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L’obiettivo principale di quest’opera è quello di presentare in modo completo e approfondito il quadro attuale relativo alla ricerca sulle cellule staminali e le loro possibili applicazioni terapeutiche. Il testo in particolare è strutturato seguendo un percorso che parte dalle basi molecolari e le proprietà biologiche delle cellule staminali pluripotenti, embrionali o riprogrammate, e mette a confronto i diversi gradi della staminalità, descrivendo le popolazioni staminali “adulte” residenti nei vari tessuti ed organi del corpo umano. Partendo dalla ricerca di base vengono presentati esempi di medicina rigenerativa che traslano le scoperte sperimentali rendendole possibili nelle applicazioni cliniche di terapia cellulare. Le cellule staminali infine possono rappresentare un modello di studio per comprendere non solo i meccanismi fisiologici che controllano il loro destino ma anche quelli patologici coinvolti nella biologia aberrante delle cellule staminali tumorali. Ogni capitolo è stato affidato ad illustri ricercatori del campo, cosicché ogni parte risulta rigorosamente approfondita, aggiornata e arricchita dal contributo personale di ciascun autore .

Il capitolo prende in esame le caratteristiche genetiche, molecolari, morfologiche e immunofenotipiche delle cellule progenitrici endoteliali, linfatiche e delle cellule mesenchimali stromali circolanti e residenti nella parete vascolare.

Il recente ed esplosivo sviluppo delle conoscenze nel campo della terapia cellulare, dell’ingegneria dei tessuti e della medicina rigenerativa ci ha indotto a coagulare le diverse competenze acquisite in vari ambiti di ricerca per contribuire alla stesura di un testo sulle caratteristiche delle cellule staminali e il loro potenziale applicativo nella medicina rigenerativa. In questo volume, data la vastità dell’argomento, abbiamo focalizzato l’attenzione su alcune delle diverse tipologie e sorgenti di cellule staminali e le loro applicazioni. Il testo è rivolto in particolare agli studenti dei corsi magistrali di Biotecnologie e Scienze Biomediche; dovrà essere una guida per lo studente che seguirà un corso di “cellule staminali” svolto da ricercatori coinvolti sperimentalmente nella comprensione dei meccanismi che regolano il rinnovamenti dei tessuti. Ogni capitolo è corredato da letture consigliate solitamente review e lavori scientifici pubblicati su riviste internazionali per avere una visione più ampia e completa delle dinamiche e delle prospettive che si vanno delineando in questo ambito.

Il volume raccoglie il contenuto delle lezioni di Medicina di Laboratorio svolte dagli autori nei Corsi di Laurea Triennali della Scuola di Medicina e Chirurgia

Il capitolo prende in esame le caratteristiche genetiche, molecolari, morfologiche e immunofenotipiche delle cellule progenitrici endoteliali e delle cellule mesenchimali stromali circolanti e residenti nella parete vascolare.

La parete vascolare è sede di una completa gerarchia di cellule staminali residenti (CSr) capaci di differenziare in molteplici citotipi mesodermici e non; le CSr sono localizzate in una zona al confine tra tonaca media e tonaca avventizia detta “zona vasculogenica”. In questo studio è stato utilizzato un sistema di coltura 3D di arteria femorale umana per stabilire il ruolo di progenitori vascolari residenti in parete nel rimodellamento spontaneo non influenzato dai normali rapporti con la componente ematica circolante e senza l’impiego di fattori di crescita. Il segmento di arteria femorale umana di donatore multiorgano, fornitoci dalla Banca Regionale dei Tessuti Cardiovascolari del Policlinico S.Orsola - Malpighi di Bologna, dopo decontaminazione, è stato processato per la microscopia ottica (LM) ed elettronica (TEM); la rimanente parte, suddiviso in più porzioni, è stato mantenuto in coltura, in terreno basale di crescita, fino a 70 giorni. A intervalli di 14 giorni, i campioni sono stati processati per le analisi istologiche, immunoistochimiche e ultrastrutturali. L’analisi istologica mostra una rapida perdita dell’endotelio e un decremento significativo della cellularità di parete fino al 35° giorno di coltura. Dal 42° giorno in poi, si osserva la presenza di due monostrati cellulari istologicamente identici ma fenotipicamente distinti a rivestire gli strati più esterni della parete arteriosa; le cellule intimali esprimono molecole endoteliali (CD34, CD31); diversamente, il versante avventiziale assume un fenotipo mesenchimale (vimentin, CD105, CD90, CD44). Queste differenze fenotipiche sono state confermate anche mediante analisi ultrastrutturale. In conclusione questo studio ha evidenziato come la coltura d’organo sia una buona alternativa per studiare l’omeostasi tissutale vascolare; essa ha permesso di seguire i fenomeni di rimodellamento spontaneo suggerendo l’importanza della matrice extracellulare nel guidare in maniera appropriata i processi differenziativi delle CSr in assenza di specifici stimoli chimici.

