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Eine entscheidende Rolle im Fortschreiten des sich epidemieartig ausbreitenden Typ 2 Diabetes Mellitus (T2DM) kommt den freien Fettsäuren (FFA) zu. Besonders die gesättigte Fettsäure Palmitat ist hierbei ins Zentrum der Forschung gerückt, da sie in der Lage ist, den überlebenswichtigen Insulinsignalweg zu unterbrechen, welcher nach Andocken des anabolen und zellprotektiven Hormons an den Insulinrezeptor ausgelöst wird. Erhöhte Blutspiegel an FFA, insbesondere Palmitat, korrelieren demnach direkt mit dem Schweregrad der beim T2DM auftretenden Insulinresistenz, und Palmitat ist in der Lage, den Insulinsignalweg direkt durch negative Regulation der dem Insulinrezeptor nachgeschalteten PI3K / Akt- Signalkaskade zu unterbrechen. Es ist aber nicht nur das Palmitat selbst, das eine solche Hemmung auslösen kann, sondern auch aus Palmitat gebildete Metabolite wie Ceramid, ein Sphingolipid, sind zur Hemmung der Akt- Aktivität befähigt. Ebenfalls das weniger gut erforschte Sphingolipid Sphingosin-1-phosphat (S1P) ist in vielen Zellen in der Lage, hemmend auf den Insulinsignalweg einzuwirken. In der vorliegenden Arbeit sollte nun gezeigt werden, ob auch in pankreatischen Beta-Zellen eine solche Hemmung des Insulinsignalwegs durch S1P feststellbar ist und inwiefern eine derartige Wechselwirkung in Bezug auf Erkrankungen der pankreatischen Beta- Zellen wie T2DM von Bedeutung sein können. \\\ Zunächst interessant war, dass es besonders bei diabetischen Mäusen in Folge von fettreicher Nahrung zu einem starken Anstieg der S1P- Spiegel im Vergleich zu nicht- diabetischen Mäusen kam. Des Weiteren konnte bewiesen werden, dass in der Beta-Zelle die Umwandlung von Palmitat zu S1P in Abhängigkeit von der Serin-Palmitoyl- Transferase verläuft, dies aber nicht die einzige S1P-Quelle in der Beta-Zelle darstellt. Zusätzlich ist Palmitat in der Lage, die Expression der auf- und abbauenden Enzyme des S1P so zu regulieren, dass eine massive Akkumulation von S1P in den Beta-Zellen begünstigt wird. \\\ S1P ist ein elementarer Bestandteil der Zellmembranen, kann aber über intrazelluläre Wirkungen und seine fünf membranständigen, G-Proteingekoppelten Rezeptoren auch maßgeblich Einfluß auf viele Vorgänge in der Zelle nehmen. Eine besondere Rolle spielt S1P meist im Zellüberleben und in der Zellproliferation, wobei die Wirkungen aber stark vom Expressionsmuster der S1P- Rezeptoren auf der Zelloberfläche abhängig sind, da diese sehr unterschiedliche, teilweise sogar gegenläufige Effekte vermitteln können. \\\ Im Rahmen dieser Arbeit konnte in der pankreatischen Betazelllinie MIN-6 eine verhältnismäßig starke Expression des S1P2- Rezeptors belegt werden. Des Weiteren konnte eine über den S1P2- Rezeptor vermittelte, hemmende Wirkung des S1P auf die insulinvermittelte Akt- Phosphorylierung ermittelt werden. Auch die insulinvermittelten, zellprotektiven Mechanismen wie Proliferation und Apoptosehemmung konnten durch S1P über den S1P2- Rezeptor unterbrochen werden. Eine Beteiligung von S1P an der negativen Wirkung des Palmitats auf den Insulinsignalweg über den S1P2- Rezeptor konnte ebenfalls belegt werden. Bei Betrachtung dieser desaströsen Wirkungen von S1P auf die Beta-Zelle sollte aber nicht außer Acht gelassen werden, dass diese exklusiv über den S1P2- Rezeptor vermittelt werden. Über andere Rezeptoren wie S1P1 oder S1P3 kann S1P auch zellprotektiv wirken. Dies wird besonders in der Haut deutlich, wo innerhalb einer Versuchsreihe der vorliegenden Arbeit bewiesen werden konnte, dass S1P über eine erhöhte Bildung von Stickstoffmonoxid (NO) und eine Aktivierung der endothelialen NO-Synthase eNOS primäre Keratinozyten vor der Apoptose schützen kann. Dieser Mechanismus konnte aber exklusiv auf den S1P3- Rezeptor zurückgeführt werden. Die Abhängigkeit der in dieser Arbeit erforschten hemmenden Wirkungen des S1P vom S1P2- Rezeptor könnten einen Ansatzpunkt für zukünftige Therapien darstellen, indem über die therapeutische Verwendung von S1P- Agonisten, welche nicht an den S1P2-Rezeptor binden, die positiven Wirkungen des S1P über andere Rezeptoren wie den S1P1- und 3- Rezeptor in den Vordergrund gerückt werden., Free fatty acids (FFA) inherit a crucial role in the progression of the epidemic spreading disease type 2 diabetes mellitus (T2DM). Hereby, particularly the saturated fatty acid palmitate is placed at the center of research, since it is in a position to interrupt the insulin signaling, which is elemental for the survival of the cell. The insulin pathway is normally actived, if the anabolic and cellprotective hormone insulin binds to the insulin receptor. Elevated FFA levels, especially palmitate, directly correlate with the