Search

マスト細胞は,自然免疫および適応免疫において様々なメディーターを放出することにより細菌感染免疫応答関与している。PCB126のマスト細胞免疫応答に対する影響を調べるため,PCB126前処理マスト細胞におけるLPS刺激によるサイトカイン誘導能とその関連分子について検討した。LPS刺激によりマスト細胞は前炎症性サイトカイン,ケモカインの遺伝子および蛋白発現が上昇するが,PCB126で前処理されたマスト細胞ではその発現が阻害された。cq1はPCB126特異的にマスト細胞内で強く誘導された。cq1蛋白の作用綴字がNFkBを利用することから,PCB126によるLPS刺激後のマスト細胞サイトカイン産生抑制はNFk-Bにおける競合による可能性が示唆された。, Mast cell plays central regulators of innate and acquired immunities through production of various chemical mediators and cytokines. It has been mentioned that Co-PCB influence host immune systems, however the mechanism remains unclear. We have previously reported that LPS stimulates mast cells to produce various cytokines. In the present study, we have studied the effect of PCS 126 on LPS-mediated cytokine and chemokine production from mast cell. Administration of PCB126 reduced production of pro-inflammatory cytokines and chemokines. Interestingly, PCB126 specifically enhanced Cql mRNA expression which is regulated by NFkB signaling pathway. Pro-inflammatory cytokine and clq induction are mediated by the same NFkB signaling pathway, therefore the reduction of LPS-mediated cytokine production from mast cell pretreated with PCB126 might be competed NFkB signaling pathway.

TGF-βは,細胞の分化・増殖を調節する分泌性蛋白質である。TGF-βはII型受容体に結合した後,I型受容体(Alk5)と会合し,情報を細胞内に伝達する。ラット血管平滑筋細胞では,細胞外領域をコードする12塩基の選択的スプライシングの結果生じる,2つのAlk5 isoform-short form: Alk5-Sおよびlong form: Alk5-L-の存在が知られているものの不明な点が多い。本研究は,マウス組織ならびに各種細胞株におけるAlk5 isoformの遺伝子発現ならびにAlk5 isoformを介した情報伝達を検討した。マウスの臓器(肝臓,腎臓,脾臓,心臓,肺,脳,精巣,筋肉)におけるAlk5 isoformの発現をRT-PCRならびにPAGEにより比較したところ,Alk5-SとAlk5-Lは調べた臓器全てにおいて発現が見られ,発現比は臓器間で違いはなかった。また,ES細胞様細胞(P19),色素細胞(B16),マスト細胞(P-815, BMMC)とマクロファージ(Raw264)においてもAlk5 isoformの発現が見られ,発現比に違いはなかった。次に, Alk5 isoform間での転写活性能を比較した。Alk5を介して情報伝達を行うリガンドとして,TGF-βだけでなく,GDF-8も知られている。そこで,TGF-β_1ならびにGDF-8の情報伝達に関して,機能的なAlk5を欠損しているL17細胞を用いて検討した。Alk5の活性化によりFoxH2依存的に転写が促進されるAR3-lucをreporterとしてluciferase-based reporter assayを行ったところ,いずれのAlk5 isoformを発現させた場合でも,TGF-β_1とGDF-8はともに用量依存的にAR3-lucの転写を促進した。Alk5発現時の各リガンドに対するEC_濃度は,TGF-β_1をリガンドとした場合もGDF-8をリガンドとした場合もAlk5 isoform間で違いはなかった。以上のことから,Alk5の2つのアイソフォームはマウスの様々な臓器および細胞で発現しており,今回調べた活性に関して,これらの両方が同等にTGF-β/GDF-8の受容体として機能していると考えられた。, Mouse TGF-β type I receptor, Alk5, encodes two types of mRNA generated by alternative splicing of four amino acids in the extracellular region. In the present study, the expression and function of alternative splice variants of Alk5, i.e., Alk5-L (Alk5 with the four amino acids) and Alk5-S (Alk5 without the four amino acids), were examined. Expression of Alk5 was detected in all examined tissues, and no significant differences in the ratio of Alk5-S to Alk5-L were detected between tissues. Expression of Alk5 was also detected in various cells, with Alk5-L being especially abundant in A-6 ES cells. No clear difference in Smad2 phosphorylation in response to treatment with TGF-β_1 was detected between L17 cells expressing Alk5-S and those expressing Alk5-L. Consistent with these results, transcription mediated by Alk5-S in L17 cells treated with TGF-β_1 was comparable to that mediated by Alk5-L. In addition, alternative splicing had no effect on transcriptional activation induced by GDF-8, a member of the TGF-β family. The present results indicate ubiquitous expression of Alk5 isoforms in mouse tissues and cells, and insignificant effects of alternative splicing on signaling induced by TGF-β_1 and GDF-8.

