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Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2019. Polihidroxibutirato (PHB) é uma classe de biopolímero sintetizado por diversosmicrorganismos como material de reserva energética. Suas propriedadestermo-mecânicas e capacidade de ser produzido a partir de fontesrenováveis, o torna uma alternativa notável aos plásticos de origem petroquímica.Dessa maneira, o presente trabalho buscou a síntese de PHBpela cepa Cupriavidus necator glpFK utilizando glicerol como fonte de carbono.Foram realizados cultivos em microplaca e agitador orbital como objetivo de avaliar a influência das concentrações iniciais de glicerol enitrogênio na velocidade específica de crescimento na fase exponencial(_Xrmax). A partir dos resultados obtidos determinou-se as condições iniciaispara os cultivos em biorreator agitado e aerado. Diferentes condições deoperação como temperatura do meio e modo de alimentação de substrato,foram avaliadas baseado nos parâmetros cinéticos _Xrmax e produtividadeem PHB. O cultivo de maior produtividade, 0,75 gp L-1 h-1, foi conduzidoà temperatura de 35 _C e alimentado ao longo da fase de produçãocom as fontes de nitrogênio e carbono. Neste ensaio, a concentração debiomassa total atingida foi de 54,7 g L-1 sendo 65 % PHB acumulado.Posteriormente, um modelo matemático que descreve a evolução das concentraçõesde biomassa residual, PHB e oxigênio dissolvido foi proposto.No equacionamento foi levado em consideração a influência da concentraçãofontes de nitrogênio e carbono sobre o crescimento celular e produçãode biopolímero. Esta foi a primeira vez que a concentração de oxigêniodissolvido foi prevista na produção de PHB. Além do consumo de oxigênio,sua transferência da fase líquida à gasosa foi matematicamente avaliadaem termos do coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa).Para avaliar o comportamento do modelo em função das variações dasgrandezas de entrada, foi realizada a análise de sensibilidade global pelométodo LHS-PRCC. Nesta análise foram avaliados 5.000 casos dentro deum intervalo de variação definido para cada grandeza. Como resultado,os parâmetros relativos ao consumo de oxigênio e fonte de carbono paramanutenção das atividades celulares foram desconsiderados do modelo devida à baixa influência causada. O modelo foi, então, treinado por meioda otimização multiobjetivo por busca padronizada a partir dos dados experimentaisde apenas um dos cultivos realizados. Assim, avaliou-se seuajuste aos dados experimentais dos demais ensaios à mesma temperatura,verificando-se uma notável qualidade. Uma nova otimização foi realizada,em que o objetivo foi maximizar a produtividade em PHB por meio daalteração das condições operacionais. Por meio deste experimento computacional,foi apresentada a possibilidade de atingir uma concentraçãofinal de biomassa de 108,7 g L-1 em 60 h de cultivo, com produtividadede 1,36 gp L-1 h-1. Desse modo, os desenvolvimentos experimentais ematemáticos realizados neste estudo foram complementares. Abstract : Polyhydroxybutyrate (PHB) is a class of biopolymer synthesized by severalmicroorganisms as energy reserve material. Its thermo-mechanical propertiesand ability to be produced from renewable sources make it a notablealternative to petrochemical plastics.Thus, the present work sought thebiosynthesis of PHB by the bacteria strain Cupriavidus necator glpFK usingglycerol as carbon source. Cultures were performed in microplates andincubator shakers in order to evaluate the influence of the initial concentrationsof glycerol and nitrogen on the specific growth rate in during theexponential phase (_Xrmax). From these, the initial conditions for the agitatedand aerated bioreactor cultures were determined. Different operatingconditions such as, temperature and substrate-feed mode were evaluated,in which the kinetic parameters _Xrmax and productivity in PHB were usedas the evaluation criteria.The cultivation with highest productivity, 0.75gp L-1 h-1 was conducted at 35 _C and fed throughout the productionphase with the sources of nitrogen and carbon. In this assay, the finalbiomass concentration was 54.7 g L-1 being 65% accumulated PHB. Thereafter,a mathematical model describing the evolution of residual biomass,PHB and dissolved oxygen concentrations was proposed. In this system ofequations, the influence of nitrogen and carbon sources on cell growth andbiopolymer production