severity of insulinresistance and palmitate can directly inhibit the insulin pathway by negatively regulating the PI3K / Akt signaling cascade downstream of the insulin receptor. \\\ But it is not only palmitate itself, which can cause such an inhibition, but also metabolites built from palmitate like ceramide, a sphingolipid, which can also inhibit Akt activation. But also sphingosine-1-phosphate (S1P), a relatively less well researched sphingolipid, can negatively influence the insulin signaling pathway in many cell lines. \\\ In the present study it was to be shown, whether S1P is also able to inhibit the insulin signaling pathway in pancreatic beta cells and how such an interaction may be important in terms of pancreatic diseases of the beta-cell like T2DM. First it was of interest that, as a result of high fat feeding, it comes to a sharp increase in S1P levels in diabetic mice compared to non-diabetic littermates. It was also shown, that a palmitate oversupply in the beta-cell can lead to the generation of S1P, which is dependant on the serine palmitoyl transferase. But it was clear, that this is not the only source of S1P in the beta-cell. Additionally, palmitate can regulate the expression of S1P-building and S1P-degrading enzymes in a way that leads to a massive accumulation of S1P. S1P is an elementary component of the cell membrane, but it can also elicit intracellular effects as well as effects via its five membranebound G-proteincoupled receptors. It's effects are highly dependant on the expression pattern of the S1P receptors at the cell surface, because these receptors can mediate very different, sometimes even contrary effects. In this work, a relatively strong expression of the S1P2-receptor could be observed in the pancreatic beta-cell line MIN-6. Furthermore, an S1P2 dependant, inhibitory effect of S1P on the insulinmediated Akt- phosphorylation could be observed, as well as an inhibition of insulin mediated proliferative and antiapoptotic signalingm which was also mediated via the S1P2-receptor. A participation of S1P on the negative effects of palmitate on insulin signaling via the S1P2-receptor could also be assigned. In considering these disastrous effects of S1P on the beta- cell it should not be ignored, that these effects are exclusively mediated via the S1P2-receptor. But S1P can also be cellprotective via the S1P1 or the S1P3 receptor. This is particularly evident in the skin, where it could be proven in one series of experiments of the present study, that S1P can protect primary keratinocytes from apoptosis via the activation of the endothelial nitric oxide synthase eNOS and subsequent production of nitric oxide. This mechanism could be traced back exclusively to a signaling via the S1P3 - receptor. The dependence of the inhibitory effects of S1P on the S1P2 - receptor studied in this work could provide a starting point for future therapies. By using S1P agonists, which do not bind to the S1P2- receptor, the positive effects of S1P on other receptors such as the S1P1 - and the S1P3 - receptor could be brought to the fore.

Hintergrund: Sphingosin-1-Phosphat (S1P) fungiert in zahlreichen Signalwegen als zentraler bioaktiver Mediator, sowohl intrazellulär als Second Messenger als auch extrazellulär über eine Familie G-Protein-gekoppelter Rezeptoren, S1P1-S1P5. Die Synthese von S1P wird in der Lunge primär durch die Sphingosinkinase-1 (SphK1) katalysiert. Das SphK/S1P-System spielt eine zentrale Rolle in der Regulation des pulmonalen Gefäß- und Atemwegstonus sowie in der Modulation proinflammatorischer Prozesse wie Migration und Aktivierung verschiedener Leukozyten-Subpopulationen. Immunologische Prozesse scheinen in der Pathogenese der pulmonalarteriellen Hypertonie (PAH) eine zentrale Rolle zu spielen. Bei Mäusen führt die pulmonale TH2-Inflammation zu morphologischen und funktionellen Veränderungen, die typisch für die PAH sind, einschließlich perivaskulärer Leukozyteninfiltration, pulmonalarteriellem Remodeling und pulmonalvaskulärer Hyperreagibilität (PVH) auf vasokonstriktorische Stimuli. In dieser Arbeit wurde die Rolle des SphK/S1P-Systems in der akuten und chronischen pulmonalen TH2-Inflammation mit Hilfe SphK1- (SphK1-/-) und S1P4-defizienter Mäuse (S1P4-/-) untersucht. Zudem erfolgte erstmals eine detaillierte Charakterisierung des humanen SphK/S1P-Expressionsprofils der Lunge, inklusive vergleichender Analysen zwischen Patienten mit und ohne chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD). Methoden: SphK1-/-- und Wildtyp-Mäuse (WT) wurden gegenüber Ovalbumin (OVA) sensibilisiert und nach akutem oder chronischem Regime atemwegsexponiert. Neben vergleichenden Analysen funktioneller pulmonaler