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Dissertação de Mestrado em Farmacologia Aplicada apresentada à Faculdade de Farmácia Aging represents a decline in physical and mental capacities, and consequently social, which culminates in the deterioration of the organism. Precisely because of its importance, it is necessary to understand its functioning and nature, and how it can affect organs such as the specific case of the skin.It is particularly important to find strategies that prevent, or at least delay skin aging, and that aim to reduce the risk of cancer and other diseases associated with aging, maintaining the physiological barrier and protection functions of the skin. Therefore, it is important to identify drugs capable of preventing or delaying skin aging, making it necessary to use in vitro models of senescence in skin cells, namely keratinocytes. Thus, the identification of experimental conditions that allow the induction of senescence in a spontaneously immortalized human keratinocyte cell line, which are applicable to the screening of hydrophilic and lipophilic compounds to identify potential anti-aging activity, was our focus of interest.The objectives of this work focused on evaluating the influence of some experimental conditions, namely the concentration of the inducing agent, cell density and the percentage of fetal bovine serum (FBS) in the cell culture medium in the induction of senescence in the spontaneously immortalized human keratinocyte line, HaCaT.For this, oxidative stress, caused by treatment of cell cultures with an oxidizing agent, H2O2, was used to induce cell senescence. As senescence markers, cell proliferation, β-Galactosidase activity, p53 and Lamin B1 expression, and the area and circularity of nuclei were evaluated, as well as the possible presence of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). In the initial phase of this study, the effect of different concentrations of H2O2 on cell metabolic activity as a function of cell density was evaluated after 48 hours, 72 hours or after 7 days. The results of these assays led us to select two cell densities, 0.5 and 0.25 x 105 cells/mL, cultured in the presence of 0.5 or 1% FBS, to proceed with the evaluation of the effect on cell senescence induction.Another variable tested was the effect of multiple additions of H2O2 throughout the culture period, that is, the reinforcement of the effect of H2O2 by repeated addition of a small concentration of this oxidant in the days following the first addition. Additionally, given that the optimization of an experimental model of keratinocyte senescence aims to enable the identification of drugs capable of preventing or at least delaying this process, the influence of treatment of cells with H2O2 in the presence of 0.1% DMSO, the vehicle most frequently used to dissolve lipophilic drugs.The results obtained did not allow the identification of culture and treatment conditions for HaCaT cells in which cell senescence induction was observed, since most of the evaluated markers did not show significant changes in the conditions tested. The most consistently observed marker of senescence was the decrease in cell proliferation in cells initially treated with 150 µM or 250 µM H2O2. Essentially the same results were verified irrespective of cell density, FBS concentration in the culture medium and the concentration of H2O2 added as a booster to the initial one.There was a increase in p53 protein in cells treated with 100 µM and 20 µM H2O2 boosters, not having the effect of other concentrations, although a trend of increase was observed with lower concentrations, up to 100 µM. An increase in Lamin B1 levels was also observed in cells initially treated with 50 µM H2O2 and 20 µM boosters.In none of the conditions tested, any alteration in nuclear morphology was observed, including the area and circularity of the nuclei, and the presence of SAHF was also not observed. Furthermore, under the conditions tested, the morphology, number and intensity of staining of cells with labelling due to SA-β-Gal activity were identical to those of untreated cells, the same happening in cells treated with vehicle (0.1% DMSO), in the absence and presence of the various concentrations and boosts of H2O2 and independently of cell density and FBS concentration in the culture medium.In short, the induction of cell senescence in vitro or mimicking in vitro aging is of great importance, due to the small number of models established to date and hence the need to establish experimental conditions that allow inducing the different characteristics of aging. The studies carried out did not allow us to identify the best conditions to use in a cell senescence model, but they brought us a little closer. O envelhecimento representa um declínio das capacidades físicas e mentais, e por