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形態学的な研究から，硬組織形成部位にアルカリ性至適pHのCa-ATPaseの存在が示唆されているが酵素学的な性質の報告は少ない．そこで骨芽細胞様細胞であるMC3T3-E1細胞が保持するCa-ATPase活性に関して研究を行った．細胞を石灰化時期まで培養後回収し，超音波破砕後に遠心分離操作を行って膜分画を得た．ATP加水分解により生じた無機リン酸をChifflet法で定量してATPase活性を測定し，以下の結果を得た．１．膜分画にはカルシウム（Ca）あるいはマグネシウム（Mg）により活性化されるATPaseが存在し両酵素ともthapsigarginによって阻害された．Ca存在下のATPase活性はMgによって拮抗されることと，Mg-ATPaseを阻害するazideによって阻害されないことから両酵素は別の酵素と示唆された．２．Ca-ATPase活性はCa濃度依存性に増加して1 mMの遊離Ca濃度で飽和し，50 ％活性化濃度は0.3 mMであった．３．活性はpH依存性に増加し，pH 9.1でpH 7.5のほぼ３倍の活性を示して最大となりpH 10.0までは同程度の活性を示した．４．活性はATP加水分解の過程においてリン酸化酵素を形成するP型ATPaseの阻害薬であるvanadateとエタクリン酸によっては阻害されなかった．５．活性は２価金属イオンのキレーターであるEGTAおよびEDTAにより濃度依存性に阻害されたが，ビスホスホネートによっては阻害されなかった．６．遊離Ca濃度100 nMでは， Ca-ATPase活性はほぼ検出されないが，カルモジュリンを添加すると濃度に依存して活性は増大し，50 ％活性化濃度は約6 μMであった．７．カルモジュリン非添加における活性は，カルモジュリン拮抗薬であるW7によって濃度依存性に抑制され，50 ％阻害濃度は0.3 mMであった．以上の結果は，E1細胞にはアルカリ性至適pHのP型ではないカルモジュリン依存性Ca-ATPaseが存在することを示唆する．本酵素は，形態学的に存在が示唆されるCa-ATPaseと類似しており，硬組織形成に関与する可能性がある．, Morphological studies suggest the presence of Ca-ATPase at alkaline pH optimum at the site of hard tissue formation, but there are few reports on enzymological properties. Therefore, we investigated Ca-ATPase activity using clonal osteoblastic cells (MC3T3-E1). The cells were cultured until calcification. The cells were then ultrasonically crushed. Further, they were centrifuged to obtain a membrane fraction. The ATPase activity was measured by measuring inorganic phosphate produced by ATP hydrolysis by the Chifflet method. The following results were obtained : 1. Ca-ATPase and Mg-ATPase exist in membrane fractionation. They are inhibited by thapsigargin. Ca-ATPase activity is inhibited by Mg. Mg-ATPase is inhibited by azide, but Ca -ATPase was not inhibited. Both are different enzymes. 2. Ca-ATPase activity increased with Ca concentration dependence, saturated at 1 mM free Ca concentration, and 50% activation was 0.3 mM. 3. Ca-ATPase activity increased in pH dependence and showed maximum activity at pH 9.1. It is nearly three times that of pH 7.5. It is the same value up to pH 10.0. 4. Ca-ATPase activity is not inhibited by vanadate, an inhibitor of P-type ATPase. Its activity is not inhibited by ethacrynic acid, an inhibitor of Mg-ATPase. 5. Ca-ATPase activity is inhibited in a concentration-dependent manner by EGTA and EDTA of bivalent metal chelators. Its activity is not inhibited by bisphosphonates. 6. At free Ca concentration of 100 nM, Ca-ATPase activity in the absence of calmodulin was not detected. Ca-ATPase activity increases with the addition of calmodulin depending on the concentration, and the 50 % activation concentration is about 6 μM. 7. Ca-ATPase activity is inhibited in a concentration-dependent manner by W7 which is a calmodulin antagonist when calmodulin is not added. The 50 % inhibitory concentration is 0.3 mM. The above results suggest that Ca-ATPase in MC3T3-E1 cells is calmodulin-dependent, which is optimal at alkaline pH and not P-type. This enzyme may be identical to Ca-ATPase which is morphologically suggested to be present, and it may be involved in hard tissue formation.