ボルナ病ウイルス(borna disease virus;BDV)は,馬や羊に髄膜炎あるいは脳脊髄炎をおこし,神経疾患や時に致死的な経過を引き起こすボルナ病の原因ウイルスである。ところが,ラットにおいて高病原性であるCRNP5株は,免疫応答の未熟な新生仔ラットに感染させると脳炎は認められないものの重篤なボルナ病を発症する。従って,CRNP5株は免疫応答非依存的に感染ラットを発症させること,すなわち直接的/間接的な中枢神経障害がある可能性が示唆されていた。そこで,本研究では,ボルナ病発症における宿主の免疫応答の必要性について調べるために,T細胞機能欠如ラット(ヌードラット)における病原性を解析した。4週令のヌードラットにCRNP5株とCRP3株を感染したところ,CRNP5株感染群は全頭重篤なボルナ病を発症したが,CRP3株感染ラットは7週間の観察期間中に発症は認められなかった。CRNP5株感染ラットでは,海馬の神経細胞層が消失し,特に錐体細胞層における神経細胞変性が顕著だった。以上の結果から,CRP3株はT細胞性免疫応答介在性にボルナ病を発症すること,一方,CRNP5株は発症には宿主のT細胞性免疫は必要としていないことが強く示唆された。, Borna disease virus (BDV) causes classical Borna disease (BD), a fatal mononuclear inflammatory encephalomyelitis with severe signs of neurological disease in horses and sheep. Classical BD in adult rats is in large part due to immunopathogenic damage to the nervous system by blood-borne inflammatory cells. However, newborn rats inoculated with mouse-adapted BDV variant (CRNP5) develop severe neurological disease without encephalitis. Thus, it is suggested that rats infected with CRNP5 develop BD without immune response, and CRNP5 is directly and/or indirectly due to damage to the central nervous system. In order to gain a better understanding of immune responses contributions to BD outcomes, we studied the neuropathogenesis of BDV in athymic nude rats (rnu/rnu), naturally deficient in the T-lymphocyte system. Four-week old female nude rats were either inoculated intracranially with 2×10^3 FFU of rat-adapted prototype variant (CRP3) (n=7) or CRNP5 (n=7) or an equal volume of uninfected mouse brain material (n=7). All CRNP5-infected nude rats developed fatal neurological disease although all CRP3-infected rats survived to 7 week post inoculation without obvious neurological signs of disease. No evidence of inflammatory cell infiltration was observed in rats infected with CRP3 or CRNP5, but an intensive gliosis was present. The brains of CRNP5-infected rats showed severe neuronal degeneration in pyramidal neurons in hippocampus. These results suggest that the cellular immune response to virus infection contributes to BD outcome in CRP3-infected rats but CRNP5-infected rats.