consequência, sociais, que culmina na deterioração do organismo. Precisamente pela sua importância, torna-se necessário perceber o seu funcionamento e a sua natureza, e a forma como pode afetar órgãos como é o caso específico da pele. Torna-se particularmente importante encontrar estratégias que impeçam, ou pelo menos retardem o envelhecimento cutâneo, e que visem reduzir o risco de cancro e outras doenças associadas ao envelhecimento, mantendo as funções fisiológicas de barreira e proteção da pele. Por isso, é importante identificar fármacos capazes de impedir ou retardar o envelhecimento cutâneo, sendo necessário utilizar modelos in vitro de senescência em células cutâneas, nomeadamente queratinócitos. Assim, a identificação de condições experimentais que permitam induzir senescência numa linha celular de queratinócitos humanos espontaneamente imortalizados, que sejam aplicáveis ao screening de compostos hidrofílicos e lipofílicos para identificação de potencial atividade anti-envelhecimento cutâneo foi o nosso foco de interesse.Os objetivos deste trabalho centraram-se na avaliação da influência de algumas condições experimentais, nomeadamente da concentração do agente indutor, densidade celular e da percentagem de soro fetal bovino (FBS) no meio de cultura celular na indução de senescência na linha de queratinócitos humanos espontaneamente imortalizados, HaCaT.Para isso, foi usado o stress oxidativo, causado por tratamento das culturas celulares com um agente oxidante, o H2O2, para induzir a senescência celular. Como marcadores de senescência, avaliou-se a proliferação celular, a atividade da β-Galactosidase, a expressão de p53 e de Lamina B1, e a área e circularidade dos núcleos, bem como a eventual presença de focos de heterocromatina associados à senescência (SAHF).Na fase inicial deste estudo, foi realizada a avaliação do efeito de diferentes concentrações de H2O2, na atividade metabólica celular em função da densidade celular, ao fim de 48 horas, 72 horas ou ao fim de 7 dias. Os resultados desses ensaios levaram-nos a selecionar duas densidades celulares, 0,5 e 0,25 x 105 células/mL, cultivadas na presença de 0,5 ou 1% FBS para prosseguir com a avaliação do efeito na indução de senescência celular. Outra variável testada, foi o efeito de adições múltiplas de H2O2 ao longo do período de cultura, isto é, o reforço do efeito do H2O2 por adição repetida de uma pequena concentração deste oxidante nos dias seguintes à primeira adição. Adicionalmente e dado que a otimização de um modelo experimental de senescência de queratinócitos tem o objetivo de possibilitar a identificação de fármacos capazes de impedir ou, pelo menos, retardar esse processo, testou-se a influência do tratamento das células com H2O2 na presença de 0,1% DMSO, o veículo mais frequentemente usado para dissolver fármacos lipofílicos.Os resultados obtidos não permitiram identificar condições de cultura e tratamento das células HaCaT em que se observasse indução de senescência celular, uma vez que a maioria dos marcadores avaliados não apresentaram alterações significativas nas condições testadas. O marcador de senescência que se observou de forma mais consistente, foi a diminuição da proliferação celular em células tratadas inicialmente com 150 µM ou 250 µM H2O2. Verificaram-se essencialmente os mesmos resultados independentemente da densidade celular, da concentração de FBS no meio de cultura e da concentração de H2O2 adicionada como reforço da inicial. Verificou-se um aumento da proteína p53 em células tratadas com 100 µM e reforços de 20 µM H2O2, não tendo o efeito de outras concentrações, embora se observe uma tendência de aumento com as concentrações menores, até 100 µM. Observou-se ainda um aumento dos níveis de Lamina B1 nas células tratadas inicialmente com 50 µM H2O2 e reforços de 20 µM. Em nenhuma das condições testadas se observou qualquer alteração da morfologia nuclear, incluindo a área e circularidade dos núcleos, e também não se observou a presença de SAHF. Além disso, nas condições testadas, a morfologia, número e intensidade da coloração das células com marcação decorrente da atividade da SA-β-Gal foram idênticos aos das células não tratadas, o mesmo acontecendo nas células tratadas com veículo (0,1% DMSO), na ausência e na presença das várias concentrações e reforços de H2O2 e independentemente da densidade celular e da concentração de FBS no meio de cultura.Em suma, a indução de senescência celular in vitro ou mimetizar o envelhecimento in vitro é de elevada importância, pela diminuta quantidade de modelos estabelecidos até à data e daí a necessidade de estabelecer as condições experimentais que permitem induzir as diferentes características do envelhecimento. Os estudos realizados não permitiram identificar as melhores condições a usar num modelo de senescência celular, mas aproximaram-nos um pouco mais.

