Search

Osteoporose er en progressiv metabolsk skjelettsykdom som er preget av en ubalanse i beinhomeostasen mellom osteoklasters nedbrytning av bein og osteoblasters oppbygging av bein. Osteoklaster (OC) er multinukleære celler som har sitt opphav i monocytter/makrofager og har unik evne til å resorbere bein ved å skille ut ulike cysteinproteaser (f.eks. cathepsin K) og matriksmetalloproteaser (f.eks. MMP-9). I denne masteroppgaven ble regulering av cysteinproteaser (legumain, cathepsin B, K og L), deres endogene inhibitorer (cystatin C og E/M) og matriksmetalloproteaser (MMP-2 og -9) studert ved enzymaktivitetsmålinger, immunoblotting og real-time PCR i humane OC-liknende celler, mens legumainsekresjon ble analysert med ELISA. En human THP-1 monocytt-cellelinje ble brukt som cellemodell og en metode ble etablert i laboratoriet for differensiering av OC etter stimulering med forbolesteren PMA, RANKL og/eller M-CSF som førte til dannelse av multinukleære celler. Legumainaktivitet og mRNA-ekspresjon var uendret i OC-liknende celler, men RANKL og/eller M-CSF førte til oppregulering av legumain moden form (36 kDa). Differensiering i serumfritt dyrkningsmedium ga betydelig lavere totalproteinkonsentrasjoner i cellene sammenliknet med serumholdig medium. Eksponering for medium med høyt innhold av prolegumain under OC-differensiering førte til økning i legumainaktivitet i cellene, særlig for celler stimulert med M-CSF. Dette tydet på opptak og prosessering av prolegumain i OC, som ble bekreftet ved immunoblotting. Eksponering for cystatin E/M førte derimot ikke til endring i legumainaktiviteten, som indikerer at cellene ikke tok opp cystatin E/M. Siden makrofager også er involvert ved beinremodellering, så ble PMA-behandlede THP-1 celler polarisert til M1- og M2-makrofager ved bruk av henholdsvis IFNγ og LPS eller IL-4, og regulering av legumain, cathepsin B og K ble studert. M1- og M2-makrofager viste ulik morfologi, cysteinproteaseaktivitet og -mRNA-ekspresjon. M1-makrofager uttrykte og sekrerte signifikant mer legumain enn M2- eller upolariserte makrofager. Eksponering for prolegumain under polariseringen førte til opptak og prosessering av legumain i M2- og upolariserte makrofager, men ikke i M1. I bein er det et samspill mellom OC og makrofager, og proteiner skilt ut av en celletype kan tas opp av/eller påvirke en annen celletype. Denne masteroppgaven har vist at prolegumain kan skilles ut og tas opp av både OC og makrofager, men om dette har betydning for beinremodelleringen er foreløpig ikke kjent.