TGF-βファミリーに属する分子群は,生命を維持する上で重要と考えられる生物現象の多くに関与しているが,現在知られている情報伝達経路は極めて単純である。したがって,多様な生物活性を惹起するためには,標的細胞の種類に関わらない普遍的な情報伝達機構と標的細胞特異的な情報伝達機構があるものと推測される。そこで,TGF-βファミリーが如何にして多機能を発揮するかを分子レベルで明らかにすることを目的として本研究を行った。本年度は,免疫担当細胞であるマスト細胞を用いて,TGF-βファミリーによる標的細胞特異的な情報伝達についての解析を試みた。マウスの骨髄より調製した前駆マスト細胞(BMMC)においてactivin A(4 nM)刺激2時間後に誘導される遺伝子群を網羅的に解析したところ,CRAL/TRIO並びにGOLDドメインを有するtocopherol-associated protein(Tap) がactivin Aによって誘導されることが明らかになった。activin A刺激によるTap発現の増加は,マスト細胞株であるMC/9においても認められたが,マクロファージ細胞株であるRAW264,メラノーマ細胞株であるB16や胚性腫瘍細胞株であるP19ではactivin A処理によってTapの増加は認められなかった。また,BMMCにおけるTap誘導は,TGF-β_1(200pM)刺激後にも認められたのに対して,BMP-2(4nM)刺激時には認められなかった。一方,activin/TGF-βのI型受容体キナーゼの阻害剤であるSB431542の前処理によってこの遺伝子誘導は減少したが,その程度は,activin/TGF-β誘導性の別の遺伝子群(mmcp-1とmmcp-7)のSB431542による抑制に比べて小さいものであった。Tapがactivin/TGF-β刺激によって誘導されることの意義を調べるため,activin/TGF-β responsive reporterを用いて解析したところ,Tap存在下によってactivin/TGF-β シグナルは増強された。Tap発現がactivin/TGF-βによって誘導されるのはマスト細胞に特異的であり,誘導されたTapはactivin/TGF-βシグナルの増強因子であると考えられた。, In order to gain better understanding on multifunction of pluripotent TGF-β family members at the molecular level, the genes that were up-regulated in response to treatment with members of the TGF-β family were investigated in mouse bone marrow-derived cultured mast cells (BMMC). The cDNA microarray analyses indicated that in BMMC, five genes were induced by treatment with 4nM activin A, a member of the TGF-β family, for 2h. Tocopherol-associated protein (Tap) was one of the induced genes, and the Tap induction in response to activin A treatment was confirmed by competitive RT-PCR and real-time RT-PCR analyses. Treatment with TGF-β_1 at 200pM but not BMP-2 at 4nM also increased Tap gene transcript in BMMC. Activin A-induced Tap expression was detected in BMMC and MC/9 mast cells but not in RAW264 macrophage-like cells, B16 melanoma cells or P19 embryonic carcinoma cells. Treatment with > 1 μM SB431542, an inhibitor of activin and TGF-β type I receptors ALK4/5, reduced responsiveness of Tap expression to TGF-β_1, whereas < 0.5 μM SB431542 effectively reduced TGF-β_1-induced expression of mmcp-1 and mmcp-7. Induction of Tap was also detected in BMMC from Smad3-null mice, although the levels were lower than observed with wild-type mice. These results suggest that Tap is induced not only through an activated ALK4/5- and Smad3-mediated mechanism but also through an ALK4/5-independent mechanism. Reporter assays indicated that Tap expression enhances transcription mediated by the activin/TGF-β pathway. Thus, the present results suggest that Tap induction in response to activin/TGF-β occurs predominantly in mast cells and serves as a positive regulator in activin/TGF-β signaling.

細菌感染におけるマスト細胞の役割はほとんど注目されていない。しかしながら,近年の多くの研究からマスト細胞が多様な腸内細菌による感染症に対する感染防御の重要な細胞であることが示されてきた。本研究ではマスト細胞欠損マウス(WBBF1-W/W^v)を用いて,細菌感染におけるマスト細胞感染防御能検討した。その結果,(1)マスト細胞はアドヒジョンタンパク質により活性化される。(2)細菌は活性化されたマスト細胞によって殺菌されること,(3)活性化されたマスト細胞はIL-3産生し,それがオートクラインによってマスト細胞数の増殖をもたらすことがわかった。これらのことから,細菌感染において,マスト細胞は重要な役割を果たしていることが示唆された。, The role of mast cells in infections is invariably thought of as a detrimental one. However, recent studies have shown that mast cell play a key role in host defense against various enterobacterial infections. In this study, using mast cell-dificient and mast cell-sufficient mice we have investigated the protective role of mast cells in the infections. Our findings indicate that i. the mast cells are activated by adhesion protein, ii. Killing bacteria is dependent on the activated mast cells, and iii.activated mast cell secret IL-3 and the IL-3 promote mast cell proliferation by autocrine. Taken together, these findings suggest a beneficial role of mast cells in infections in mice.