was taken into consideration. This was the firsttime that the concentration of dissolved oxygen was predicted in the productionof PHB. In addition to oxygen consumption, its transfer from liquidto gaseous phase was mathematically evaluated in terms of the volumetricoxygen transfer coefficient (kLa).In order to evaluate the model?s behavioras function of variations in the inputs, the global sensitivity analysis wasperformed by the LHS-PRCC method. In this analysis, 5,000 cases wereevaluated within a defined range for each input. As result, the parametersrelated to oxygen and carbon source consumption to maintain cellular activitieswere taken out of the model due to the low influence caused. Themodel was then trained through multiobjective optimization by Pattern Searchusing experimental data of only one of the cultures performed. Then,it was evaluated its fit to the experimental data of the others cultures atthe same temperature, in which outstanding quality was obtained. A newoptimization was performed, in which the objective was to maximize the productivity in PHB by the selection of optimal operational conditions. Bythis computational experiment, the possibility of reaching a final concentrationof biomass of 108.7 g L-1 in 60 h of cultivation with yield of 1.36gp L-1 h-1, was presented. Thus, the experimental and mathematicaldevelopments performed in this study were complementary.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2018. Uma crescente demanda por produtos de base biológica está impulsionando o mercado mundial para a produção de bioplásticos. O poli-hidroxibutirato (PHB) é um biopolímero biodegradável e biocompatível com propriedades físicas próximas às do polipropileno. Um dos principais obstáculos para sua produção é o elevado custo e isso tem estimulado a procura por substratos de baixo custo, como o glicerol, subproduto do biodiesel. O consumo de glicerol pela bactéria Cupriavidus necator DSM 545 é lento, quando comparado a outros substratos como a glicose e ácidos orgânicos, por exemplo. A inserção de genes para o consumo de glicerol e a utilização de uma fonte de carbono adicional, como a glicose, pode aumentar os percentuais de acúmulo e a produtividade em biopolímero. O objetivo deste trabalho foi comparar a produção de PHB por C. necator DSM 545 (parental) e por C. necator_glpFK (que ancora os genes glpF e glpK de Escherichia coli para o consumo de glicerol), inicialmente a partir de glicerol e depois associando glicerol e glicose. Diferentes estratégias de cultivo foram realizadas: cultivos em agitador orbital e biorreator foram conduzidos para comparar o desempenho das cepas parental e recombinante. Cultivos em biorreator foram conduzidos afim de comparar a influência da concentração dos substratos glicose e glicerol no crescimento e produção de PHB pela cepa recombinante, e cultivo em modo batelada alimentada foi conduzido com finalidade de avaliar a influência do tipo de alimentação de glicerol sobre a produtividade em polímero. O cultivo para a produção de PHB por C. necator_glpFK também foi avaliado quanto a transferência e consumo de oxigênio, nas condições estudadas. O polímero produzido foi extraído e caracterizado. Os resultados mostraram que, em agitador orbital, as cepas foram capazes de produzir PHB com percentual de acúmulo de 44 e 57% para C. necator DSM 545 e para a recombinante, respectivamente. Foram realizados quatro cultivos em biorreator, que mostraram que C. necator_glpFK apresentou melhor desempenho em relação ao crescimento e produção de PHB do que a cepa parental. Os dados cinéticos dos cultivos em agitador orbital e biorreator mostraram que a cepa recombinante consumiu a totalidade dos substratos glicerol e glicose, com uma velocidade maior do que a cepa parental, proporcionando maior produtividade de biopolímero. Nos cultivos em batelada, realizados com a cepa recombinante e com concentrações de 20 g.L-1 de glicose e 10 g.L-1 de glicerol e no cultivo 20 g.L-1 de glicose e 25 g.L-1 de glicerol apresentaram produtividades de 0,41 g.L-1.h-1 e 0,30 g.L-1.h-1, com acúmulo de 73% e 74% de PHB, respectivamente. Os dados de transferência de oxigênio mostraram comportamento análogo, para os cultivos 20 g.L-1 de glicose e 10 de glicerol e 20 g.L-1 de glicose e 25 g.L-1 de glicerol, entre a velocidade de respiração microbiana (QO2X) e o coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa). Foi possível constatar