Relatório de Estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de Farmácia Realizado no âmbito da Unidade Curricular “Estágio Curricular” do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra, o presente trabalho contem: o Relatório de Estágio em Indústria Farmacêutica, realizado junto da equipa responsável pelo Cosmedesk, no período de 3 de maio de 2021 a 30 de julho de 2021; o Relatório de Estágio em Farmácia Comunitária, realizado na Farmácia S. José, Coimbra, no período de 3 de janeiro a 30 de abril de 2021; e a monografia intitulada “Senolytics and Senomorphics for the Treatment of Osteoarthritis”.A Osteoartrite (OA) é uma doença degenerativa das articulações que resulta em perda de qualidade de vida e incapacidade. A senescência celular, um dos fenómenos associados ao envelhecimento, tem sido associada ao desenvolvimento e progressão da OA. Novas terapias focadas na senescência celular tem sido alvo de pesquisa. Senolíticos são fármacos que levam à eliminação das células senescentes. Senomórficos são fármacos que interferem nas vias e fatores do fenótipo associado à senescência. Resultados demonstraram que os senolíticos e senomórficos são capazes de abrandar a patogénese da OA e reduzir a sintomatologia associada. No entanto, mais investigação é necessária para avaliar eficiência, segurança e efeitos adversos destes compostos. Perante os resultados positivos e a ausência de terapias que abrandem o desenvolvimento da doença, senolíticos e senomórficos surgem como uma abordagem terapêutica muito promissora para a OA. Carried out within the scope of the Curricular Unit “Curricular Internship” of the Integrated Master's Degree in Pharmaceutical Sciences at the Faculty of Pharmacy of the University of Coimbra, this work contains: the internship report in Pharmaceutical Industry, carried out with the team responsible for Cosmedesk from May 3rd, 2021 to July 30th, 2021; the internship report in Community Pharmacy, carried out at Farmácia S. José, in Coimbra, from January 3rd, 2021 to April 30th, 2021; and the monograph entitled “Senolytics and Senomorphics for the Treatment of Osteoarthritis”. Osteoarthritis (OA) is a common joint degenerating disease that results in loss of quality of life and decline of functional capacities for those affected by it. Cellular senescence, a hallmark of aging, has been linked to OA development and progression. New therapy approaches targeting cellular senescence have been the subject of valuable research. Senolytics lead to the elimination of senescent cells. Senomorphics affect pathways and molecules linked to senescence associated secretory phenotype (SASP). Evidence has shown that senolytic and senomorphic agents are capable of reducing OA pathogenesis and associated symptomatology. However, more research is needed to assess the efficiency, safety, and adverse effects of these drugs. Given the positive results and current lack of disease modifying therapies, senolytics and senomorphics represent a very promising therapeutic approach for the treatment of OA.

Relatório de Estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de Farmácia Os presentes Relatórios de Estágio decorridos na Farmácia São José e no Centro Hospitalar Universitário de Coimbra no âmbito da unidade curricular "Estágio" do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade de Coimbra, têm como objetivo descrever as atividades e conhecimentos adquiridos, fazendo uma análise crítica do meu percurso enquanto estagiária, na forma de uma Análise S.W.O.T. (Strenghts, Weaknesses, Opportunities and Threats). Ao longo do período de estágio, compreendido entre janeiro a junho de 2017, foi possível realizar diversas tarefas que contribuíram para complementar a minha formação enquanto futura Farmacêutica. A senescência celular consiste num estado estável de paragem na proliferação celular, em células sujeitas a diferentes tipos de estresse. A senescência foi inicialmente descrita como um mecanismo celular autónomo supressor de tumores que induz uma paragem irreversível do ciclo celular, prevenindo a proliferação de células danificadas em risco de transformação neoplásica. Contudo, estudos recentes demonstraram que a senescência celular desempenha também um complexo papel biológico no desenvolvimento embrionário, na reparação tecidular, na cicatrização de feridas, no envelhecimento e nas doenças relacionadas com o envelhecimento, surgindo assim como um interessante alvo terapêutico. Esta monografia pretende descrever os mecanismos moleculares subjacentes às etapas da senescência celular, entender que tipos de estímulos induzem a senescência, o modo como estas células senescentes influenciam o microambiente onde estão inseridas, a sua relação com o envelhecimento e as doenças relacionadas com o envelhecimento. Além disso, é abordada a senescência celular e os mecanismos associados como possível alvo terapêutico. The present internship reports, held at the São José Pharmacy and at the Centro Hospitalar Universitário de Coimbra, within the ambit of the "Internship" curricular unit of the Integrated Master's degree in Pharmaceutical Sciences of the Faculty of Pharmacy of the University of Coimbra, aims to describe the activities and acquired knowledge, making a critical analysis of my course as trainee in the form of a SWOT analysis (Strenghts, Weaknesses, Opportunities and Threats). Throughout the internship period between january and june of 2017, it was possible to perform several tasks that contributed to complement my training as a future Pharmacist.Senescence was initially described as an autonomous cellular tumor suppressor mechanism that induces irreversible cell cycle arrest, preventing the proliferation of damaged cells at risk of neoplasic transformation. However, recent studies have shown that cellular senescence also plays a complex biological role in embryonic development, tissue repair, wound healing, aging and age-related diseases, thus appearing as an interesting therapeutic target. This monograph aims to describe the molecular mechanisms underlying the steps of cellular senescence, to understand what types of stimuli induce senescence, how these senescent cells influence the microenvironment in which they are inserted, their relation with aging and age-related disease. In addition, it addresses cellular senescence and associated mechanisms as a possible therapeutic target.