Activinシグナル伝達の組織特異的制御を調べた。前駆マスト細胞をactivin AあるいはTGF-β_1刺激するとmMCP-7 mRNAレベルは上昇した。リポーターアッセイによるプロモーター領域の解析から,この遺伝子発現の上昇は転写レベルの制御であり,activin A/TGF-β_1の細胞内シグナル伝達分子の一つであるSmad3が関与していることが分かった。マスト細胞の分化に組織特異的転写因子であるMITFが関わっていることが知られているのでmMCP-7転写とMITFとの関係を検討したところ,Smad3によるmMCP-7転写はMITFの共発現によって抑制された。MITFとSmad3は細胞内で複合体を形成し,Smad3のMH1+linker領域とMITFのC末端がこの複合体形成に必要であった。しかしながら,複合体形成は,MITFによるSmad3シグナル抑制に対して必要条件でも十分条件でもなかった。Smad3のMH2領域によるmMCP-7転写上昇はMITFの共発現によって抑制され,N末端を欠いたMITFはSmad3シグナルを抑制しなかった。MITFの共発現によってSmad3の蛋白発現量は減少し,Smad3蛋白発現量とシグナル活性は相関した。以上の結果,MITFはactivin//TGF-βシグナル伝達を組織特異的に抑制することが明らかになった。, Tissue-specific regulation of activin signaling was examined in mast cells. Gene expression of mouse mast cell protease-7 (mMCP-7) was up-regulated by activin A and TGF-β_1 in bone marrow-derived cultured mast cell progenitors. Smad3, a signal mediator of the activin/TGF-β pathway, transcriptionally activated mMCP-7. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF), a tissue-specific transcription factor predominantly expressed in mast cells, melanocytes, heart and skeletal muscle, inhibited Smad3-mediated mMCP-7 transcription. MITF associated with Smad3, and the C-terminus of MITF and the MH1 and linker region of Smad3 were required for this association. Complex formation between Smad3 and MITF was neither necessary nor sufficient for the inhibition of Smad3 signaling by MITF. MITF inhibited the transcriptional activation induced by the MH2 domain of Smad3. In addition, MITF truncated N-terminal amino acids could associate with Smad3, but did not inhibit Smad3-mediated transcription. The level of Smad3 was decreased by co-expression of MITF but not of dominant-negative MITF, which resulted from proteasomal protein degradation. The changes in the level of Smad3 protein were paralleled by those in Smad3-mediated signaling activity. These findings suggest that MITF negatively regulates Smad-dependent activin/TGF-β signaling in a tissue-specific manner.

小眼球症関連転写因子（Mitf）は塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス-ロイシンジッパー（bHLH-LZ）構造を持つ組織特異的転写因子であり, 破骨細胞, マスト細胞, 神経堤由来メラノサイト, 網膜色素上皮細胞などの分化制御因子である。Mitfには, N末領域のみの配列が異なる少なくとも9種類のアイソフォーム（Mitf-A, -B, -C, -D, -E, -H, -J, -M, -mc）と, さらにエクソン6aの選択的スプライシングによる変異体（6abと6b）が存在することが知られている。本研究では, RAW264細胞を用いて, RANKL刺激による破骨細胞様細胞への分化におけるMitfの各アイソフォームと変異体の遺伝子発現および破骨細胞分化マーカー遺伝子の発現をRT-PCR, リアルタイムPCR, PCR-RFLP法により調べた。その結果, RANKL刺激によりMitf-Eの特徴的な遺伝子発現が認められた。また, RANKL刺激によりTRAP, カテプシンK, OSCAR, CTRの破骨細胞分化マーカー遺伝子が発現することを確認した。次に, 分化マーカー遺伝子の各制御領域をもつルシフェラーゼレポーターを用いて, 各Mitfアイソフォームの転写活性機能を比較したところ, TRAPレポーターに対してMitf-J/D/Eがわずかに転写活性を上昇させ, さらにc-junの共発現が相乗的効果を示すことがわかった。破骨細胞分化の後期過程においてMitfアイソフォームの特徴的な発現及びMitfとその他の転写因子との機能的相互作用が破骨細胞分化を制御しているのかもしれない。, Microphthalmia-associated transcription factor (Mitf), a member of the basic helix-loop-helix leucine zipper (bHLH-ZIP) transcription factors, is required for proper development of several cell lineages including osteoclasts, melanocytes, retinal pigment cells and mast cells. Mitf has been implicated to be a key regulator of the later steps of osteoclastogenesis, but the role of Mitf is not fully elucidated; although nine distinct Mitf isoforms, which contain an isoform-specific first exon and are identical exons 2 to 9, have been identified at the RNA level, it is unclear whether any isoforms are unique to the osteoclast lineage cells. Treatment of RAW264 macrophage-like cells with sRANKL (100 ng/ml) for 72 h resulted in the increase in the number of Trap-positive multinucleated cells. The present study examined expression of Mitf isoforms in sRANKL-induced osteoclast-like cells. The s-RANKL treatment induced robust expression of Mitf-E gene. In addition, Tfe3, another member of the bHLH-ZIP family, was also significantly