Mange ondartede krefttyper har vist seg å være relativt resistente mot forskjellige typer ikke-kirurgiske terapier. Derfor er det et stort behov for utvikling av nye metoder for behandling av kreft, inkludert ovariekreft. Fotodynamisk terapi (PDT) er en selektiv behandlingsmetode for flere krefttyper, som er basert på akkumulering av fotosensitizere (PS) i kreftvev, aktivering av PS ved belysning og videre skade på tumorceller. En annen metode er en ny teknikk som heter fotokjemisk internalisering (PCI) som tar utgangspunkt i PDT og er utviklet for å frigjøre legemidler fra endosomer til cytosol før degradering i lysosomer ved å bryte membraner til endocytiske vesikler slik at legemiddelet skal kunne utøve sin intracellulære effekt på kreftceller. Lysosomale cysteinproteaser deltar i prosesser for kreftutvikling og -progresjon, samt celledød. PDT er vist å ha effekt på cathepsin B og L, men en eventuell effekt på legumain er ukjent. I denne studien ble ovariekreftcellelinjen SKOV-3 brukt som cellemodell og effekten av PDT på aktivitet, sekresjon og molekylære former til lysosomale cysteinproteaser (spesielt legumain og cathepsin B), ble studert. Videre ble det undersøkt hvordan internalisering av prolegumain og legumain- og cathepsin-inhibitorer (cystatin E/M og E64d) påvirker celleviabilitet etter PDT. I tillegg ble effekt av internalisering av inhibitorene på aktivitet og molekylære former av legumain og cathepsin B, og lysosomale størrelser studert. Sammenligning av PDT og PCI (med gelonin) på celleviabilitet ble også undersøkt. MTT-assay ble brukt for måling av celleviabilitet. Immunfargingsmetoder og fluorescensmikroskopi ble brukt for deteksjon av endo/lysosomale størrelser. Immunoblotting ble brukt for å finne molekylære former til cysteinproteasene. For å finne konsentrasjon av sekrert legumain ble ELISA brukt. Behandling med PDT førte til en signifikant reduksjon i både legumain- og cathepsin B-aktivitet i cellelysater. Både PDT- og PCI-behandling forårsaker signifikant reduksjon av celleviabilitet, men PCI av gelonin resulterter i en signifikant større reduksjon sammenlignet med PDT. Immunoblotting av cellelysat etter PDT-behandling viste reduksjon av både aktiv (36 kDa) og intermediære former (46/47 kDa) av legumain, aktive former (29 og 25 kDa) av cathepsin B, og aktiv form (33 kDa) av cathepsin L. Behandling med E64d (en generell cathepsin-hemmer) i 4 timer før PDT førte til at celledød ble motvirket sammenlignet med kontroll. Behandling av cellene med E64d uten PDT førte til total hemming av cathepsin B-aktivitet etter en time og økning i lysosomale størrelser etter fire timer. Cystatin E/M ble også internalisert og førte til at celledød ble motvirket sammenlignet med kontroll ved PDT, men internalisert cystatin E/M uten PDT-behandling ga hverken hemming av legumain- og cathepsin-B-aktivitet eller har noen påvirkning på deres molekylære former og lysosomale størrelser. I denne studien ble det vist at PDT signifikant hemmer aktiviteten av de lysosomale cysteinproteasene legumain og cathepsin B.

Granmatriske (Lactarius deterrimus), er en av de norske matsoppene som vokser i symbiose med røtter av gran over hele landet. Tidligere studier på de ulike soppartene har vist at β-glukan som er en type polysakkarid og utgjør en viktig del av soppcelleveggen, er kjent på grunn av sine immunmodulerende og antitumor aktivitet. Dermed var det av interesse å studere strukturen av polysakkarider isolert fra granmatriske og bestemme i hvilken grad β-glukaner med immunmodulerende effekt forekommer i matsopper som vokser i Skandinavia. Legumain er et proteolytisk enzym og som er involvert i mange inflammatoriske tilstander som slag, ateroskleroser og er i tillegg assosiert i kreftpatogenesen. I den forbindelse ble effekten av prøvene på legumainaktivitet i makrofager testet. Vannekstraktet og alkaliekstraktet av granmatriske som ble kalt