO2 layers on top of Si wafers and used as masks during subsequent reactive ion etching. In this way, arrays of nanopillars are obtained with well-defined diameters (10/30 nm), inter-pillar distances (50 - 120 nm) and heights (20 - 50 nm), all on the nanoscale. Such nanotopographies served as substrate for mesenchymal stromal cells (MSC) and human osteoblasts (OB) allowing to study cellular responses to purely topographically patterned interfaces. Focus was put on adhesion, proliferation and differentiation of the cells. It turned out experimentally that adhesion is comparable for both cell types practically independent of topographical details at the substrate surface. Topography induced proliferation enhancement, however, is again independent of geometrical details in case of MSC, but significantly sensitive to pillar height in case of OB with a clear preference towards short nanopillars (20 nm). A high sensitivity to topographic details is also observed for osteogenic differentiation of MSC, in that case with a preference towards higher nanopillars (50 nm). The present experimental data also allow the important conclusion that cell proliferation and differentiation can be optimized simultaneously by fine-tuning nanoscaled topographical parameters.

In dieser Arbeit wurden Zellen aus humanen Speicheldrüsenpräparaten isoliert und in Zellkultur überführt. Hierbei zeigte sich ein über 17 Passagen erhaltenes Wachstum der Zellen, adhärent auf Polystyrol-Zellkulturflaschen. Morphologie und Wachstumseigenschaften waren vergleichbar mit den parallel kultivierten mesenchymalen Stammzellen (MSC) aus humanem Knochenmark. Die isolierten Zellen wiesen in ihrem Immunphänotyp und in ihrem Differenzierungspotenzial MSC Charakteristik auf und konnten als human Salivary Gland Stem Cells (hSGSC) bezeichnet werden. Durchflusszytometrisch wurden klassische MSC Marker wie CD29, CD44, CD54, CD73, CD90 und CD105 nachgewiesen. Im Vergleich zu den CD34 negativen MSC aus humanem Knochenmark wurde bei den untersuchten hSGSC eine geringe Expression von CD34 detektiert. Marker wie das MSCA-1, CD117, STRO-1 und CD271 wurden in unterschiedlichem Ausmaß exprimiert und bestätigen den Stammzellcharakter der isolierten Zellen. Die Differenzierung der hSGSC erfolgte zur Darstellung ihrer multipotenten Stammzellcharakteristik in adipogene, osteogene und chondrogene Zellen. Der Nachweis der Differenzierung erfolgte mittels histologischer und immunhistochemischer Methoden. Um die Möglichkeit einer künftigen Verwendung dieser Zellen in regenerativen Modellen zur Behandlung der irreversiblen Speicheldrüsenschädigung zu testen, erfolgte die in-vitro Differenzierung der hSGSC in Azinuszellen. Hierfür stellte sich reines Matrigel als die am besten geeignete dreidimensionale Matrix heraus und wurde in Kombination mit einem spezifischen Differenzierungsmedium verwendet. Der Nachweis der stattgefundenen Differenzierung erfolgte nach morphologischen Kriterien sowie durch histologische und immunhistochemische Färbemethoden. Mit dem Wissen des in-vitro Potenzials der hSGSC sind regenerative Strategien zur Behandlung der radiogenen Speicheldrüsenschädigung durch Methoden des Tissue Engineering oder der Stammzelltherapie potenziell möglich.

Mesenchymale Stromazellen (MSC) werden wegen ihrer guten therapeutischen Einsetzbarkeit im Tissue Engineering und in der Stammzelltherapie zurzeit intensiv erforscht. In den meisten Isolations- und Vermehrungsprotokollen von MSC wird fötales Kälberserum (FCS) zugesetzt. Dieser Zusatz stellt jedoch ein potentielles Risiko für Infektionen und immunologische Reaktionen dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Alternativen zu FCS gesucht, dabei war vor allem eine gute Expansion der MSC wichtig. FCS sollte durch das Thrombozytenlysat vollständig ersetzt werden, unter Beibehaltung der gleichen bzw. größeren Menge an MSC. Wir erforschten den Effekt von verschieden Ausgangspräparaten und Bearbeitungsformen auf das Wachstum von MSC. Insgesamt wurden 17 verschiedene Thrombozytenlysate getestet. Vor Beginn der Versuche wurde ein Verfahren etabliert, welches weniger zeit- und arbeitsintensiv gegenüber den herkömmlichen Auszählmethoden ist. Die Versuchsreihen zeigen, dass die Expansion mit Thrombozytenlysat signifikant besser ist, als mit FCS. Unterschiedliche Thrombozytenlysate wurden miteinander verglichen, dabei gab es signifikante Unterschiede zwischen ihnen. Aufgrund dieser Unterschiede in der Proliferation und der technischen Umsetzbarkeit wurde ein Einfrierprotokoll erarbeitet. Wir entschieden uns darin abgelaufene Thrombozytenkonzentrate, in T-Sol gelagert, langsam einzufrieren. Diese Vorgehensweise führte zu einer Verbesserung der Expansion von MSC in vitro. Es konnte auch die Bedeutung einzelner Inhaltsstoffen von Thrombozytenkonzentraten untermauert werden, wie z. B. Fibroblasten Wachstumsfaktor (bFGF), thrombozytenabgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF) und Albumin. Durch das neue Expansionsmedium von MSC ohne eine xenogene Komponente konnte ein großer Schritt in Richtung klinischer Anwendung getan werden.