La prevenzione delle infezioni crociate nell’ambiente lavorativo odontoiatrico costituisce da sempre una problematica di grande interesse. Negli ultimi anni è stato evidenziato come l’acqua che fuoriesce dai condotti di un riunito odontoiatrico (turbine, micromotori, siringhe aria/acqua) non sempre rispetta le caratteristiche microbiologiche previste per uso umano; ciò rappresenta un potenziale rischio infettivo. La fonte principale di contaminazione interna della strumentazione odontoiatrica è rappresentata dal “biofilm”, patina organica autoprodotta e tenacemente aderente alla superficie interna del condotto idrico del riunito che ospita specie microbiche differenti; il biofilm protegge i batteri dagli agenti disinfettanti e dispone per loro un habitat in cui vivere e moltiplicarsi. Una volta consolidato, la sua rimozione, dalla parete interna del condotto idrico del riunito, da parte dei più comuni disinfettanti, risulta spesso insoddisfacente a causa della difficoltà delle molecole biocide a raggiungere i microrganismi inglobati nella matrice polisaccaridica. Nel presente studio è stata valutata, mediante microscopia elettronica a scansione, l’efficacia di alcuni sistemi di disinfezione nella riduzione del biofilm nei condotti idrici (turbine e siringhe) dei riuniti odontoiatrici. Nei campioni prelevati all’inizio dello studio, l’analisi ultrastrutturale ha mostrato una chiara presenza di numerose aree omogeneamente ricoperte da biofilm; tale strato continuo si interrompava in alcune zone caratterizzate da micro-fessurazioni; in alcuni casi, il biofilm osservato risultava particolarmente friabile e associato a grossi agglomerati batterici; inoltre è stato possibile osservare anche alcuni depositi di cristalli di diversa morfologia; l’analisi eseguita mediante rivelatore per elettroni retrodiffusi ha permesso di dimostrare come parte dei cristalli fossero costituiti da concrezioni di calcio. L’osservazione al SEM dei dispositivi prelevati al termine dei trattamenti, ha evidenziato una netta riduzione dello spessore biofilm; in alcuni casi, la disgregazione del biofilm è stata tale da consentire la evidenziazione dei singoli batteri che lo costituivano. Concludendo, la microscopia elettronica a scansione costituisce la tecnica di scelta per l’analisi qualitativa e semiquantitativa del biofilm presente nei condotti idrici dei riuniti odontoiatrici; essa consente inoltre, come dimostrato in questo studio, di monitorare l’efficacia dei sistemi di sanificazione correntemente utilizzati nella pratica odontoiatrica.

L’utilizzo di costrutti tessutali ingegnerizzati sviluppati in vitro e destinati ad essere impiantati in vivo per promuovere la rigenerazione di un tessuto danneggiato alimenta notevoli speranze nel campo della medicina rigenerativa e dell’ingegneria dei tessuti. Un aspetto critico nell'ingegneria dei tessuti riguarda la necessità di avvicinarsi alla tridimensionalità del contesto naturale, cioè mimare la struttura fibrillare 3D della matrice extracellulare (ECM). L’elettrofilatura è una tecnologia promettente per la fabbricazione di biomateriali in forma di fibre sub-micrometriche che richiamano l'ECM e generano per le cellule un contesto paragonabile a quello nativo. Nonostante ciò, molta ricerca rimane ancora da compiere per fabbricare scaffold con proprietà meccaniche idonee alle specifiche applicazioni. In particolare, per l’utilizzo nell’ambito dell’ingegneria del tessuto cardiaco al materiale sono richieste proprietà meccaniche elastiche per consentire l’espansione e la contrazione dello scaffold quando sottoposto a sollecitazioni cicliche in condizioni fisiologiche. Molti sforzi di ricerca sono quindi tutt’oggi dedicati allo sviluppo di nuovi polimeri con modulo elastico (E) adeguato per l’ingegneria del tessuto cardiaco. In questo lavoro si è sintetizzato un nuovo copoliestere biodegradabile a base di poli(butilene succinato) (PBS) per la realizzazione di scaffold elettrofilati che superino le limitazioni imposte dall'elevato modulo elastico dei materiali polimerici attualmente disponibili. É stata poi dimostrata la biocompatibilità dei nuovi scaffold con cellule embrionali cardiache da ratto.