henholdsvis WLd og ALd, ble karakterisert i forhold til karbohydratssammensetning, bindingsforhold, og molekylvekt. Karakteriseringen av WLd viste innehold av to ulike glukaner, α-1→4 og β1→3 glukan med sidekjeder i posisjon 6, hvor β1→3 glukan har forgreningspunkter på hver 3.glukoseenhet i hovedkjede. I tillegg viste analysene at WLd inneholder et heterogalaktan, α-1 →6 galaktan med forgreining i posisjon 2 med en terminal ikke-identifisert 6-deoksyheksose. HPLC- analysen viste at WLd består av tre molekylvekts-populasjoner. Den første populasjonen har molekylvekt på rundt 2 800kDa, populasjon nummer to har molekylvekt på ca.170kDa og den tredje populasjonen har molekylvekt på 17kDa. Ekstraktet ble så fraksjonert på basis av molekylstørrelse på en gelfiltreringskolonne. Etter gelfiltrering ble WLd delt opp i fire fraksjoner, WLd 1, WLd 2 WLd 3 og WLd 4. De tre første fraksjonene ble analysert videre på HPLC og hadde molekylvekter på henholdsvis 3 456, 219 og 18kDa. Resultater fra GC-MS analysen viste at alle fraksjoner inneholdt β-1→3 glukan, mens WLd 3 utmerket seg med innhold av α-1→4, β1→3 glukaner og et heterogalaktan. GC-MS og NMR-analysene på WLd etter behandling med enzymet α-amylase, viste reduksjon i alfa-glukaner. Basert på metanolyse, GC-MS og NMR-analysene, som viste at det er stort sett glukose i ALd, kom det frem at ALd inneholder to ulike glukaner, α-1→4 glukan og β-1→3 glukan med sidekjeder i posisjon 6, hvor β-1→3 glukan har forgreningspunkter på hver 6. glukoseenhet i hovedkjede. HPLC- analyse av ALd med en TSK-5000 kolonne ga lave signaler på grunn av dårlig vannløselighet, i tillegg viste analysen at ALd består av to molekylvekts-populasjoner. Molekylvekten til den første populasjonen var rundt 3 000kDa og er sannsynligvis aggregater, mens den andre populasjonen representerte den lavmolekylære delen med molekylvekt på 335kDa. ALd ble behandlet med α-amylase og videre undersøkt på metanolyse, HPLC og GC-MS. Resultatene viste at andelen av α-1→4 har gått ned men resultatene etter partiell hydrolyse ikke viste forbedring av ALd løselighet. RAW 264.7 celler ble stimulert med WLd, WLd 3, ALd og de enzymbehandlete prøvene av vannekstraktet og alkaliekstraktet (WLd AB og ALd AB), samt den hydrolyserte prøven ALd H2. De vannløselige prøvene ga en sterk hemming av legumainaktivitet mens ALd og den hydrolyserte prøven, som var dårlig løselig, viste ingen effekt på legumainaktivitet. Den enzymbehandlete prøven av alkaliekstrakt ga en hemming av legumainaktivitet. Resultatene samsvarer ikke med en tidligere studie som viste at partikulært β-glukan vil hemme legumainaktivitet i stor grad mens vannløselig β-glukan ikke gjør det (Berven, Skjeldal et al. 2015). På grunn av mistanken om tilstedeværelse av LPS i prøvene, kunne vi ikke konkludere med sikkerhet at det var β-glukan i prøvene som førte til hemming av legumainaktivitet.

Sopp er kjent over hele verden på grunn av sine ernæringsmessige og farmasøytiske (antitumor, antioksidative, hypotensive, leverprotektive, kolesterolsenkende, antifibrotiske, antidiabetiske, antimikrobiele, antivirale og anty-inflomatoriske) egenskaper. Bioaktive forbindelser fra sopp med antitumor egenskaper er spesielt interessante. Disse egenskapene relateres vanligvis til beta-(1→3)(1→6)-bundne-glukaner. De virker via binding til beta-glukan-spesifikke reseptorer på makrofager, noe som fører til aktivering av adaptiv immunitet. Albatrellus ovinus (fåresopp) er rik på celleveggmateriale, men lite studert fra før. En beslektet art av Al. ovinus (Confluent polypore) inneholder polysakkarider med antitumor aktivitet. Dermed er fåresopp en god kandidat til isolering av mulige bioaktive polysakkarider (inkludert beta-glukaner), karakterisering av deres struktur og undersøkelse av deres effekt på legumainaktivitet i RAW 264.7 makrofager. Legumain er en asparginylendopeptidase som spalter spesifikt