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CAPES Antitrombina (AT) é uma serpina que está envolvida na regulação da coagulação sanguínea através da inibição de enzimas pró-coagulativas. A heparina é um ativador alostérico da AT que se liga a ela e causa uma mudança conformacional no sítio reativo, o que faz aumentar sua ação anticoagulante. Sendo assim, a fim de obter AT purificada através de separação por afinidade, este trabalho propôs imobilizar heparina utilizando a sua propriedade de se ligar à AT. O suporte para imobilização foram as membranas nanoporosas de óxido de alumínio anódico (AAO), adquiridas da Whatman®. Estas foram tratadas com solução de permanganato de potássio a 0,1 M, 50 ºC por 12 horas e revestidas com polianilina (PANI) a 0,5 M por 2 horas. Posteriormente, uma solução de heparina de 3 mg/mL foi imobilizada ao suporte por 12 horas a 25 ºC e então foi determinada a quantidade de heparina fixada à membrana. O suporte foi incubado com plasma humano por 1 hora à 4 ºC. A remoção das proteínas ligadas ao suporte foi realizada mediante aumento da força iônica, utilizando soluções de NaCl 0,5 M, 1,0 M, 1,5 M e 2,0 M tipo stepwise. Em seguida, os eluatos foram submetidos à eletroforese (SDS-PAGE), segundo metodologia de Laemmli (1970). O percentual da quantidade de heparina imobilizada foi 53,04 % do total ofertado. O tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa) e a dosagem da atividade da antitrombina constataram a presença de antitrombina nos eluatos, a qual começa a dissociar da membrana após concentração de sal de 1,5 M. A presença de AT complexada à membrana foi confirmado pela eletroforese. Os resultados obtidos neste estudo sugerem que este novo modelo de imobilização de heparina pode ser aplicado nas áreas de purificação de proteínas e biomateriais.

Este trabalho teve como objetivo imobilizar heparina ao suporte de exopolissacarídeo celulósica (SEC), proveniente da fermentação do melaço da cana-de-açúcar pela bactéria Zoogloea sp., e por técnicas separação purificar a antitrombina do plasma. O suporte foi funcionalizado através da oxidação parcial com periodato de sódio (NaIO4) seguindo pela adição de polietilenoimina (PEI), que permitiu a ligação covalente com a heparina, posteriormente, a membrana foi reduzida com borohidreto de sódio (BH4). Para obter as melhores condições experimentais de imobilização utilizou-se o desenho experimental fracionário (½ 2K-3) e um delineamento experimental do tipo DCCR (delineamento composto central rotacional) onde se analisou 8 variáveis independentes e suas interações: concentração e tempo de reação dos seguintes reagentes; NaIO4, PEI e BH4, como também tempo de imobilização e agitação que o sistema se manteve. O percentual de heparina fixada ao suporte e a atividade anticoagulante da heparina imobilizada foi estabelecida pelo ensaio de corante de Azul de Metileno e tempo de tromboplastina parcialmente ativada (TTPa), respectivamente. O planejamento experimental aplicado foi satisfatório para determinar as condições ótimas de imobilização e a atividade antitrombótica do material. Enquanto a separação da antitrombina do plasma humano utilizou membranas heparinizadas com uma densidade de heparina variando entre 41,08 – 254,7 μg cm-2 como suporte de separação por afinidade e obteve-se uma quantidade de antitrombina purificada 473,249 ug ml-1 quando incubado o plasma concentrado e 47,80 μg ml-1 para plasma diluídos em salina, nos eluatos de 0,5 a 2,0 NaCl, foi quantificada pelo método de Lowry. Finalmente a presença da antitrombina foi confirmada pela SDS-PAGE e corando com prata.