I supporti odierni, maggiormente utilizzati per la crescita cellulare, sono realizzati con polimeri bio-compatibili e bio-riassorbibili, ma presentano una struttura interna inadeguata alla crescita veloce e controllata delle cellule. Conseguenza di ciò è la difficoltà di produrre tessuti con densità cellulare subottimale per fabbricare pseudo-tessuti idonei alla riparazione di tessuti irrimediabilmente danneggiati. In questo studio abbiamo utilizzato una nuova tecnologia basata sull'elettrofilatura per realizzare supporti polimerici a base di acido poli-L-lattico, aventi una struttura interna potenzialmente utile a ottenere una crescita cellulare più veloce e a maggiore densità. Uno degli obiettivi è la realizzazione di scaffold nano-strutturati di dimensioni eccezionalmente ridotte, in grado di imitare l’ambiente naturale del corpo umano nel quale le cellule si replicano velocemente e di fornire un adeguato supporto strutturale in seguito all’impianto nel corpo umano. La metodica utilizzata per la produzione degli scaffold è basata sulla elettrofilatura che, applicando un elevato campo elettrostatico, permette di filare un fluido polimerico fino ad ottenere fibre stirate, in seguito all’evaporazione del solvente, il cui diametro è nano-metrico dell’ordine di 0,1 micrometri, e provviste di morfologia controllabile variando opportunamente i parametri del processo. La proliferazione cellulare e l’interazione cellula-fibre di acido polilattico sono state valutate mediante saggi di bio-compatibilità col test Alamar Blue e saggi di migrazione con camera di Boyden, utilizzando fattori chemotattici quali il VEGF (fattore di crescita vascolare). L’osservazione al microscopio elettronico a scansione e su sezioni ottenute al criostato dei primi supporti elettrofilati, su cui sono state seminate cellule H9C2, mostrano una elevata affinità per le fibre di acido polilattico e una buona crescita cellulare con distribuzione delle cellule sia in superficie che nello spessore dei supporti stessi, fino a colonizzare focalmente anche il versante opposto alla superficie di semina.

Background: The organ culture is an in vitro method for studying the vascular wall biology. The value of organ culture is twofold; it retains the in vivo structural tissue architecture while preserving the interaction between vascular cell subtypes and extracellular matrix components. Objectives: The present study is aimed at establishing whether putative resident vascular progenitors i) remain in niche niched within human vascular segments after collection in tissues banking facilities and ii) are able to develop an intimal lining in long-term cultures without VEGF support. Materials and methods: Human fresh arterial vascular conduits were collected from heart-beating donors (n. 3) following 72 hrs maintenance in an antibiotic mixture; before culturing, samples were processed for light microscopy (LM) and transmission electron microscopy (TEM); TUNEL assay and ultrastructural investigation were used to establish the degree of cell preservation; the remaining tissue was cut in 3 x 3 mm slices and cultured for up to 70 days in medium containing 5% of FBS. The samples were processed for LM and TEM weekly. Results: Before culturing, TUNEL assay revealed that the vast majority of the vascular wall cells had significant nuclear damage; this feature was confirmed by TEM. At 4 day of culture, TEM showed the presence of a few structurally preserved cells in correspondence with the adventitia layer; after 42 days, several undifferentiated cells with a high N/C ratio and prominent nucleoli were seen at this same location. LM revealed that spindle-shaped, epithelioid cells migrated near the inner and outer surfaces of the arterial segments; an almost continuous endothelial-like lining became evident starting after 56 days of culture. Immunostaining for CD34 surface molecule was negative in the adventitial lining and focally positive in the intimal side. Conclusion: This study demonstrates that human vascular conduits, after collection in tissues banking facilities, still contain a resident cell population which is particularly resistant to physical and chemical stresses; under plain tissue culture conditions these cells are able to expand and migrate toward the arterial surfaces and give origin to a pseudo-intimal lining. Noteworthy is the fact that we can exclude any contribute of hematopoietic cells to this phenomenon that, in this case, is dependent only on putative resident progenitors.

Numerosi studi sperimentali hanno evidenziato la presenza di progenitori vascolari e di cellule mesenchimali stromali nella parete dei vasi arteriosi e venosi. Questi studi che hanno inizialmente riguardato vasi di derivazione animale sono stati recentemente estesi a vasi umani adulti. Sulla base dei risultati ottenuti da diversi gruppi sperimentali, Zengin ipotizzò la presenza di una zona vasculogenica nella parete arteriosa dove non risiedono soltanto cellule progenitrici endoteliali, ma anche una vera e propria gerarchia di cellule staminali residenti, tra cui le mesenchimali stromali, capaci di differenziare non solo in cellule endoteliali mature, ma anche in cellule progenitrici ematopoietiche e, più in generale, in cellule di diversi tessuti di origine mesodermica. Il nostro gruppo di ricerca, lavorando su campioni di aorta toracica umana espiantati da donatori multiorgano sani adulti, è riuscito ad isolare una popolazione cellulare dalla parete vascolare con caratteristiche fenotipiche sovrapponibili a quelle delle cellule mesenchimali stromali derivate dal midollo osseo. Attraverso opportuni saggi di differenziamento condotti in vitro è stato indagato il loro potenziale differenziativo. Dai risultati ottenuti è emerso che questa popolazione cellulare è in grado di differenziare in senso endoteliale, adiposo, muscolare liscio e in senso osteogenico seppure con minore efficienza. L’avvenuto differenziamento è stato valutato dal punto di vista istologico-immunoistochimico e ultrastrutturale. Studi futuri saranno indirizzati a comprendere meglio le caratteristiche di questa popolazione cellulare e di verificarne la multipotenza in vivo su modelli animali appropriati a valutarne l’applicabilità clinica