Parameter in isoliert perfundierten und ventilierten Mauslungen (IPML) erfolgten Untersuchungen der bronchoalveolären Lavage (BAL) sowie differenzierte histologische Analysen des pulmonalarteriellen Remodelings. S1P4-/-- und WT-Mäuse wurden unter akuter pulmonaler TH2-Inflammation sowie in TH1- und TH2-assoziierten Hypersensitivitäts-Modellen untersucht. Neben funktionellen Untersuchungen (IPML) erfolgten Zytokinanalysen und diverse In-vitro-Studien. Unter Einsatz humanen Lungengewebes wurden die mRNA-Expressionsprofile beider SphK- Isoformen, der S1P-Rezeptor-Familie sowie der S1P-degradierenden Enzyme von 25 COPD- und 24 Nicht-COPD-Patienten vergleichend analysiert. Ergebnisse: Die SphK1-Defizienz führte im Vergleich zu den WT-Tieren zu einer verringerten akuten pulmonalen TH2-Inflammation und reduzierter Atemwegshyperreagibilität (AHR) bei unveränderter PVH. Bei chronischer Inflammation war hingegen eine deutlich elevierte PVH in den SphK-/--Mäusen detektierbar sowie ein ausgeprägtes pulmonalarterielles Remodeling, charakterisiert durch intimale Neomuskularisation. Die S1P4-Defizienz hatte eine Aggravierung der akuten pulmonalen TH2-Inflammation und AHR zur Folge, bei zugleich reduzierten Interleukin (IL)-17-Spiegeln der BAL. Die PVH zeigte sich unverändert. In den Hypersensitivitäts-Modellen zeigten sich eine erhöhte TH2-und eine verminderte TH1-Antwort bei S1P4-Defizienz. In-vitro-Untersuchungen ergaben reduzierte IL-17-Spiegel nach CD4+-Zell-Aktivierung durch S1P4-/- dendritische Zellen. Die Expressionsanalysen des humanen Lungengewebes wiesen eine bei COPD- Patienten im Vergleich zu Nicht-COPD-Patienten verringerte Expression von S1P5 nach. Schlussfolgerung: Diese Daten zeigen erstmals eine deutliche Dissoziation TH2-induzierter Atemwegs- und Gefäßpathologie: Während sich die SphK1-Defizienz protektiv auf Inflammation und AHR auswirkt, kommt es zu einer Aggravierung der PVH bei zugleich ausgeprägtem pulmonalvaskulärem Remodeling. Neben der vielfach postulierten Relevanz in der Entstehung von Asthma bronchiale, könnte das SphK/S1P-System eine zentrale Rolle in der Pathogenese der PAH spielen. S1P4 scheint wesentlich an der Modulation der allergischen Atemwegsinflammation und AHR des SphK/S1P-Systems beteiligt zu sein. Die stark verringerten IL-17-Spiegel bei S1P4-Defizienz deuten auf eine Inhibition der TH17-Zelldifferenzierung hin. Die Ursache und Bedeutung der verringerten Expression von S1P5 bei COPD ist gegenwärtig unklar. Aufgrund des komplexen Zusammenspiels der einzelnen Komponenten des SphK/S1P-Systems sind weitere Untersuchungen erforderlich, um gezielte pharmakologische Interventionen des SphK/S1P-Systems bei pulmonalen Erkrankungen wie PAH, Asthma bronchiale und COPD etablieren zu können., Introduction: Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a fatal condition characterized by increased pulmonary vascular resistance, pulmonary arterial remodeling and right heart failure. Pulmonary Th2 inflammation induces morphological and functional changes which resemble those observed in PAH, including perivascular inflammation, pulmonary vascular hyperresponsiveness and pulmonary arterial remodeling. The bioactive sphingolipid sphingosine-1-phosphate (S1P) acts through five G-protein coupled receptors, S1P1-S1P5, as a vasoconstrictor and an important modulator of immune signaling. In the lung, S1P is predominantly synthetized by sphingosine kinase 1 (SphK1). Methods: SphK1-deficient mice (SphK1-/-), S1P4-deficient mice (S1P4-/-) and the corresponding wild-type mice (wt) were employed in acute and chronic ovalbumin-evoked pulmonary inflammation. The effects of SphK1- and S1P4-deficiency on inflammation, airway responsiveness, pulmonary vascular responsiveness and pulmonary arterial remodeling were investigated. Results: Acute inflammation was accompanied by airway and pulmonary vascular hyperresponsiveness. Airway inflammation and hyperresponsiveness were reduced in SphK1-/- mice, while being aggravated in S1P4-/- mice as compared to wt mice. Pulmonary vascular hyperresponsiveness did not differ between strains. After chronic Th2 inflammation, SphK1-/- mice showed an increased vascular hyperresponsiveness compared with wt mice accompanied by remodeling of the small and intra-acinar arteries. A linear regression between functional and morphometric vascular data could be shown. Conclusion: The SphK/S1P system may play a protective role in the pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. Moreover, this study provides further evidence for the relevance of the SphK/S1P system in allergic airway disease and is the first demonstration of a dissociation between airway and vascular pathology induced by Th2-type of inflammation.