que o uso do glicerol não afetou o polímero quanto às propriedades térmicas, e que o carbonato de propileno reutilizado pode ser empregado no processo de extração. Conclui-se que o cultivo em batelada 20 g.L-1 de glicose e 10 g.L-1 de glicerol, em glicerol combinado à glicose, apresenta melhor desempenho quanto à produtividade, entretanto o cultivo 20 g.L-1 de glicose e 25 g.L-1 de glicerol apresentou melhor percentual de acúmulo final de PHB entre as concentrações testadas. Assim, é possível afirmar que a associação dos substratos glicose e glicerol pode ser utilizada na produção de PHB com maior produtividade do que se usando apenas glicerol. O uso dos substratos em conjunto pode ser uma boa alternativa para diminuição de custos de produção de PHB, com uma boa produtividade. Abstract : An increasing demand for bio-based products is boosting the global market for bioplastics production. Polyhydroxybutyrate (PHB) is a biodegradable and biocompatible biopolymer with physical properties close to those of polypropylene. One of the main obstacles to its production is the high cost and this has stimulated the search for substrates of low cost, like the glycerol, byproduct of the biodiesel. The consumption of glycerol by Cupriavidus necator DSM 545 is slow when compared to other substrates such as glucose and organic acids, for example. Insertion of genes for glycerol consumption and use of an additional carbon source, such as glucose, may increase percentages of accumulation and productivity in biopolymer. The objective of this work was to compare PHB production by C. necator DSM 545 (parental) and C. necator_glpFK (which anchors the glpF and glpK genes of Escherichia coli for the consumption of glycerol), initially from glycerol and then associating glycerol and glucose. Different cultivation strategies were performed: cultures in orbital shaker and bioreactor were conducted to compare the performance of the parental and recombinant strains. Bioreactor cultures were conducted in order to compare the influence of glucose and glycerol substrates concentration on growth and PHB production by the recombinant strain, and fed batch culture was conducted with the purpose of evaluating the influence of glycerol feed type on polymer productivity. The culture for the production of PHB by C. necator¬_glpFK was also evaluated as to oxygen transfer and consumption, under the studied conditions. The polymer produced was extracted and characterized. The results showed that, in an orbital shaker, the strains were able to produce PHB with a percentage of accumulation of 44 and 57% (w/w) for C. necator DSM 545 and for the recombinant, respectively. Four cultures were carried out in bioreactor, which showed that C. necator_glpFK presented better performance in relation to the growth and production of PHB than the parental strain. The kinetic data of the orbital and bioreactor cultures showed that the recombinant strain consumed all glycerol and glucose substrates at a faster rate than the parental strain, providing higher productivity of biopolymer. In the batch cultures, performed with the recombinant strain and with concentrations of 20 g.L-1 of glucose and 10 g.L-1 of glycerol and in the culture 20 g.L-1 of glucose and 25 g.L-1 of glycerol presented productivities of 0.41 g.L-1.h-1 and 0.30 g.L-1.h-1, with accumulation of 73% and 74% of PHB, respectively. The oxygen transfer data showed similar behavior for the cultures 20 g.L-1 of glucose and 10 g.L-1 of glycerol and 20 g.L-1 of glucose and 25 g.L-1 of glycerol between the microbial respiration rate (QO2X) and the coefficient volumetric oxygen transfer (KLa). It was possible to verify that the use of glycerol did not affect the polymer on the thermal properties, and that the reused propylene carbonate can be used in the extraction process. It is concluded that the batch cultivation of 20 g.L-1 of glucose and 10 g.L-1 of glycerol in glycerol combined with glucose presented a better yield performance, however, the culture 20 g.L-1 glucose and 25 g.L-1 glycerol showed a better percentage of final PHB accumulation between the concentrations tested. Thus, it is possible to affirm that the association of the substrates glucose and glycerol can be used in the production of PHB with greater productivity than if using only glycerol. The use of the substrates together can be a good alternative for lower production costs of PHB, with a good productivity.