Evidências demonstram uma associação entre o aumento dos níveis de estresse crônico e o desenvolvimento de diferentes patologias, promovendo um desgaste do organismo que acelera a taxa de declínio das funções fisiológicas levando a senescência celular. A possibilidade de identificar potenciais biomarcadores em estágios iniciais de exposição a condições adversas e acompanhá-los ao longo da progressão clínica, podem torná-los ferramentas extremamente úteis no esclarecimento de diversas desordens. As sequências finais dos cromossomos, denominadas telômeros, representam um novo biomarcador de senescência celular. São responsivos a mudanças ambientais e parecem ter um papel essencial no ajuste das respostas fisiológicas e socioambientais. O encurtamento dos telômeros ao longo do ciclo vital está associado a diferentes variáveis de estilo de vida, estresse oxidativo ou psicológico e doenças crônicas, sugerindo que o comprimento dos telômeros pode ser reconhecido como um bom indicador do estado geral de saúde e da idade biológica dos indivíduos. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi padronizar e estabelecer uma técnica para a determinação do comprimento relativo de telômeros por qPCR (através da razão T/S), a partir de três tecidos diferentes, e validar a técnica em três desordens diferentes em relação a suas respectivas populações controle. A análise dos resultados demonstrou que foi possível padronizar a detecção do comprimento relativo de telômeros em leucócitos e em células mononucleares de sangue periférico (PBMC), baseado na técnica de qPCR. Utilizamos amostras de três coortes diferentes para validar nossa padronização de qPCR. Na primeira coorte não observamos diferenças no comprimento de telômeros em leucócitos de crianças ex-prematuras e seus controles (teste Mann-Whitney, P = 0,5219). Todavia, crianças portadoras de asma severa apresentaram telômeros de leucócitos significativamente mais curtos que as crianças portadoras de asma leve ou do grupo controle (teste Kruskal-Wallis, P = 0,0426). Ainda, detectamos um encurtamento significativo de telômeros entre o grupo asma severa, quando comparadas ao grupo controle e ao grupo asma leve (pós-teste de Dunn, P < 0,05). Além disso, observamos uma diminuição do comprimento de telômeros em PBMC de adultos portadores de obesidade severa e o seu grupo controle (teste Mann-Whitney, P = 0,0006). Esse efeito foi significativo e se manteve presente após ajuste para idade (teste Mann-Whitney, P = 0,026). Também observamos uma correlação inversa significativa entre a o comprimento de telômeros e a idade de indivíduos portadores de obesidade (r = -0,4108, P = 0,0116) e o IMC de ambos os grupos (r = -0,4174, P = 0,0005). De acordo com a análise dos resultados desse estudo, em consonância com dados obtidos na literatura, é possível inferir que telômeros podem se tornar uma importante ferramenta para auxiliar em estudos sobre as bases moleculares do desenvolvimento de diversas patologias, com a finalidade de elucidar os mecanismos que possam acelerar o processo de envelhecimento. Evidences demonstrate an association between increased levels of chronic stress and development of various pathologies, promoting damage to the organism which accelerates the decline of physiological functions leading to cellular senescence. The ability to identify biomarkers in early stages of exposure to adverse conditions and accompany them along clinical progression can make them extremely useful tools to elucidate several disorders. Telomeres, the ends of linear chromosomes, represent a new biomarker of cellular senescence. They are responsive to environmental changes and appear to play an essential role in the setting of physiological and social responses. The telomere shortening over the life cycle is associated with different lifestyle variables, oxidative or psychological stress and chronic diseases, suggesting that telomere length can be recognized as a good indicator of general health and biological age of individuals. Thus, the aim of this study was to establish a technique to detect relative telomere length by qPCR (T/S ratio) from three different tissues and validate the technique in three different disorders in relation to their respective controls. The results demonstrated that it was possible to standardize the detection of the relative telomere length in leukocytes and in PBMC using a qPCR-based method. We used samples from three different cohorts to validate our qPCR. We didn't observed a difference in telomere length in leukocyte from ex-preterm children and control (Mann-Whitney test, P = 0.5219). The severe asthma group had significantly shorter telomeres when compared to the control and mild asthma group (Kruskal-Wallis test, P = 0,0426) and . There was a significant difference when severe asthma were compared to diferença significativa entre o grupo asma severa, quando comparada ao asma leve (teste pos-hoc de Dunn, P < 0,05). We also observed a significant difference in telomere length in PBMC in adults with obesity when compared to controls (Mann-Whitney test, P = 0.0006). This effect was still present, and remained so after adjustment for age (Mann-Whitney test, P = 0.026). We also observed a significant inverse correlation between the telomere length and adults with obesity (r = -0.4108, P = 0.0116), and BMI in both groups (r = -0.4174, P = 0.0005). According to the analysis of this study and in line with data from the literature, we can infer that telomeres might become important tools to support studies on the molecular basis of the development of various diseases, in order to elucidate mechanisms that might accelerate the aging process.