A antitrombina (AT) é uma serpina glicoprotéica responsável pela inibição fisiológica das proteases da cascata de coagulação. É o receptor-alvo responsável pela ação anticoagulante da heparina e de outros glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs), capazes de potencializar sua ação inibitória sobre, principalmente, fIIa e fXa. Tal modulacão da AT por GAGs está associada intrinsecamente à parte sacarídica desta serpina, uma vez que mudanças no seu padrão de glicosilação modulam sua ativação por polissacarídeos. Em função de efeitos colaterais decorrentes da terapia anticoagulante atualmente disponível, um grande esforço vem sendo dedicado na busca de novos polissacarídeos, capazes de reproduzirem os efeitos terapêuticos da heparina, sem apresentar seus efeitos colaterais. Nesta busca, podem-se incluir polissacarídeos isolados de ouriços-do-mar, como galactanas e fucanas. Particularmente, galactanas 2-sulfatadas, 3-ligadas são anticoagulantes, enquanto que fucanas 2-sulfatadas, 3- ligadas não o são. Contudo, as razões moleculares para tais diferenças ainda permanecem desconhecidas. Diante do exposto, um dos objetivos deste trabalho reside na caracterização do reconhecimento molecular de GAGs obtidos de fontes animais pela AT, através um estudo de modelagem molecular do perfil conformacional da galactana e da fucana 2-sulfatadas, 3-ligadas tanto livres em solução aquosa quanto complexadas à AT, utilizando cálculos ab initio, cálculos de docking receptor-ligante e simulações por dinâmica molecular (DM). Adicionalmente, objetiva-se a descrição do perfil conformacional da estrutura de glicosilação da AT (ATg), através de mapas de contorno e simulações por DM, tendo-se em vista a importância da glicosilação para as propriedades anticoagulantes da AT e da carência de informações conformacionais acerca desta parte da molécula. As simulações por DM da galactana e da fucana 2-sulfatadas, 3-ligadas indicam que ambas apresentam perfis conformacionais semelhantes em solução aquosa. Quando complexadas à AT, os dois polissacarídeos apresentam orientações distintas, o que explica as diferenças nas suas atividade anticoagulantes. Com relação às simulações por DM da estrutura glicosídica da AT em solução aquosa, os resultados mostraram que sua conformação em soluçãodifere significativamente da obtida por métodos de difração de raios-X em cristais. Estes dados evidenciam a existência de distorções na estrutura cristalográfica da AT glicosilada, resultantes de efeitos de empacotamento devido ao cristal. Antithrombin (AT) is a glycoproteic serpin responsible for physiologic inhibition of coagulation cascade proteases. It is the target receptor responsible for heparin and other glycosaminoglycans (GAGs) anticoagulat activities, capable of potentialize its inhibitory action over, mainly, fIIa and fXa. Such AT modulation by GAGs is intrinsically associated with the sacaridic part of this serpin, since changes on its glycosilation pattern modulate its activation by polisaccharides. Due to side effects that occur from the use of the available anticoagulant therapy, efforts have been dedicated in the search for new polisaccharides, capable to reproduce heparin therapeutic effects, in the absence of its adverse effects. In this search, can be included polisaccharides isolated from sea urchins, like galactans and fucans. Particularly, 2-sulfated, 3-linked galactans are anticoagulants, while 2- sulfated, 3-linked fucans are not. However, the molecular reasons of such differences are still unknown.Thus, this work aims the characterization of the molecular recognition pattern of GAGs obtained from animal sources by AT, through a molecular modeling study of 2- sulfated, 3-linked galactan and fucan conformational profiles, free in aqueous solution or complexed with AT, using ab initio, ligand-receptor docking and molecular dynamics (MD) calculations. Additionally, we purpose the description of the conformational profile of AT glycosilation structure (ATg) using energy contour plots and MD simulations, due to the importance of ATg to AT anticoagulant properties and the lack of conformational information regarding this part of the protein. 2-sulfated, 3-linked galactan and fucan decasaccharide MD simulations indicate that both polisaccharides present similar conformations in aqueous solution. When complexed with AT, the two polisaccharides present distinct orientations, which explains the differences in its anticoagulant activities. Regarding AT glycosidic structure MD simulations in aqueous solution, the results show that its conformation differs in a great extent from that determined by X-ray crystallographic methods. These data evidenciate the existence of distortions in the crystallographic structure, which results from packing effects.

