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L’ormone adipocitario leptina agisce su neuroni ipotalamici regolando l’assunzione di cibo e la spesa energetica. I recettori della leptina sono espressi in diverse aree cerebrali e le azioni extraipotalamiche sono state ampiamente riconosciute: la leptina influenza la plasticità sinaptica ed inibisce l’attività simil-epilettiforme sia in neuroni ippocampali che corticali. Molti studi hanno inoltre evidenziato la sua capacità di esercitare neuroprotezione sia in vitro che in vivo contro deprivazione di ossigeno e glucosio, ipossia, ischemia o stimoli ossidativi su neuroni di diverse aree cerebrali. Tra i meccanismi responsabili degli effetti della leptina, il silenziamento neuronale attraverso l’attivazione dei canali del potassio sembra svolgere un ruolo importante: recenti evidenze hanno suggerito che i canali del potassio ad alta conduttanza Ca2+- e voltaggio-dipendenti (canali BK), che stabilizzano il potenziale di membrana neuronale e regolano il rilascio di neurotrasmettitori eccitatori, mediano almeno parte degli effetti della leptina sull’eccitabilità neuronale. Infatti, l’attivazione dei canali BK inibisce l’aberrante firing neuronale ippocampale. Inoltre, l’attivazione dei canali BK esercita significativi effetti neuroprotettivi in modelli animali di ischemia cerebrale e attenua il danno neurologico dopo lesione cerebrale traumatica. L’attivazione dei canali BK sembra anche mediare gli effetti della leptina sull’eccitabilità di neuroni ippocampali durante l’ipossia. Nonostante tali risultati, non esiste nessuna evidenza diretta dell’attivazione dei canali BK da parte di tale ormone durante la neuroprotezione. Nel presente studio, gli effetti neuroprotettivi della leptina ed i meccanismi molecolari coinvolti sono stati valutati in vitro in neuroni corticali di ratti e topi esposti a N-Metil-D-Aspartato (NMDA),. In neuroni corticali di ratto, gli effetti neuroprotettivi della leptina contro la morte cellulare indotta da NMDA erano dose-dipendenti (10-100 ng/ml) e maggiori quando la leptina era incubata per 2 ore prima dello stimolo neurotossico. Sia in neuroni corticali di ratti che di topi, la neuroprotezione indotta dalla leptina era interamente antagonizzata da Paxillina e Iberiotossina, due bloccanti dei canali BK; inoltre, i neuroni corticali di topi che mancavano di uno e di entrambi gli alleli codificanti per le subunità  formanti il poro dei canali BK erano insensibili alla neuroprotezione. In cellule HEK293T che esprimevano transientemente la subunità  dei canali BK o in cellule Ea.hy926 che la esprimevano costitutivamente, l’esposizione alla leptina induceva un robusto spostamento a sinistra della voltaggio dipendenza di attivazione dei canali; questo effetto era ampiamente prevenuto in presenza di chelanti del Ca2+ oppure in cellule che esprimevano canali BK insensibili a tale ione, puntando verso un meccanismo Ca2+-dipendente alla base dell’attivazione dei canali indotta dalla leptina. Inoltre, sia in neuroni corticali che in entrambe le linee cellulari utilizzate, la leptina aumentava i livelli di Ca2+ intracellulare. Infine, il blocco della PI3K o delle subunità P110 e  preveniva l’aumento delle correnti. In conclusione, questi risultati suggeriscono che l’attivazione dei canali BK successiva all’aumento di Ca2+ è uno step critico per la neuroprotezione indotta dalla leptina, di neuroni corticali esposti in vitro a NMDA, facendo di tale evento una potenziale strategia per contrastare le malattie neurodegenerative. The adipocyte hormone leptin controls appetitive behaviors by acting on hypothalamic neurons involved in food intake and energy expenditure. Leptin receptors are expressed in diverse brain regions and extrahypothalamic actions of leptin are increasingly being recognized; for example, leptin influences synaptic plasticity in hippocampal neurons and inhibits epileptiform-like activity in hippocampal as well as in neocortical neurons. Several studies have also highlighted the ability of leptin to exert both in vitro and in vivo neuroprotective effects against oxygen-glucose deprivation, hypoxia, ischemia and excitotoxic or oxidative stimuli in neuronal populations from distinct brain areas. Among the molecular mechanisms responsible for the effects of leptin, neuronal silencing via activation of potassium (K+) channels appears to play a major role: recent evidences have suggested that large-conductance, Ca2+- and voltage-activated K+ channels (BK channels), which stabilize the neuronal membrane potential and regulate excitatory neurotransmitter release, mediate at least part of leptin effects on neuronal excitability. In fact, activation of BK channels mediates the inhibition of aberrant hippocampal neuronal firing. Notably, BK channel activation exerts strong neuroprotective effects in animal models of cerebral ischemia, and attenuated cerebral edema and neurologic motor impairment after traumatic brain injury. Activation of BK channels also seems to mediate leptin effects on primary hippocampal neuronal excitability during hypoxia. Despite these results, direct evidence for BK channel activation by this adipokine during neuroprotection is lacking. In the present study, the neuroprotective effects of the adipokine leptin, and the molecular mechanism involved, have been studied in rat and mice cortical neurons exposed to N-methyl-D-Aspartate (NMDA) in vitro. In rat cortical neurons, leptin elicited neuroprotective effects against NMDA-induced cell death which were concentration-dependent (10-100 ng/ml) and largest when the adipokine was preincubated for 2 hours before the neurotoxic stimulus. In both rat and mouse cortical neurons, leptin-induced neuroprotection was fully antagonized by Paxilline and Iberiotoxin, two BK channel blockers; moreover, cortical neurons from mice lacking one or both alleles coding for Slo1 BK channel pore-forming  subunits were insensitive to leptin-induced neuroprotection. In HEK293T cells transiently expressing the  subunit of BK channels or in Ea.hy926 constitutively expressing the subunit, leptin exposure evoked a robust leftward-shift of the half-maximal activation voltage; in both cases this effect was largely reversed in presence of Ca2+-chelators in the patch pipette, or when BK channels insensitive to modulation by intracellular Ca2+ were expressed, pointing towards a Ca2+-dependent mechanism underlying leptin-mediated BK channels activation. Moreover, both in cortical neurons and in cell lines, leptin increased intracellular Ca2+ levels. Finally, the blockade of PI3K or P110 or  subunits prevented the current increase. In conclusion, these results suggest that BK channel activation following increases in intracellular Ca2+ levels is a critical step for leptin-induced neuroprotection in NMDA-exposed cortical neurons in vitro, thus highlighting leptin-based intervention via BK channel activation as a potential strategy to counteract neurodegenerative diseases. Dottorato di ricerca in Scienze per la salute (XXVI ciclo)

The authors discuss the recent acquisitions concerning the function and the molecular structure of Ca++ channels in excitable cells. Furthermore, they focus on the clinical pharmacology of Ca++ entry blockers in order to give more insight into the pharmacological basis for their therapeutic use.