Sphingosin-1-Phosphat (S1P) stellt einen neuen biologischen Mediator dar, für den eine multilaterale Modulation vieler immunologischer Mechanismen bereits nachgewiesen werden konnte. In diesem Zusammenhang führt die topische Applikation von S1P in einem Tiermodell der experimentellen Atopischen Dermatitis zu einer abgeschwächten Hautentzündungsreaktion. Im Rahmen dieser Arbeit kann zum ersten Mal eine Modulation der dendritischen Zellen (DC`s) durch S1P nachgewiesen werden, die bei einer topischen Behandlung zu einer anti-inflammatorischen Wirkung beiträgt. Diese beruht auf einer Beeinflussung der essentiellen Phase der immunologischen DC-Aktivierung, die durch die Endozytose von Antigenen geprägt ist. Tatsächlich kann eine konzentrationsabhängige Reduktion der endozytotischen Kapazität in unreifen DC`s durch S1P ermittelt werden. In der vorliegenden Arbeit war es zudem von großem Interesse die molekularen Mechanismen aufzuklären, die zu der entsprechenden Reduktion der Endozytose durch S1P führen. Für die Aufnahme von Antigenen durch die unreifen DC`s aus ihrer unmittelbaren Umgebung stehen mehrere Endozytosemechanismen zur Verfügung. Tatsächlich kann für S1P die Reduktion der unspezifischen Flüssigkeitsaufnahme und der darin gelösten Antigene bzw. der Makropinozytose nachgewiesen werden. Die Untersuchung des dafür verantwortlichen Signalwegs zeigt die bereits etablierte Regulation der Phosphoinositid 3-Kinase-Aktivität als Ursache für das veränderte Endozytoseverhalten der unreifen DC`s, welche durch die Stimulation des S1P2-Rezeptorsubtyps bewerkstelligt wird. Darüber hinaus liefert die Erniedrigung der S1P2-Rezeptorexpression einen Hinweis auf eine endogene Regulation der Endozytose durch S1P in unreifen DC`s. So kann im Zuge dieser Arbeit ein autokriner Mechanismus unter Beteiligung des Lipidmediators in den DC`s postuliert werden. Dabei zeigt die Steigerung der endogenen S1P-Synthese mittels pharmakologischer Sphingosinkinase1-Aktivierung die erwartete Reduktion der endozytotischen Kapazität. Die Analyse des für die transmembranäre Translokation von S1P verantwortlichen Mechanismus kann ebenfalls näher identifiziert werden. Der Einsatz verschiedener, spezifischer Hemmstoffe bestätigt die Einbindung des ABCC1-Transporters. Die vorliegenden Untersuchungen zeigen somit eine essentielle Rolle von S1P bei der Endozytose der unreifen DC`s. Da die Antigenaufnahme den Initialschritt in der Immunkaskade darstellt, kann die Aufklärung der damit verbundenen Signalwege zur Etablierung neuer Therapien entzündlicher Erkrankungen wie der Atopischen Dermatitis maßgeblich beitragen., The lipid mediator sphingosine 1-phosphate (S1P) has been identified as a new biological molecule that is involved in the modulation of multilateral immunological processes. In this context, topically administrated S1P inhibits the inflammatory reaction in an animal model of atopic dermatitis. Furthermore, for the first time the present work supplies clear evidence that a modulation of dendritic cell (DC) function contributes to the observed anti- inflammatory effect of local S1P application. The presence of S1P influences the essential step of DC activation, which is characterized by endocytosis of antigens. Stimulation of immature DC`s with S1P demonstrates a dose dependant reduction of antigen capture by these antigen presenting cells. In the present work, it was of great interest to specify the molecular mechanisms that lead to the S1P-induced reduction of endocytosis in immature skin DC`s. In an immature stage, DC`s are able to take up antigens via several different mechanisms. An examination of a mechanism affected by S1P indicated that this sphingolipid inhibits the screening of large volumes of fluid for antigens during macropinocytosis in DC`s. The present study shows that macropinocytosis is mediated by modulation of the PI3K activity, allowing a fine-tuned regulation of antigen capture. Furthermore, the present work indicates that S1P is able to reduce PI3K activity via the S1P2 receptor subtype. Most interestingly, down regulation of S1P2 receptor subtype not only prevents the inhibitory effect of S1P on antigen uptake but also increases the basal level of macropinocytotic capacity. These results provide evidence that S1P could be involved in the endogenous regulation of endocytosis in immature DC`s. This hypothesis has been substantiated by enhancing the endogenous biosynthesis of S1P using a direct inducer of SphK1 activity. As expected, observed reduction of endocytosis by DC`s in the presence of the SphK1 activator was accompanied by diminished phosphoinositid 3-kinase activity. In agreement with previous studies the present work provides evidence, that an ABCC1 transporter is involved in the secretion of the sphingolipid. In summary, the present work demonstrates an essential role of S1P in antigen capture by immature DC`s. Endocytosis is the initial step of the adaptive immune response. Thus, elucidation of related signalling pathways could significantly contribute to the establishment of new treatments for inflammatory diseases such as atopic dermatitis.