INTRODUÇÃO: Alterações no mecanismo hemostático têm sido associadas ao desenvolvimento de complicações vasculares em indivíduos com diabetes mellitus tipo 2 (DM2). A eficiência dos mecanismos da anticoagulação natural mediados pelas proteínas C (PC) e S (PS), bem como pela antitrombina (AT), depende da integridade da célula endotelial. Sendo assim, a avaliação dos níveis plasmáticos dessas proteínas poderia fornecer importantes informações acerca da anticoagulação natural que se contrapõe ao estado de hipercoagulabilidade no diabetes. OBJETIVO: O presente estudo teve como objetivo a determinação dos níveis de AT, PC e PS e dos co-fatores fator V (FV) e fator VIII (FVIII) em indivíduos com e sem DM2 e hipertensão arterial sistêmica (HAS). MATERIAL E MÉTODOS: Indivíduos hígidos (controles, n = 16), pacientes com DM2 (n = 7), com hipertensão (HAS, n = 12) e com DM2 associado à HAS (DM2 + HAS, n = 18) foram incluídos neste estudo para avaliação da anticoagulação natural. RESULTADOS: Para os níveis de AT o grupo HAS apresentou níveis aumentados em relação ao controle. O grupo DM2 + HAS apresentou níveis aumentados de PC. Para a PS não foi encontrada diferença significativa entre os grupos. O aumento do FV ocorreu apenas no grupo DM2 + HAS; já para o FVIII não foi encontrada diferença significativa entre os grupos. CONCLUSÕES: O aumento da AT é ainda pouco conhecido no meio científico; outros estudos já observaram aumento de PC em pacientes com DM2 e normoalbuminúria, entretanto o mecanismo permanece desconhecido. O aumento de FV observado no grupo DM2 + HAS e não no grupo DM2 pode acontecer em decorrência da HAS. Como o FVIII é uma proteína de fase aguda, a ausência de diferença significativa entre os grupos indica que os indivíduos avaliados não apresentavam processos inflamatórios importantes. BACKGROUND: Hemostatic abnormalities have been associated with vascular complications in patients with type 2 diabetes (DM2). Efficiency of the natural anticoagulation mechanism mediated by proteins C (PC), S (PS) and antithrombin (AT) depends on intact endothelial cells, so the evaluation of these proteins may contribute to a better understanding of the natural anticoagulation status, considering that they inhibit the state of hypercoagulability. OBJECTIVES: The aim of this study was to measure AT, PC and PS levels and the cofactors, factors V (FV) and VIII (FVIII), in subjects with and without DM2 and hypertension (HAS). MATERIAL AND METHOD: 16 healthy subjects (controls), seven patients with DM2, 12 with hypertension (HAS) and 18 with DM2 associated to HAS (DM2 + HAS) were included in this study for natural anticoagulation evaluation. RESULTS: HAS group showed increased levels of AT compared with controls. DM2 + HAS group showed increased levels of PC. For PS and FVIII, no difference was observed among groups. Nevertheless, the increase of FV was observed in DM2 + HAS group, while DM2 group did not show increase. CONCLUSION: AT increase is not yet well known for all conditions. Previous studies have already described PC increase in normoalbuminuric patients with DM2, however its cause is also unknown. FV increase observed in DM2 + HAS group suggests that HAS should contribute to this increase. As FVIII is an acute phase protein the data for FVIII may indicate that assessed subjects had no important inflammatory condition.

INTRODUCAO: Alteracoes no mecanismo hemostatico tem sido associadas ao desenvolvimento de complicacoes vasculares em individuos com diabetes mellitus tipo 2 (DM2). A eficiencia dos mecanismos da anticoagulacao natural mediados pelas proteinas C (PC) e S (PS), bem como pela antitrombina (AT), depende da integridade da celula endotelial. Sendo assim, a avaliacao dos niveis plasmaticos dessas proteinas poderia fornecer importantes informacoes acerca da anticoagulacao natural que se contrapoe ao estado de hipercoagulabilidade no diabetes. OBJETIVO: O presente estudo teve como objetivo a determinacao dos niveis de AT, PC e PS e dos co-fatores fator V (FV) e fator VIII (FVIII) em individuos com e sem DM2 e hipertensao arterial sistemica (HAS). MATERIAL E METODOS: Individuos higidos (controles, n = 16), pacientes com DM2 (n = 7), com hipertensao (HAS, n = 12) e com DM2 associado a HAS (DM2 + HAS, n = 18) foram incluidos neste estudo para avaliacao da anticoagulacao natural. RESULTADOS: Para os niveis de AT o grupo HAS apresentou niveis aumentados em relacao ao controle. O grupo DM2 + HAS apresentou niveis aumentados de PC. Para a PS nao foi encontrada diferenca significativa entre os grupos. O aumento do FV ocorreu apenas no grupo DM2 + HAS; ja para o FVIII nao foi encontrada diferenca significativa entre os grupos. CONCLUSOES: O aumento da AT e ainda pouco conhecido no meio cientifico; outros estudos ja observaram aumento de PC em pacientes com DM2 e normoalbuminuria, entretanto o mecanismo permanece desconhecido. O aumento de FV observado no grupo DM2 + HAS e nao no grupo DM2 pode acontecer em decorrencia da HAS. Como o FVIII e uma proteina de fase aguda, a ausencia de diferenca significativa entre os grupos indica que os individuos avaliados nao apresentavam processos inflamatorios importantes.