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior After the progressive telomere shortening in successive cell divisions, normal somatic cells undergo a growth arrest called cellular senescence that occurs due to incomplete DNA replication. Senescence can also be activated by various types of stressful stimuli, including aberrant oncogenic signaling, oxidative stress and DNA damage. Senescent cells have limited proliferative capacity and seems to play an important role in tumorigenesis. They are also involved in the inflammation associated with aging and cancer progression. The process of senescence vary significantly between cells, but the different paths for the aging, however, converge to p53 and pRB. The network simulation is based on the model proposed by Porath using a Boolean model to represent the state of activation of genes involved, including the p16-pRb and p53-p21 pathways. The simulation includes 23 nodes representing the genes of the regulatory network where one of them represents the activation of the senescent state as a result of network processing. Experiments with human fibroblasts indicate that inactivation of both genes, p53 and pRB is necessary to block senescence. The simulations confirms that these pathways are able to trigger senescence independently. The simulation shows that pRb is essential to maintain the senescent state even when p16 and p53 are switched off, but the simultaneous inactivation of both p53 and pRB blocks senescence. In addition, the simulation shows that inactivation of the p16-pRb pathway is not essential to preserve the senescent state, however when p53-p21 pathway is inactivated, the senescent state is preserved. Após o progressivo encurtamento dos telômeros em sucessivas divisões celulares, as células somáticas normais se submetidas a uma parada do crescimento chamado senescência celular que ocorre devido à replicação incompleta do DNA. A senescência também pode ser ativada por diversos tipos de estímulos estressantes, incluindo sinalização oncogênica aberrante, estresse oxidativo e danos ao DNA. Células senescentes têm capacidade proliferativa limitada e parecem desempenhar um papel importante na tumorigênese. Elas também estão envolvidas na inflamação associada com o envelhecimento e progressão do câncer. As vias de senescência variam significativamente entre as células, mas os caminhos diversos para a senescência, no entanto, convergem para p53 e pRb. A simulação é baseada no modelo proposto por Porath usando um modelo booleano para representar o estado de ativação dos genes envolvidos, incluindo as vias p16-pRb e a p53-p21. A simulação inclui 23 nós representando os genes da rede regulatória onde um deles representa o estado celular senescente que pode assumir estados Verdadeiro ou Falso como resultado do processamento de rede Experiências com fibroblastos humanos indicam que a inativação de ambos os genes, p53 e pRb, é necessária para bloquear a senescência. As simulações confirmam que essas vias são capazes de acionar a senescência independentemente. A simulação mostra que pRb é essencial para a manutenção do estado senescente mesmo se p16 e p53 forem desligados, no entanto a inativação simultânea de ambos p53 e pRb bloqueia senescência. Além disso, a simulação mostra que a inativação da via p16-pRb não é essencial para preservar o estado senescente, no entanto, quando a via p53-p21 é inativada, o estado senescente é preservado.

Aging can be characterized as a time dependent decline of maximal functionality that affects tissues and organs of the whole body. Such is induced by the progressive loss of redundant components and leads to an increased susceptibility to disease and risk of death. Regarding the aging of skeletal muscle, it has been pointed out that mitochondria is a key factor behind the loss of redundancy and functionality, since this organelle has a major role in cellular homeostasis particularly at the level of the bioenergetic status. Decreased activities of the mitochondrial electron transport chain complexes and an increased release of reactive oxygen species from mitochondria are well documented with age; it is suggested that the mitochondrial loss of function results from the increased oxidative damage to proteins, lipids, and DNA of this organelle. However, it is important to be aware that the mitochondrial loss of function could also be a consequence, rather than a cause, of the cellular deterioration with age, which compromises mitochondrial biogenesis, mitochondrial protein turnover and autophagocytosis of damaged mitochondria. In this review several topics will be addressed regarding the age-related loss of skeletal muscle redundancy associated with mitochondrial dysfunction, emphasizing hypotheses for underlying mechanisms. In addition, we discuss some of the cellular mechanisms that can be pointed out as being responsible for the age-related mitochondrial dysfunction.