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2018. Os poli-hidroxialcanoatos (PHA), com destaque para o poli-hidroxibutirato (PHB), são biopolímeros biodegradáveis produzidos intracelularmente por diversos microrganismos. A bactéria Cupriavidus necator é potencial produtora de PHB, com capacidade de acumular até 90% de sua massa seca em biopolímero. Na tentativa de reduzir os custos do processo de produção de PHB, vários subprodutos agroindustriais podem ser utilizados como substratos desse bioprocesso. Na produção de biocombustíveis, dois subprodutos se destacam: a glicerina e a vinhaça, respectivamente, gerados pelas indústrias de biodiesel e de bioetanol. Esses subprodutos podem ser utilizados como substrato por microrganismos, inclusive por C. necator. O baixo teor de carbono de alguns subprodutos faz com que estratégias de cultivo sejam avaliadas, quando pretende-se produzir PHB. O objetivo deste trabalho foi estudar o crescimento e a produção de PHB por C. necator recombinante, com glicerina e vinhaça como substratos. Duas estratégias de cultivo foram avaliadas: batelada e batelada alimentada, incluindo a combinação de substratos (vinhaça e glicerina). Os resultados demonstraram que o crescimento de C. necator não foi afetado pelas possíveis impurezas presentes nas glicerinas (refinada e bruta) e na vinhaça. Nas glicerinas, C. necator foi capaz de crescer com µmax de 0,10 h-1, enquanto que, em vinhaça com µmax de 0,29 h-1. A produção de PHB por C. necator recombinante em batelada foi observada nas duas glicerinas em estudo. As produções finais de PHB foram de 31% e 50% com glicerina refinada e bruta, respectivamente. Os cultivos em batelada alimentada com glicerina refinada e glicerina bruta obtiveram produtividade de 0,15 gPHB/L.h, com acúmulo de 52% e 43% de PHB, respectivamente. Quando vinhaça foi utilizada como único substrato, a produção de PHB foi menor que 1 gPHB/L, provavelmente devido à baixa quantidade de carbono presente neste substrato. No entanto, a combinação de substratos (vinhaça e glicerina bruta) foi satisfatória, com esta estratégia, µmax de C. necator foi de 0,29 h-1 com acúmulo de PHB de 64% e produtividade de 0,22 gPHB/L.h. Assim, é possível afirmar que C. necator recombinante é capaz de crescer e produzir PHB nos principais subprodutos da indústria de biocombustíveis. O cultivo em batelada alimentada, em vinhaça combinada à glicerina bruta, apresenta melhor desempenho quanto à produtividade e acúmulo de PHB, dentre as condições estudadas. Abstract : Poly-hydroxyalkanoates (PHA), highlighting the poly-hydroxybutyrate (PHB), are biopolymers biodegradable and produced intracellularly by several microorganisms. The bacteria Cupriavidus necator is a potential PHB producer, with the capacity to accumulate up to 90% of its dry mass in biopolymer. Aiming to reduce the costs of the PHB production process, several agroindustry byproducts are being used as carbon source in this bioprocess. The production of biofuels brings forth two main byproducts: glycerin and vinasse, respectively, generated by the biodiesel and bioethanol industries. These byproducts can be used as carbon source by microorganisms, including by C. necator. The low carbon content present in some byproducts motivates the study of different cultivation strategies, when the goal is PHB production. The aim of this work was to study the growth and PHB production by recombinant C. necator, using glycerin and vinasse as substrates. Two cultivation strategies were used to increase productivity of the biopolymer: batch and fed-batch; including the combination of substrates (vinasse and glycerin). The results show that C. necator_glpFK growth wasn't inhibited by the possible impurities present in the glycerin (refined or crude). In glycerin, C. necator was able to growth with µmax 0.10 h-1, while, in vinasse with µmax 0.29 h-1. The production of PHB by recombinant C. necator in batch was observed in the two glycerin evaluated. The final PHB productions were 31% and 50% with refined and crude glycerin, respectively. The fed-batch cultures in refined and crude glycerin presented a volumetric productivity of 0.15 gPHB/L.h, with a PHB production of 52% and 43%, respectively. When vinasse was used, the PHB production was less than 1 gPHB/L, probably due to its low carbon content. However, the combination of substrates (vinasse and crude glycerin) was satisfactory. Under its condition, µmax of C. necator was 0.29 h-1 with PHB production of 64% and productivity of 0.22 gPHB/L.h. Thus, it is possible to say that recombinant C. necator is capable to growth and produce PHB using biofuels byproducts. The cultivation performed on fed-batch, using vinasse plus crude glycerin, presented the best productivity and accumulation of PHB, among the studied conditions.