A heparina foi isolada no início do século XX e permanece, até os dias atuais, como um dos mais importantes e eficientes agentes terapêuticos de ação antitrombótica. Sua atividade anticoagulante deve-se à ativação da antitrombina (AT), uma serpina responsável pela inibição fisiológica de serino-proteinases plasmáticas, tais como fIIa e fXa. Os esforços no sentido da elucidação dos aspectos estruturais e dinâmicos associados ao reconhecimento molecular da heparina pela AT, em nível atômico, vêm encontrando diversas dificuldades, principalmente associadas aos compostos sacarídicos. Em decorrência de sua elevada polaridade e flexibilidade, glicosaminoglicanos como a heparina são difíceis de estudar e modelar. Soma-se a isto o fato de que os resíduos de iduronato presentes na heparina (IdoA) apresentam um incomum equilíbrio conformacional entre estados de cadeira (1C4) e bote-torcido (2SO), sendo esta última estrutura postulada como a possível conformação bioativa. Sendo assim, este trabalho apresenta um estudo de modelagem molecular do perfil conformacional da heparina, tanto em solução quanto complexada à AT, utilizando cálculos ab initio e simulações de dinâmica molecular (DM) Em decorrência da ausência de parâmetros capazes de descrever polissacarídeos nos campos de força atualmente disponíveis, cargas atômicas foram geradas, utilizando-se os esquemas de Mulliken, Löwdin e cargas ajustadas ao Potencial Eletrostático, através de cálculos quantum-mecânicos na base 6-31G** e testadas na simulação de DM da heparina. Diversas condições de simulação, tais como modelos de água, concentrações de sais e as conformações 1C4 e 2SO do IdoA, foram avaliadas de forma a identificar as melhores condições para a descrição conformacional da heparina em solução. O protocolo de DM obtido foi então utilizado no estudo do complexo AT-heparina. Os resultados obtidos estão de acordo com os dados experimentais atualmente disponíveis acerca da conformação da heparina e da contribuição energética de cada resíduo de aminoácido da AT para a formação do complexo com a heparina. A partir dos cálculos ab initio realizados, foi proposto um refinamento na estrutura da heparina determinada por RMN, enquanto que as simulações de DM permitiram reinterpretar aspectos da estrutura tridimensional da AT determinada por cristalografia de raios-X. Adicionalmente, os dados obtidos sugerem que não há requerimento conformacional para a interação do IdoA com a AT Globalmente, os dados indicam que simulações de DM podem ser utilizadas para representar adequadamente a conformação da heparina, assim como para caracterizar e quantificar suas interações com a AT. Assim sendo, propomos o uso de simulações de DM do complexo entre a AT e a heparina, ou entre a AT e compostos derivados da heparina, como uma ferramenta útil no processo de desenvolvimento de novos agentes antitrombóticos e anticoagulantes.