形態学的な研究から，硬組織形成部位にアルカリ性至適pH のCa-ATPase の存在が示唆されているが酵素学的な性質の報告は少ない．そこで骨芽細胞様細胞であるMC3T3-E1 細胞の保持するCa-ATPase 活性に関して研究を行った．細胞を石灰化時期まで培養後回収し，超音波破砕後遠心分離操作を行って膜分画を得た．ATP 加水分解により生じた無機リンをChifflet 法で定量してATPase 活性を測定し，以下の結果を得た．1．膜分画にはカルシウム（Ca）あるいはマグネシウム（Mg）により活性化されるATPase が存在し両酵素ともthapsigargin によって阻害された．Ca 存在下のATPase 活性はMg によって拮抗されることと，Mg-ATPase を阻害するazide によって阻害されないことから両酵素は別の酵素と示唆された．2．Ca-ATPase 活性はCa 濃度依存性に増加して1 mM の遊離Ca 濃度で飽和し，50％活性化濃度は0.3 mM であった．3．活性はpH 依存性に増加した．pH 9.1 でpH 7.5 のほぼ3 倍の活性を示して最大となりpH 10.0 までは同程度の活性を示した．4．活性はP 型ATPase の阻害薬であるvanadate とエタクリン酸によっては阻害されなかった．5．活性は2 価金属イオンのキレーターであるEGTA およびEDTA により濃度依存性に阻害されたが，ビスホスホネートによっては阻害されなかった．6．遊離Ca 濃度100nM では， Ca-ATPase 活性はほぼ検出されないが，カルモジュリンを添加すると濃度に依存して活性は増大し，50％活性化濃度は約6 μM であった．7．カルモジュリン非添加における活性は，カルモジュリン拮抗薬であるW7 によって濃度依存性に抑制され，50％阻害濃度は0.3 mM であった．以上の結果は，E1細胞にはアルカリ性至適pH のP 型ではないカルモジュリン依存性Ca-ATPaseが存在することを示唆する．本酵素は，形態学的に存在が示唆されるCa-ATPaseと類似しており，硬組織形成に関与する可能性がある．, (主査) 特任教授 鈴木 邦明, 教授 田村 正人, 教授 網塚 憲生, 歯学研究科（口腔医学専攻）

本研究は，骨芽細胞様MC3T3-E1（E1）細胞を用い，石灰化に伴う無機イオンの輸送に関与する可能性のある各種ATPaseに対するエストロゲンの作用を明らかにすることを目的として行なった．各種濃度の17 β-エストラジオール（17 β-E）存在下で10，20，30日間培養したE1細胞のホモジェネートを測定に使用した．アルカリ性ホスファターゼ（ALP）活性とATPase活性は，反応で遊離した無機リンを定量して測定した．１．ALP活性は，どの日数でも10－9Mから10－5Mの17 β-Eで濃度に依存して増加する傾向を示し，10－5Mでその作用は顕著であった．17 β-EはE1細胞の石灰化を促進し，10－5Mではその作用が強いことを示唆する．２．Na,K-ATPase活性を17 β-Eは20日目に約２倍増加したが，17 β-Eの濃度依存性は認められなかった．３．Ca-ATPase活性は，10－9M及び10－7Mの17 β-E存在下ではコントロールとの有意な差は認められなかったが，10－5Mの17 β-Eではどの日数でも有意に増加した．一方，Ca,Mg-ATPase活性も17 β-Eにより増加したが，17 β-Eの濃度依存性は顕著ではなかった．４．Mg-ATPase活性に対する17 β-Eの作用は，20及び30日ではALPに対する作用に類似していたが，20日での17 β-E濃度依存性は観察されなかった．以上の結果から，17 β-EによるE1細胞の各イオン輸送ATPase活性の活性化時期は異なったが，ATPaseに対する活性化作用は10－5Mという高濃度で強いことが示唆された．石灰化部位に存在すると推測される，アルカリ性至適pHで高濃度のCaを必要とするATPaseは，10－5Mの17 β-Eで顕著に促進されたことから，石灰化部位にCaを供給するATPaseとなる可能性があると考えられた．

Carp myofibrils (Mf) were added with various concentrations of sodium Lglutamate (Na-Glu), and examinations were made of the relationship between added concentrations of Na-Glu and bound water content in Mf or thermal stability with the rate constant (kD) for inactivation of myofibrillar Ca-ATPase as an index of the Mf in quality. At the concentration range used in this study, bound water content in Mf showed higher values for the addition of Na-Glu than no-additive Mf (control); it was gradually increased with an increase in concentration of Na-Glu, and reached the peak at the concentration of 2.0 mol, being slowly decreased at higher concentrations. Log kD for Mf was always smaller for the addition of Na-Glu than control; it was gradually decreased with an increase in concentration of Na-Glu, and reached the peak (highest thermal stability ) at the concentration of 2.0 mol, being slowly increased at higher concentrations. Some correlation was recognized to exist between bound water content in Mf and its thermal stability.

Carp myofibrils (Mf) were added with various concentrations of sodium Lglutamate (Na-Glu), and examinations were made of the relationship between added concentrations of Na-Glu and bound water content in Mf or thermal stability with the rate constant (kD) for inactivation of myofibrillar Ca-ATPase as an index of the Mf in quality. At the concentration range used in this study, bound water content in Mf showed higher values for the addition of Na-Glu than no-additive Mf (control); it was gradually increased with an increase in concentration of Na-Glu, and reached the peak at the concentration of 2.0 mol, being slowly decreased at higher concentrations. Log kD for Mf was always smaller for the addition of Na-Glu than control; it was gradually decreased with an increase in concentration of Na-Glu, and reached the peak (highest thermal stability ) at the concentration of 2.0 mol, being slowly increased at higher concentrations. Some correlation was recognized to exist between bound water content in Mf and its thermal stability., 長崎大学水産学部研究報告, v.62, pp.23-28; 1987