Glukokortikoide (GC) stellen aufgrund ihrer potenten anti-inflammatorischen und immunosuppressiven Eigenschaften eine der am häufigsten eingesetzten Arzneistoffklassen zur Therapie von entzündlichen Erkrankungen dar. Außerdem werden GC aufgrund ihrer pro-apoptotischen Wirkungen im Rahmen der Anti- Tumortherapie eingesetzt. Seit einiger Zeit ist allerdings bekannt, dass GC in Abhängigkeit vom jeweiligen Zelltyp auch zytoprotektive Eigenschaften aufweisen. Die Signalwege, über die GC anti-apoptotisch wirken können sind zudem noch nicht vollständig aufgeklärt worden. Daher war es das Ziel dieses Promotionsvorhabens den Signalweg der anti-apoptotischen Wirkung von Dexamethason (Dex) in humanen Fibroblasten aufzuklären. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der zytoprotektive Effekt von Dex auf einer Regulation des Sphingolipidrheostats beruht. Im Detail bewirkt Dex eine vermehrte Umwandlung der pro-apoptotischen Sphingolipide Ceramid und Sphingosin in den für seine zytoprotektiven Wirkungen bekannten Lipidmediator Sphingosin-1-Phosphat (S1P). Diese verstärkte Transformation von Ceramid in S1P konnte außerdem auf eine Regulation der Sphingosinkinase 1 zurückgeführt werden, die zusätzlich auch durch das GC induziert wird. Intrazellulär gebildetes S1P wird sodann durch den GC-regulierten „ATP-binding cassette“ Transporter ABCC1 aus der Zelle exportiert und bewirkt dort die Aktivierung des S1P3-Rezeptorsubtyps. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der S1P3 durch Dex reguliert werden kann. Zur Analyse des weiteren zytoprotektiven Signalweges wurden verschiedene intrazelluläre Mediatoren der Zytoprotektion hinsichtlich ihrer Beteiligung am anti-apoptotischen Effekt von Dex in Fibroblasten untersucht. Es stellte sich heraus, dass der zytoprotektive Signalweg von Dex auf eine Aktivierung der Phosphoinositol-3-Kinase beruht. Als weitere Zielsturktur des intrazellulären Signalweges konnte zudem die ProteinkinaseB, auch Akt-Kinase genannt, identifiziert werden. Hier zeigte sich ebenfalls dass Dex zu einer Regulation der Kinase beitragen konnte. In einem weiteren Schritt wurde der anti-apoptotische Signalweg des GC hinsichtlich einer Beteiligung von Proteinen der sogenannten B-Zell Lymphoma 2 (Bcl-2)-Familie untersucht, von der sowohl pro- als auch anti-apoptotische Vertreter bekannt sind. Dabei stellte sich heraus, dass das anti-apoptotische Protein BclxL (Bcl-2-like 1) in Anwesenheit von Dex induziert wird und zusätzlich essentiell für den zytoprotektiven Effekt des GC in Fibroblasten war. Während apoptotischer Vorgänge kommt es häufig zu einem Absinken des transmembranären, mitochondrialen Potentials. In Anwesenheit von Dex konnte interessanterweise nachgewiesen werden, dass das GC eine Verminderung des Potentials effektiv verhindern konnte. Zusätzlich zeigte sich, dass der anti- apoptotische Effekt von Dex auch auf einer reduzierten Aktivierung der Effektorcaspase 3 beruht., Due to their potent anti-inflammatoric and immunosuppressive properties glucocorticoids (GC) represent one of the most commonly used drugs in medicine concerning the therapy of inflammatory diseases and for the modulation of immune responses. Moreover they exert pro-apoptotic properties and are consequently used as cotherapeutics during a treatment with cytostatic drugs. But within the last years it has been shown that GC are also able to prevent programmed cell death. However the detailed signalling mechanisms how GC are able to mediate cytoprotection are not well understood. For this reason the aim of this study was to identify the anti-apoptotic signalling mechanism of dexamethasone (Dex) in human fibroblasts. The present study provides evidence that Dex mediates cytoprotection via a tight regulation of the sphingolipid rheostat. In detail stimulation of Dex resulted in a distinct reduction of pro-apoptotic intracellular ceramide and sphingosine levels, whereas intracellular concentrations of cytoprotective sphingosine-1-phosphate (S1P) were increased. Moreover it has been shown that this process was based on the activity of sphingosine kinase1, which is also induced upon stimulation with Dex. This study shows for the first time that the ATP-binding cassette (ABC) transporter ABCC1 accounts for the export of S1P out of the cell. Thus a tight regulation of the ABC-transporter by Dex was discovered. Extracellular S1P has been reported to activate a group of distinct G-protein coupled receptors, named S1P-receptors. Characterization of the involvement of a specific S1P- receptor in the cytoprotective signalling pathway of Dex identified the S1P3-receptor subtype as a crucial mediator of cytoprotection. Concerning the further anti-apoptotic signalling pathway the present study provides evidence for the participation of one of the most prominent intracellular cytoprotective signalling pathways which is referred to as the phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/Akt signalling pathway. Thus a tight regulation of the protein kinase Akt by Dex has been revealed. Closer studies implicated the involvement of the B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) family. This family consists of both pro- and anti-apoptotic proteins which had been identified as important mediators of the life death decision of a cell. In detail, it has been elucidated that Dex mediates its cytoprotective effect via an upregulation of anti-apoptotic BclxL (Bcl-2 like 1). Most commonly apoptosis is often connected to a reduction of mitochondrial membrane potential, which may be regulated by several intracellular stimuli even GC. This study reveals that Dex prevents the decrease of mitochondrial membrane potential. Additionally it has been found out that this process correlates with a dimished activation of effector caspase 3- a common marker of apoptosis - in human fibroblasts.