expressed throughout the differentiation of RAW264 cells. E isoform of Mitfs may be involved in the regulation of the late process in osteoclast development. Previous studies have revealed that tartrate-resistant acid phosphatase (Trap) is a transcriptional target of Mitf in osteoclasts. Thus, we also examined factors affecting Trap gene transcription in HepG2 cells that are responsive to Mitf overexpression. Transcriptional activation assays using luciferase-based reporter gene containing Trap promoter (-2049 - +1) revealed that overexpression of Mitf-J/-D/-E but not Mitf-A slightly increased luciferase expression. The overexpression of c-Jun but not c-Fos and JunB increased expression of Trap reporter gene, and synergistic effects of c-Jun and Mitfs (-A and -J/-D/-E) on Trap gene transcription were detected. In contrast, no synergism was observed between Mitf and the other AP-1 component (c-Fos and JunB). Distinct expression of Mitf isoforms and functional interaction between Mitf and the other transcription factor such as c-Jun during the terminal differentiation of osteoclasts suggests discrete regulation of osteoclastogenesis.

組織特異的転写因子であるMitfには,exon 1のalternative splicingによりN末領域のみの配列が異なる少なくとも9種類のアイソフォーム(Mitf-A, -B, -C, -D, -E, -H, -J, -M, -mc)がある。Mitf-A, -H, -Mではさらに,exon 6a(6個のアミノ酸をコードする)のalternative splicingによるvariant (6a+bと6b)が存在することが知られている。本研究では,色素細胞,マスト細胞,マクロファージ系細胞と心筋細胞でのMitfの各アイソフォームとvariantの遺伝子発現を調べ,細胞種によって異なるアイソフォームの発現が見られることを示した。また,これらの細胞に存在するMitf -E, -J, -mcのアイソフォームにも6a+bと6bのvariantがあることを見つけた。PCR-RFLP解析により,これら6a+bと6bのvariantの発現量はアイソフォームや細胞種に関係なく,ほぼ同じであることがわかった。次に,これらのvariantの転写活性機能を比較するため,ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。Mitfの応答遺伝子であるTyrosinase, Tyrp-1, Mmcp-6, PAI-1のそれぞれの制御領域配列をもつルシフェラーゼレポーターを構築し,Mitf-A, -D/E, -Mそれぞれの6a+bと6bのvariantを強制発現させた。Tyrosinase制御領域配列をもつレポーターに対して6a+bは6aのvariantに比べてより強い促進活性を示したが,Tyrp-1, Mmcp-6, PAI-1のレポーターに対しては,Tyrp-1レポーターへのMitf -D/Eのvariantの活性を除いて,6a+bと6bのvariantで活性に違いは見られなかった。以上,細胞に依存したMitfアイソフォームの多様な遺伝子発現パターンと異なる転写活性を示した。, Microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) is a tissue-specific transcription factor. At least nine distinct mouse isoform mRNAs are encoded by alternative splicing of the first exon of Mitf (Mitf-A, -B, -C, -D, -E, -H, -J, -M and -mc), while exons 2 to 9 of all Mitf isoforms examined to date are identical. In addition, alternative splice variants of exon 6a encoding 6 amino acid proximal to the basic region of the protein are known in Mitf-A, -H, and -M. In this study, we identified alternative splice variants of exon 6a in other Mift isoforms (Mitf-E, -J and -mc) in melanocytes, mast cells, macrophages, and heart. We also compared the transcriptional activity of Mitf variants containing exon 6a to that of Mitf variants that did not contain exon 6a. PCR-RFLP analysis revealed that expression of Mitf with exon 6a was comparable with that of Mitf without exon 6a, irrespective of the specificity of the first exon, or cell type, although Mitf isoforms with different first exons were expressed in a cell type-dependent manner. Luciferase-based reporter assays revealed that transcription of Tyrosinase, which is known Mitf-regulated gene, was elicited more efficiently by expression of Mitf isoforms containing exon 6a, compared to isoforms that did not contain exon 6a. However, when transcription of Tyrp-1, Mmcp-6 and Pai-1 was examined, significant differences were detected between Mitf isoforms with exon 6a and those without exon 6a, except for Tyrp-1 transcription by Mitf-D/E isoform. These results reveal a diverse pattern of gene expression and different transcriptional activities of Mitf isoforms, suggesting discrete regulation of gene transcription in specific tissues by Mitf.