proteinsubstrater. Overekspresjon av legumain har blitt rapportert i flere krefttyper. På grunn av høye konsentrasjoner av legumain i svulstens mikromiljø, kan påvirkning av legumain være en mulig strategi for behandling av kreft. Derfor ble det testet i hvilken grad de isolerte polysakkarider fra A. ovinus påvirker legumainaktiviteten. Monosakkaridsammensetning, bindingsforhold og molekylvekt til vannekstrakt WAo (WAoF1 og WAoF2), samt alkaliekstraker AAoSw og AAoIw ble bestemt ved metanolyse, NMR, GC MS, SEC kromatografi og affinitetskromatografi. For å forbedre løselighet av vannuløselig AAoIw ble det forsøkt partiell syre hydrolyse. Begge alkali fraksjonene ble behandlet med alfa-amylase for å fjerne fra beta-glukaner alfa-(1→4)-bundne – D- glukoseenheter som ble oppdaget under strukruroppklaring. I tillegg ble WAoF1, AAoIw, AAoSw og deres alfa-amylase behandlede fraksjoner videre testet i hvilken grad de kan påvirke legumainaktivitet i RAW 264.7-makrofager som produserer legumain og utrykker overflatereseptor Dectin-1, som spiler en viktig rolle i cellular respons for karbohydrater. Resultater: Eksklusjonskromatografi av WAo viste to topper: WAoF1 (Mw 251,0 kDa) som bestod av en alfa-(1 → 6)-bundet - D-galaktan med alfa-L-fukose i posisjon 2 på hver 3. galaktoseenhet og WAoF2 (Mw 12,0 kDa) som inneholdt rester av fukogalaktan, beta - (1→ 3) -bundet D-glukan og alfa - (1→ 4)-bindet -D- glukan med forgreningene i posisjon 6. Det vannløselige fukogalaktanet gav nesten ingen hemming av legumainaktivitet i dosen 1 mg/mL sammenlignet med kontroll, men 41,5 % hemming av legumainaktivitet i dose-responsforsøk uten dose-respons, noe som kan tyde på forurensing av de analyserte prøvene med LPS. WAoF2 ble ikke testet på biologisk aktivitet. Vannløselig alkaliekstrakt AAoSw (Mw 324,5 og 16,7 kDa) hovedsakelig bestod av en beta- (1→ 3) bundet -D- glukan med enkle glukoseenheter (eller sidekjeder) på hver 5. glukoseenhet. Samtidig ble det oppdaget små mengder av alfa-(1→ 4)(1→ 6) -bundet -D- glukan. Vannløselig beta - (1→3)(1→6)-bundet -D- glukan gav nesten ingen hemming av legumainaktivitet sammenlignet med kontroll og ble derfor ikke testet videre i dose-responsforsøk. Samtidig ble det funnet at amylasebehandlet beta-glukan hemmet legumainaktivitet sammenlignet med kontroll, men uten dose-respons. Dette kan tyde på at polysakkarider i prøven ble forurenset med LPS. Tilstedeværelse av potente LPS gav ingen doserespons i dose-responsforsøk. Vannuløselig alkaiekstrakt AAoIw (Mw 285,5 kDa og 15,9 kDa) bestod av vannuløselig beta - (1→3)-bundet -D- glukan med enkle glukoseenheter (eller sidekjeder) på hver 8. glukoseenhet. Samtidig ble det oppdaget nesten like store mengder av alfa-(1→4) -bundet -D- glukan med forgreninger (enkle glukoseenheter eller sidekjeder) i påsisjon 6 på hver 18. glukoseenhet. AAoIw gav 22,5 % hemming av legumainaktivitet sammenlignet med kontroll, størst hemming av legumainaktivitet mellom de rå - ekstraktene. Samtidig ble det funnet at amylasebehandlet beta-glukan fra AAoIw hemmet legumainaktivitet sammenlignet med kontroll, men uten dose-respons. Alt dette kan tyde på at polysakkarider i prøven ble forurenset med LPS. På basis av de utførte analysene var det foreslått at celleveggen på fåresopp består av:  -alfa-(1 → 6)-bundet - D-galaktan med alfa- L- fukose i posisjon 2 på hver 3. galaktoseenhet ; -beta-(1→3) bundet-D-glukan med enkle glukoseenheteter (eller sidekjeder) i posisjon 6 på hver 5. glukoseenhet;  -beta-(1→3) (1→6) bundet-D-glukan med enkle glukoseenheter (eller sidekjeder) i posisjon 6 på hver 8. glukoseenhet og  alfa-(1→4) (1→6) bundet -D-glukan med enkle glukoseenheter (eller sidekjeder) i posisjon 6 på hver 18. glukoseenhet. Det var nesten umulig å påvise i hvilken grad disse polysakkaridene fra A. ovinus kan påvirke legumainaktivitet i RAW 264.7-makrofager på grunn av mulig LPS kontaminasjon av analyserte prøver.