Für die Ätiopathogenese der Atherosklerose spielen eine Vielzahl von Mediatoren eine Rolle. Dabei werden durch das Endothel sowohl protektive als auch schädliche Mediatoren sezerniert. High Density Lipoproteine (HDL) stellen einen bedeutenden protektiven Marker für das kardiovaskuläre Risiko dar, u.a. durch die Aktivierung der endothelialen NO-Synthase (eNOS). HDL besteht zu 50 % aus Proteinen und zu 50 % aus Lipiden. Welche Komponenten des HDL für die eNOS Aktivierung verantwortlich sind, ist nicht bekannt gewesen. Im ersten Abschnitt dieser Promotionsarbeit konnte erfolgreich gezeigt werden, dass die Lysophospholipide, Sphingosin-1-Phosphat (S1P) und Sphinsosylphosphorylcholin (SPC), die strukturelle Bestandteile der Lipidfraktion von HDL darstellen, für einen Teil der HDL induzierten eNOS Aktivierung durch Stimulation des S1P3-Rezeptors verantwortlich sind. Diese eNOS Aktivierung wird durch den intrazellulären Einstrom von Calcium und durch die Aktivierung der Akt-Kinase induziert. Im zweiten Abschnitt dieser Promotionsarbeit konnte nachgewiesen werden, dass das oral verfügbare Lysophospholipid-basierte Medikament, FTY720, das ein strukturelles Analogon des S1P ist, den HDL induzierten Signaltransduktionsweg der eNOS Aktivierung in gleicher Weise induziert. Im dritten Abschnitt dieser Promotionsarbeit konnte ein neuartiges endothelabhängig sezerniertes gemischtes Dinukleosidpolyphosphat, Uridin-Adenosin-Tetraphosphat (Up4A), identifiziert werden. Up4A ist ein Agonist an den P2X- und P2Y-Purinrezeptoren. Up4A induziert bei Applikation in eine isoliert perfundierte Rattenniere hauptsächlich über die Aktivierung des P2X1-Rezeptors und des P2Y2/P2Y4-Rezeptors eine starke Vasokonstriktion im renalen Perfusionsgebiet mit einhergehender Erhöhung des mittleren renalen Perfusionsdrucks. Die direkte Infusion von Up4A in vivo in eine WKY-Ratte führt zu einer signifikanten Erhöhung des mittleren arteriellen Blutdrucks. In the pathogenesis of atherosclerosis many mediators are included. Therefore the endothelium plays a crucial part by secreting protective but also deleterious factors. High density lipoproteins are an established protective factor in the risk profile of cardiovascular events especially by activating the endothelial NO synthase (eNOS). HDL is composed of 50 % proteins and 50 % lipids. Which component of HDL is responsible for the eNOS activation was not known. In the first part of this dissertation it could be shown, that the lysophospholipids, sphingosine-1-phosphate (S1P) and sphingosylphosphorylcholine (SPC), which are structural compounds of the lipid fraction of HDL, are responsible for a significant part of the HDL induced eNOS activation by stimulating the specific S1P3 receptor. In the signal transduction mechanism the activation of Akt kinase and an influx of calcium is involved. In the second part of this dissertation it could be shown, that the orally active lysophospholipide based drug FTY720, which is a structural analogue of S1P, is able to induce the same signal transduction mechanism activated by HDL including the stimulation of the S1P3 receptor. In the last part of this dissertation a new endothelium dependent vasoconstrictor, the dinucleoside polyphosphate uridine-adenosine-tetraphosphate (Up4A), could be for the first time identified. Up4A is a potent agonist of the P2X- and P2Y-purinoceptors. Via activating the P2X1 receptor and the P2Y2/P2Y4 receptor Up4A induce a strong vasoconstriction in the renal perfusion system in the model of the isolated perfused rat kidney with an adjacent increase of the mean perfusion pressure. By injection of Up4A in vivo in a Wistar Kyoto rat the mean arterial pressure also increase significantly.