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2016. Os poli(hidroxialcanoatos) (PHAs) são compostos biodegradáveis, produzidos por microrganismos como reserva de energia, que despertam interesse industrial por serem termoplásticos biodegradáveis. O desenvolvimento de processos de produção desses biopolímeros de forma eficiente, tem sido foco de diversas linhas de pesquisa. Ralstonia eutropha é um dos microrganismos mais estudados para a produção de Poli(3-hidroxibutirato) (P(3HB)), que é o PHA mais comumente estudado. A utilização de substratos de baixo custo, como os resíduos, pode ser uma alternativa na redução dos custos de produção desses materiais. A vinhaça é o principal subproduto da indústria sucroenergética, sendo produzida em grandes volumes. A valorização da vinhaça, pelo desenvolvimento de um processo para obtenção de um produto com valor agregado, como o P(3HB), contribui com valor adicional à produção de etanol. O glicerol é uma das principais fontes de carbono presentes na vinhaça. O objetivo deste trabalho foi utilizar a vinhaça como substrato para o crescimento e a produção de P(3HB) pela bactéria R. eutropha DSM 545. Diferentes diluições de vinhaça foram estudadas e em nenhuma delas a bactéria sofreu inibição em seu crescimento, mesmo quando a vinhaça (sem diluição) foi apenas adicionada de sais. Visto que a bactéria alcançou a fase estacionária de crescimento quando havia substratos disponíveis no meio, como o glicerol, foi proposto realizar o melhoramento de R. eutropha DSM 545 para o consumo mais eficiente dessa fonte de carbono. Assim, dois dos genes responsáveis pelo consumo do glicerol em Escherichia coli: glpF e glpK, que codificam uma aquaporina e a glicerol quinase (atua na fosforilação do glicerol a glicerol 3-fosfato), respectivamente, foram expressos em R. eutropha DSM 545 (parental) e assim foi construída a cepa R. eutropha_glpFK (recombinante). Ao se analisar comparativamente o crescimento de R. eutropha_glpFK com R. eutropha DSM 545, em meio contendo glicose, os resultados mostraram que a expressão dos genes glpFK não interferiu no desempenho desse microrganismo. Cultivos em modo batelada em biorreator foram conduzidos para comparar o desempenho das cepas parental e recombinante, em glicerol, em vinhaça em meio contendo vinhaça adicionada de glicerol. Em vinhaça, a recombinante foi capaz de crescer com µmáx de 0,41 h-1, enquanto R. eutropha foi de 0,18 h-1. Nesses experimentos, não houve praticamente produção de biopolímero pois não ocorreu a limitação de um nutriente essencial. Nos ensaios conduzido sem vinhaça com adição de glicerol, a recombinante foi capaz de crescer com µmáx de 0,33 h-1 e acumulou 34% de P(3HB), enquanto R. eutropha foi de 0,19 h-1 e 15% de P(3HB). Ao comparar o crescimento das duas cepas, nos cultivos contendo glicerol como fonte de carbono, ambas foram capazes de acumular aproximadamente 35% de biopolímero. Com os resultados obtidos neste trabalho, pode-se dizer que a vinhaça é um substrato com potencial para ser utilizado por R. eutropha, com velocidades específicas máximas de crescimento superiores às encontradas em outros substratos, porém há a necessidade de uma fonte de carbono adicional para aumentar os percentuais de acúmulo de biopolímero. Uma dessas alternativas é o glicerol que quando adicionado à vinhaça a produção de P(3HB) aumentou. O glicerol foi mais rapidamente consumido e com rendimentos maiores por R. eutropha_glpFK que por R. eutropha DSM 545. Assim, pode-se dizer que, R. eutropha é capaz de crescer e produzir P(3HB) a partir de vinhaça e glicerol. Abstract : Polyhydroxyalkanoates (PHA), a biodegradable energy store of microbes, is an alternative to petroleum-derived thermoplastics. Researches had been foccused to develop efficient production process with low costs.The bacteria Ralstonia eutropha is one of the most studied microrganisms for P(3HB) production, a widely studied PHA. Vinasse is the main liquid waste from ethanol industry and its valorization by a process that use this waste as