Legumain er en asparaginyl endopeptidase som generelt er uttrykt i de fleste normale humane vev. Studier har imidlertid vist at proteinuttrykket av legumain er oppregulert i flere faste svulster. Høyt uttrykk av legumain har blitt assosiert med cellemigrasjon og invasjon, og påfølgende dårlig prognose. Årsaken til kreftcellers spredning er fortsatt ikke kjent, men proteaser har blitt antatt å delta i denne prosessen. Proteaser kan derfor være lovende å utnytte i kreftterapi, men manglende kunnskap har ført til svikt i kliniske studier. Foreløpig, er det mange ukjente aspekter ved den subcellulære lokaliseringen, den cellulære transporten og aktiveringen av legumain. I to nylig publiserte studier i forskningsgruppen vår er det funnet at glykosylering av legumain er viktig for legumainprosessering, og at glukosaminoglykaner (GAGs) akselererer autoaktiveringen av normalprodusert (glykosylert) og sekrert pro-legumain. Disse observasjonene ble studert videre i denne oppgaven. I denne studien ble betydningen av N-koblet glykosylering av legumain undersøkt med hensyn på aktivitet, sekresjon og proteinuttrykk av legumain. To ulike celletyper ble utnyttet i studien, en monoklonal legumaintransfektert HEK293-cellelinje (M38L) og en tykk-/endetarmskreftcellelinje (HCT116). N-koblet glykosylering av legumain ble hemmet ved behandling av cellene med tunikamycin, som er et effektivt verktøy i biokjemiske studier. Autoaktivering av henholdsvis glykosylert og uglykosylert prolegumain ble undersøkt ved surgjøring av kondisjonerte medier og cellelysater fra nøytral pH til pH 4.0. I tillegg ble effekten av GAGs (kondroitin-4-sulfat (C4S) og heparansulfat (HS)) undersøkt på autoaktivering av glykosylert og uglykosylert sekrert prolegumain. Resultatene viste at prosessering av legumain til moden, uglykosylert, aktiv form (28 kDa) var totalt fraværende etter tunikamycinbehandling av HCT116-celler, mens formen ble observert i tunikamycinbehandlede M38L-celler. Videre ble det i lysater observert reduksjon i totalproteinkonsentrasjon og legumainaktivitet etter behandling med tunikamycin. Lav konsentrasjon (0,025 µg/ml) av tunikamycin økte signifikant sekresjonen av prolegumain, mens høye konsentrasjoner (1 og 5 µg/ml) hadde tendens til å redusere sekresjonen. Selv om ulike GAGs tidligere er vist å akselerere autoaktivering av glykosylert prolegumain, så viste denne studien at C4S og HS ikke akselererte autoaktivering av uglykosylert prolegumain på samme måte. Det antas derfor at oligosakkarid-gruppene på prolegumain spiller en viktig rolle i interaksjonen med GAGs. Av de to GAGs som ble benyttet i denne studien (C4S og HS) så var det kun C4S som akselererte autoaktivering av prolegumain. GAGs effekt på autoaktivering av prolegumain ser ut å være konsentrasjonsavhengig. Generelt viste resultatene at normal cellulær glykosylering er viktig for aktivitet, stabilitet og sekresjon av legumain.