マスト細胞におけるAhRシグナリング関連分子のmRNAの発現とCo-PCBsの影響を検討した。マスト細胞株のうちRBL-2H3とIC-2,初代培養マスト細胞(BMCMCs)がAhRとARNTのmRNAを発現していた。またレポーターアッセイのレシピエントとしてよく知られているRaw294およびCHO-K1はいずれのmRNAも発現していなかった。陽性対照として使用したTCDDおよびCo-PCBsのいずれの濃度でもマスト細胞の脱顆粒およびTNF-αの放出に影響しなかった。これらの結果は,マスト細胞がCo-PCBsのターゲット細胞ではあるが,脱顆粒およびTNF-αの放出が介在した免疫反応には直接影響しないことを示唆している。, In this study, we examined the gene expression of molecules involved in AhR signaling and the effects of Co-PCBs in mast cell. The niRNA expression of AhR and ARNT was detected in RBL-2H3, IC-2 and Bone marrow derived cultured mast cell (BMCMCs). Raw 294 and CHO-K1 known as recipient cell in reporter assay, were not expressed both mRNAs. Any concentrations of Co-PCBs and TCDD as control did not affected degranulation and TNF-a release in both of RBL-2H3 and BMCMCs. These results suggest that mast cells are the targets of Co-PCBs, but Co-PCBs does not involved directly immune-response through both degranulation and TNA-a release in mast cells.

Toll-like receptors (TLRs)は自然免疫応答において,リポポリサッカライド(LPS)やペプチドグリカン(PG)などの細菌構成物質によるシグナル伝達を司る分子として知られている。本研究ではTLRシグナル伝達に関連する遺伝子のマウス骨髄由来培養マスト細胞(BMCMCs)での発現および細菌抗原として主要な分子であるLPSおよびPGのマスト細胞機能に対する効果を検討した。BMCMCsはTLR2,TLR4,TLR6のmRNAを発現していた。さらにTLRシグナリング関連分子であるCD-14,MD-2,MyD88も発現していた。LPSおよびPGはマスト細胞の脱顆粒を誘導しなかったがTNF放出は僅かに上昇した。また,両物質はMMP-9の発現を濃度依存性に促進した。アポトーシスの誘導はLPSのみに認められた。これらの結果はマスト細胞は細菌抗原であるLPSおよびPGによる標的細胞のひとつであり,部分的に異なるもののマスト細胞における機能および分子を誘導することが示された。, Toll-like receptors (TLRs) transmit signals of bacterial components such as lipopolysaccharide (LPS) and peptidoglycan (PG) in the innate immunity. Our previous studies revealed that mast cells function as effector cells for protecting mice against lethal enterobacterial infrctions. In the present study we examined gene expression of molecules related with the TLR signaling, and effects of LPS and PG in bone marrow derived cultured mast cells (BMCMC). The mRNA expression of TLR 2, 4 and 6 was detected in BMCMC. In addition, CD-14, MD2 and MyD88, which are also involved in the TLR pathway, were also expressed. Neither LPS nor PG affected degranulation in BMCMC. In contrast, release of tumor necrosis factor was slightly increased in response to LPS and PG. Both LPS and PG enhanced expression of pro-matrix metalloproteinase (MMP) -9 in a dose-dependent manner, and DNA fragmentation was induced by LPS but not by PG. These results suggest that mast cells are targets of LPS and PG and that the functions of these molecules produced exclusively by bacteria are partly overlapped but distinct.