La realizzazione di biopolimeri ingegnerizzati con cellule staminali multipotenti idonei alla rigenerazione tessutale potrebbe trovare importanti applicazioni cliniche nell’ambito di diverse patologie degenerative cardiovascolari. In questo studio abbiamo investigato, utilizzando diverse tecniche microscopiche, i meccanismi di interazione tra cellule staminali mesenchimali, isolate dal midollo osseo di ratti adulti (rBM-MSC), e un costrutto di acido ialuronico esterificato (Hyaff 11®, Fidia Advanced Biopolymers, Abano Terme). Le rBM-MSC, dopo essere state isolate e caratterizzate, sono state seminate al passaggio 1 sullo scaffold ad una densità di 2x106 /cm2 e coltivate per 21 giorni. Le colture sono state analizzate a 1, 3, 7, 14, 21 giorni dalla semina con tecniche idonee a valutare l’adesione, la vitalità, la crescita, e la migrazione cellulare sul substrato. I risultati hanno evidenziato come l’ adesione cellulare sia elevata già dal primo giorno di coltura e la vitalità aumenti in modo esponenziale durante la coltura; l’ analisi al microscopio ottico ha evidenziato come le cellule siano presenti già dal 3° giorno di coltura nello spessore dello scaffold indicando quindi una tendenza spontanea alla colonizzazione. I risultati ultrastrutturali al SEM indicano che le cellule al giorno 21 ricoprono il 40±10% della superficie del polimero formando un monostrato sub-confluente. I dati ottenuti al TEM rivelano come le cellule, durante i primi giorni di coltura, aderiscono alle fibre con contatti focali mentre al 14° giorno producono una matrice ricca in fibronectina che si localizza nello spazio libero tra la membrana cellulare e la superficie esterna della fibra; al 21° giorno è visibile la presenza di matrice extracellulare autologa (fibre collagene e particelle di proteoglicani). In conclusione, i risultati ottenuti indicano come Hyaff 11® sia un adeguato supporto per la crescita di cellule staminali mesenchimali e quindi costituisca un biomateriale naturale applicabile alla produzione di pseudo-tessuti per la riparazione tessutale.

La crioconservazione del tessuto ovarico in giovani pazienti, che devono sottoporsi a severi trattamenti antiblastici, sono interamente focalizzate sulla possibilità di preservare la loro fertilità. In questa review, saranno trattati gli sforzi compiuti per ottimizzare le variabili che sembrano influenzare la sopravvivenza del tessuto congelato. In primo luogo si valuterà se sia più utile preservare i follicoli o l’intero tessuto ovarico e verranno descritte alcune esperienze compiute fino ad oggi nell’uomo. In seguito l’attenzione sarà focalizzata sulle possibili applicazioni cliniche del tessuto dopo scongelamento (trapianto autologo/eterologo o sviluppo in vitro dei follicoli): a remissione completa della malattia come procedere se la paziente prende in considerazione l’ipotesi della maternità? Dal punto di vista clinico, è preferibile l’autotrapianto rispetto allo xenotrapianto in animali immunodepressi o è più opportuno tentare la maturazione dell’ovocita in vitro? Al momento, le tecniche di autotrapianto sono le uniche capaci di ripristinare la crescita follicolare, la produzione endogena degli ormoni ed anche un esiguo numero di gravidanze, spontanee o indotte con IVF. Infine, saranno descritte le nostre esperienze sulla crioconservazione del tessuto ovarico, dalla scelta del PROH (propandiolo) come migliore crioprotettore alla scelta del supporto proteico più adatto per la preservazione del tessuto crioconservato.

Il contributo prende in rassegna le caratteristiche strutturali di un polimero costituito da microfibre di acido ialuronico esterificato con alcol benzilico e le modalità di interazione tra progenitori endoteliali (EPC) umani e cellule mesenchimali stromali di ratto con il polimero a vari tempi di coltura (1, 7, 14 e 21 gg).