In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass Sphingosin-1-Phosphat (S1P) in NIH3T3- und C3H10T1/2-Mäusefibroblasten einen spannungsunabhängigen, calciumabhängigen Kaliumstrom transient aktiviert, der durch Charybdotoxin, Margatoxin und Iberiotoxin vollständig blockiert werden kann. Die Kaliumstromaktivierung führt zu einer starken Hyperpolarisation der Zellen. Der S1P-aktivierte Kaliumstrom hat identische elektrophysiologische und pharmakologische Eigenschaften wie der durch Lysophosphatidsäure (LPA) aktivierte Kaliumstrom in NIH3T3-Zellen. In der Whole-Cell Ableitung führt nur die erste Applikation von S1P zu einer transienten Kaliumstromaktivierung, wohingegen in der Cell-Attached Ableitung mehrfache transiente Kaliumstromaktivierungen möglich sind. Der transiente Stromverlauf und das Ausbleiben einer zweiten Kaliumstromaktivierung im Whole-Cell Modus sind nicht auf eine Inaktivierung der Kaliumkanäle zurückzuführen. Jeweils identische, transiente Kaliumstromaktivierungen treten auf, wenn S1P und LPA bzw. LPA und S1P nacheinander appliziert werden. Dieser Befund weist darauf hin, dass S1P und LPA bezüglich der Kaliumstromaktivierung keine Cross-Desensitisierung zeigen. In C3H10T1/2-Mäusefibroblasten, die die nicht-rezeptorgekoppelte Proteintyrosinkinase c-Src überexprimieren, ist die Amplitude des S1P-induzierten Kaliumstroms fast doppelt so hoch wie in den Kontrollzellen. Die Expression einer nicht-myristilierbaren c-Src Mutante führt zu einer weiteren Erhöhung der Kaliumstromantwort, während die Expression einer Kinase-defekten c-Src Mutante die Stromantwort auf 43 % des Kontrollwertes reduziert. Diese Daten zeigen, dass S1P in Mäusefibroblasten calciumabhängige Kaliumkanäle über eine intrazelluläre Signalkaskade aktiviert, in die c-Src eingeschaltet ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass c-Src auch für die Kaliumkanalaktivierung durch LPA eine entscheidende Rolle spielt. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals nachgewiesen, dass LPA in glatten Gefäßmuskelzellen (A7r5) einen L-Typ Calciumstrom inhibiert. Pertussistoxin (PTX) vermindert signifikant die LPA-induzierte Blockade dieses Stroms, was auf die Beteiligung eines PTX-sensitiven G-Proteins schließen lässt. Das für L-Typ Calciumströme typische elektrophysiologische Profil wurde nur an solchen A7r5-Zellen gefunden,die vollkommen isoliert lagen und keinen Membrankontakt zu Nachbarzellen hatten. In weiteren Experimenten muss nun untersucht werden, in welche biologischen Prozesse die S1P- und LPA-modulierten Ionenkanäle eingebunden sind. The present study shows for the first time that in NIH3T3 and C3H10T1/2 mouse fibroblasts sphingosine-1-phosphate (S1P) transiently activates a voltage-independent, calcium-dependent potassium current that can be completely blocked by charybdotoxin, margatoxin, and iberiotoxin. The potassium current activation leads to a large membrane hyperpolarization. The S1P-activated potassium current has identical electrophysiological and pharmacological properties compared to the lysophosphatidic acid (LPA)-activated potassium current in NIH3T3 cells. In the whole-cell recording mode, only the first application of S1P leads to a transient potassium current activation, whereas in the cell-attached recording mode several transient potassium current activations are possible. The transient current response and the failure of S1P to evoke a second potassium current response in the whole-cell recording mode are not due to an inactivation of potassium channels. Identical transient potassium current activations are evoked when S1P and LPA or LPA and S1P are applied consecutively. These findings indicate that in the case of potassium current activation no cross-desensitization occurs by S1P and LPA. In C3H10T1/2 mouse fibroblasts that overexpress the non-receptor protein tyrosine kinase c-Src, the amplitude of the S1P-induced potassium current is almost doubled compared to the one found in control cells. Expression of a non-myristylated c-Src mutant leads to a further increase in the potassium current response, whereas expression of a kinase-defective c-Src mutant reduces it to 43 % compared to the control value. These data show that S1P activates calcium-dependent potassium channels in mouse fibroblasts via an intracellular signalling pathway that involves c-Src. Furthermore, it was demonstrated that c-Src plays also an crucial role for the potassium channel activation by LPA. A further finding of the present study is that in vascular smooth muscle cells (A7r5) LPA inhibits an L-type calcium current. Pertussis toxin (PTX) significantly reduces the LPA-induced block of this current, which indicates the involvement of a PTX-sensitive G protein. The typical electrophysiological profile of L-type calcium channels was only found in A7r5 cells lying completely isolated without any contacts to neighbouring cells. In further experiments it should be investigated in which biological activities the S1P and LPA-modulated ion channels are involved.