substrate for an added value product, like P(3HB), contributes to ethanol production, besides try to solve an environment problem related to this waste. Glycerol is one of the main carbon source present in vinasse. In this study, vinasse was used as substrate for P(3HB) production by R. eutropha DSM 545. Different vinasse concentrations were evaluated, and no inhibitory effect were observed. Batch cultivation was performed in bioreactor using vinasse (undiluted) plus the mineral medium salts and R. eutropha could growth until 5 g/L final cell concentration. Once the bacteria reached the stacionary growth fase while residual substrates were available, like glycerol, this study examined the enhancement of glycerol assimitation ability of R. eutropha DSM 545 by introduction of the genes of aquaglyceroporin (glpF), able to facilitate the glycerol transport, and glycerol kinase (glpK), able to phosphorylated glycerol to yield glycerol 3-phosphate, from Escherichia coli. The growth behavior of the recombinant strain was compared to the parental strain on glucose and results showed that the glpFK expression didn?t affect R. eutropha DSM 545 behavior. Batch cultivations in bioreactor were performed to compare the parental and the engineered strains, on vinasse, vinasse plus glycerol and glycerol, as culture medium. On cultivations using vinasse, the recombinat strain grow with a µmáx of 0,41 h-1, while R. eutropha was 0,18 h-1 and no P(3HB) production was observed, since the nitrogen limitation did not occurred. When vinasse plus glycerol was used as culture medium, aimed to increase the carbon source, R. eutropha_glpFK was able to growth with µmáx 0,33 h-1 and produced 34% of P(3HB), while the wild type grow with µmáx 0,19 h-1 and produced 15% of P(3HB). In the cultivations using only glycerol as substrate, without considering the difference in pre culture time, both strains showed the same behavior and produced about 35% of P(3HB). In conclusion, vinasse is a potencial substrate for R. eutropha, showing maximum specific growth rates higher when compared to others substrates, but it requires an extra carbon source to increase the P(3HB) accumulation. In this context, glycerol is a good alternative, since when it was used with vinasse the biopolymeraccumulation was higher and it was efficiently consumed by the engineered strain expressing glpFK genes.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2015. O objetivo deste trabalho é contribuir para o avanço do processo tecnológico de extração de P(3HB), obtido a partir de Cupriavidus necator DSM 545, com o desenvolvimento de um processo que combina a aplicação de método mecânico com o solvente carbonato de propileno. Este estudo está dividido em quatro partes. A primeira parte consiste no estudo da influência das variáveis de processo dos métodos mecânicos, ultrassom e homogeneizador à alta pressão, na recuperação e pureza do polímero extraído com carbonato de propileno (150 °C e tempo de contato células solvente de 45 min). Neste estudo as variáveis para aplicação de ultrassonificação foram potência e tempo do ciclo de aplicação e, na homogeneização à alta pressão foram pressão de operação e número de passagens da suspensão celular pelo equipamento. Os resultados demonstraram que, no método de extração que combina aplicação de homogeneizador à alta pressão e solvente, a melhor condição foi obtida com a pressão de 1300 bar e duas passagens pelo equipamento, pois foram obtidos os melhores resultados de recuperação de P(3HB) (97,7 %) com elevada pureza (97,8 %) e menor degradação da massa molar em relação às outras condições testadas. A extração com ultrassom e solvente também mostrou-se eficaz pois, na melhor condição de tratamento da biomassa com ultrassom, potência de 200 W e três ciclos de aplicação de 59 s, foi possível obter elevada recuperação polimérica (92,0 %) com pureza de 99,0 %. Com base nas condições de aplicação de ultrassom e homogeneização à alta pressão definidas anteriormente, na segunda parte deste estudo foi realizada a avaliação cinética da influência de variáveis do processo de extração: tratamento da biomassa (homogeneizador à alta pressão e ultrassom) para efeito comparativo realizaram-se também ensaios a partir de biomassas sem tratamento e tratadas termicamente, temperatura de extração (130 e 150 °C) e tempo de contato células/solvente (5, 15, 30 e 45 min) sobre a porcentagem de recuperação