OBJETIVO: determinar a freqüência de deficiência da proteína C (PC), proteína S (PS) e antitrombina (AT) e das mutações fator V Leiden (FVL), G20210A, no gene da protrombina (PTR), e C677T da metileno-tetraidrofolato redutase (MTFR) em crianças e adolescentes com trombose da veia porta (TVP), e definir o padrão hereditário de uma eventual deficiência. MÉTODOS: durante o período de dois anos, foi investigada a presença de distúrbios trombofílicos em 14 crianças e adolescentes (grupo 1) com TVP, seus pais (grupo 2, n = 25) e dois grupos controles constituídos, o primeiro, por crianças e adolescentes sem hepatopatia, pareados por idade com as crianças do grupo 1 (n = 28), e o outro, por pacientes com cirrose (n = 24). Os pacientes com TVP foram investigados do ponto de vista clínico, laboratorial, endoscópico e com biópsia de fígado. O diagnóstico da trombose foi realizado por ultra-sonografia abdominal com Doppler e/ou estudo angiográfico. RESULTADOS: a freqüência da deficiência de PC, PS e AT nos pacientes com TVP foi de 6/14 (42,9%) (p < 0,05 versus controles sem hepatopatia), 3/14 (21,4%) (p > 0,05) e 1/14 (7,1%) (p > 0,05), respectivamente. Nos pacientes com cirrose, a freqüência da deficiência de PC, PS e AT foi de 14/24 (58,3%), 7/24 (29,2%) e 11/24 (45,8%), respectivamente (p < 0,05 versus controles sem hepatopatia). A deficiência dessas proteínas não foi identificada nos pais dos pacientes com TVP e em nenhum controle sem hepatopatia. A mutação G20210A da PTR foi identificada em um paciente com TVP e em um controle sem hepatopatia (p = 0,999). A mutação C677T da MTFR foi observada na forma homozigótica, em 3/14 (21,4%) dos pacientes com TVP, e em 5/28 (17,9%) controles (p = 0,356). Em nenhum paciente ou controle sem hepatopatia, foi identificado o FVL. CONCLUSÕES: metade das crianças e adolescentes com TVP apresentou deficiência de uma ou mais proteínas inibidoras da coagulação, principalmente da proteína C, mas esta deficiência não parece ser de origem genética. Os distúrbios trombofílicos hereditários não representaram papel importante como causa da TVP nas crianças e adolescentes. Nos pacientes cirróticos, houve maior freqüência de deficiência das proteínas na presença de doença de maior intensidade. OBJECTIVE: to determine the frequency of protein C, protein S and antithrombin deficiency, and factor V Leiden, prothrombin G20210A, and methylenetetrahydrofolate reductase C677T mutations in children and adolescents with portal vein thrombosis, as well as assessing the hereditary character of this disorders. METHODS: a two-year study was carried out to determine the frequency of thrombophilic disorders in children and adolescents with portal vein thrombosis (n = 14), their parents (n = 24), and two control groups, one age-matched children and adolescents free of liver disease (n = 28) and another group with cirrhosis (n = 24). The portal vein thrombosis patients were investigated by clinical and laboratory means, esophagogastroduodenal endoscopy and liver biopsies. The presence of portal vein thrombosis was assessed by Doppler ultrasonography and/or angiographic analysis. RESULTS: the frequency of protein C, protein S and antithrombin deficiency was 6/14 (42.9%) (p < 0.05 versus. controls), 3/14 (21.4%) (p > 0.05) and 1/14 (7.1%) (p > 0.05) of children and adolescents with portal vein thrombosis, respectively. The frequency of protein C, protein S and antithrombin deficiency in cirrhotic patients was 14/24 (58.3%), 7/24 (29.2%) and 11/24 (45.8%), respectively (p < 0.05 versus controls free of liver disease). None of the portal vein thrombosis parents or controls presented protein C, protein S or antithrombin deficiency. One portal vein thrombosis patient and one control (p = 0.999) presented prothrombin G20210A mutation. The homozygous form of methylenetetrahydrofolate reductase C677T mutation was observed in 3/14 (21.4%) patients with portal vein thrombosis and in 5/28 (17.9%) (p = 0.356) controls. None of the patients or controls presented the factor V Leiden. CONCLUSIONS: half of the children and adolescents with portal vein thrombosis presented deficiency of one or more coagulation inhibitor proteins, mainly protein C, but this deficiency does not seem to be an inherited condition. The hereditary prothrombotic disorders do not seem to play a vital role in thrombosis in patients with portal vein thrombosis of this study. In the cirrhotic patients, there was a higher frequency of protein deficiency when the disease was more intense.