In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass Sphingosin-1-Phosphat (S1P) in NIH3T3- und C3H10T1/2-Mäusefibroblasten einen spannungsunabhängigen, calciumabhängigen Kaliumstrom transient aktiviert, der durch Charybdotoxin, Margatoxin und Iberiotoxin vollständig blockiert werden kann. Die Kaliumstromaktivierung führt zu einer starken Hyperpolarisation der Zellen. Der S1P-aktivierte Kaliumstrom hat identische elektrophysiologische und pharmakologische Eigenschaften wie der durch Lysophosphatidsäure (LPA) aktivierte Kaliumstrom in NIH3T3-Zellen. In der Whole-Cell Ableitung führt nur die erste Applikation von S1P zu einer transienten Kaliumstromaktivierung, wohingegen in der Cell-Attached Ableitung mehrfache transiente Kaliumstromaktivierungen möglich sind. Der transiente Stromverlauf und das Ausbleiben einer zweiten Kaliumstromaktivierung im Whole-Cell Modus sind nicht auf eine Inaktivierung der Kaliumkanäle zurückzuführen. Jeweils identische, transiente Kaliumstromaktivierungen treten auf, wenn S1P und LPA bzw. LPA und S1P nacheinander appliziert werden. Dieser Befund weist darauf hin, dass S1P und LPA bezüglich der Kaliumstromaktivierung keine Cross-Desensitisierung zeigen. In C3H10T1/2-Mäusefibroblasten, die die nicht-rezeptorgekoppelte Proteintyrosinkinase c-Src überexprimieren, ist die Amplitude des S1P-induzierten Kaliumstroms fast doppelt so hoch wie in den Kontrollzellen. Die Expression einer nicht-myristilierbaren c-Src Mutante führt zu einer weiteren Erhöhung der Kaliumstromantwort, während die Expression einer Kinase-defekten c-Src Mutante die Stromantwort auf 43 % des Kontrollwertes reduziert. Diese Daten zeigen, dass S1P in Mäusefibroblasten calciumabhängige Kaliumkanäle über eine intrazelluläre Signalkaskade aktiviert, in die c-Src eingeschaltet ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass c-Src auch für die Kaliumkanalaktivierung durch LPA eine entscheidende Rolle spielt. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals nachgewiesen, dass LPA in glatten Gefäßmuskelzellen (A7r5) einen L-Typ Calciumstrom inhibiert. Pertussistoxin (PTX) vermindert signifikant die LPA-induzierte Blockade dieses Stroms, was auf die Beteiligung eines PTX-sensitiven G-Proteins schließen lässt. Das für L-Typ Calciumströme typische elektrophysiologische Profil wurde nur an solchen A7r5-Zellen gefunden,die vollkommen isoliert lagen und keinen Membrankontakt zu Nachbarzellen hatten. In weiteren Experimenten muss nun untersucht werden, in welche biologischen Prozesse die S1P- und LPA-modulierten Ionenkanäle eingebunden sind., The present study shows for the first time that in NIH3T3 and C3H10T1/2 mouse fibroblasts sphingosine-1-phosphate (S1P) transiently activates a voltage-independent, calcium-dependent potassium current that can be completely blocked by charybdotoxin, margatoxin, and iberiotoxin. The potassium current activation leads to a large membrane hyperpolarization. The S1P-activated potassium current has identical electrophysiological and pharmacological properties compared to the lysophosphatidic acid (LPA)-activated potassium current in NIH3T3 cells. In the whole-cell recording mode, only the first application of S1P leads to a transient potassium current activation, whereas in the cell-attached recording mode several transient potassium current activations are possible. The transient current response and the failure of S1P to evoke a second potassium current response in the whole-cell recording mode are not due to an inactivation of potassium channels. Identical transient potassium current activations are evoked when S1P and LPA or LPA and S1P are applied consecutively. These findings indicate that in the case of potassium current activation no cross-desensitization occurs by S1P and LPA. In C3H10T1/2 mouse fibroblasts that overexpress the non-receptor protein tyrosine kinase c-Src, the amplitude of the S1P-induced potassium current is almost doubled compared to the one found in control cells. Expression of a non-myristylated c-Src mutant leads to a further increase in the potassium current response, whereas expression of a kinase-defective c-Src mutant reduces it to 43 % compared to the control value. These data show that S1P activates calcium-dependent potassium channels in mouse fibroblasts via an intracellular signalling pathway that involves c-Src. Furthermore, it was demonstrated that c-Src plays also an crucial role for the potassium channel activation by LPA. A further finding of the present study is that in vascular smooth muscle cells (A7r5) LPA inhibits an L-type calcium current. Pertussis toxin (PTX) significantly reduces the LPA-induced block of this current, which indicates the involvement of a PTX-sensitive G protein. The typical electrophysiological profile of L-type calcium channels was only found in A7r5 cells lying completely isolated without any contacts to neighbouringcells. In further experiments it should be investigated in which biological activities the S1P and LPA-modulated ion channels are involved.