e porcentagem de pureza do polímero extraído. Uma vez definido o melhor tratamento da biomassa a ser aplicado em conjunto com carbonato de propileno como método de extração de P(3HB) e, foi verificada a influência deste processo na massa molar do polímero extraído. O método de extração de P(3HB), que associa o tratamento da biomassa com homogeneizador à alta pressão e recuperação polimérica com carbonato de propileno a 150 °C por 5 min, foi definido como o mais eficiente para obtenção de elevadas porcentagens de recuperação de P(3HB) (93,6 %) e pureza (99,0 %) emum menor tempo de contato das células com o solvente, além da menor degradação da massa molar do polímero extraído. A terceira parte é referente ao estudo das variáveis do processo de homogeneização à alta pressão e carbonato de propileno na recuperação, pureza e características do polímero extraído. Para este estudo, foram variadas as pressões de operação (500, 900, 1300 e 1500 bar), número de passagens (1, 2 e 3) e o tempo de contato das células com solvente (5 e 15 min). A melhor condição de extração foi obtida com a pressão de 900 bar e 5 min de contato das células com carbonato de propileno aquecido a 150 °C, pois foram obtidos elevados percentuais de recuperação de P(3HB) (97,8 %) com apenas uma passagem da biomassa pelo homogeneizador. Através da caracterização do polímero extraído na melhor condição, verificou-se que o mesmo apresentou características térmicas e de massa molar semelhantes aos polímeros (P(3HB)) comerciais. Por fim, a última parte desse trabalho está relacionada com o efeito da reutilização do carbonato de propileno, recuperado do processo de extração de P(3HB) sobre a porcentagem de recuperação e porcentagem de pureza do biopolímero extraído e com a avaliação das perdas de solvente nas etapas do processo de extração. Foi observada a possibilidade de recuperar 80 % do carbonato de propileno no processo de extração do P(3HB). Sendo que dos 20 % de carbonato de propileno não recuperado, 5 % é referente à perda de solvente no processo de separação deste da água, sendo o restante proveniente de perdas nas etapas de filtração (11 %) e nos resíduos celulares (4 %). O solvente recuperado foi reutilizado por onze vezes sem perder a eficiência no rendimento e na pureza do polímero obtido. Assim, o conjunto de dados obtidos neste estudo é relevante para a melhoria do processo de extração de P(3HB) produzido por C. necator, pois propõe o desenvolvimento de um método de extração eficaz que combina homogeneização à alta pressão e carbonato de propileno, solvente de baixa toxidade que pode ser reutilizado no processo de extração, contribuindo para a redução dos custos de produção deste biopolímero, o que torna a extração de P(3HB) com este solvente mais competitiva no que se refere à economicidade do processo. Abstract : The aim of this work was to contribute to the advancement on the technological process of P(3HB) extraction by Cupriavidus necator DSM 545, with the development of a process with the combination of a mechanical method and the solvent propylene carbonate. This study is divided into four parts. The first one was the study of the influence of the mechanical process variables using ultrasound and high pressure homogenizer, on the recovery and purity of the extracted polymer with propylene carbonate (150 °C during 45 min). In this study the variables were the power of applying ultrassonification and application time and in the high pressure homogenization method, the variables were the operating pressure and the cell suspension number of passages through the device. The results showed that, in the method that combines the homogenizer at high pressure and solvent, the best condition was obtained with 1300 bar and two passages, with the best recovery results of P (3HB) (97.7 %) with high purity (97.8 %) and lower molecular weight degradation against other conditions tested. The method with solvent and ultrasound was also effective, because using ultrasound with 200 W of potency and three 59 s application cycles, it was possible to obtain high polymer recovery (92 %) with purity of 99.0 %. Based on ultrasound application conditions and high pressure homogenization previously defined, the second part of this study was performed to evaluate the influence of kinetic extraction process variables: biomass treatment (homogenizer at high pressure and ultrasound, for comparison biomass thermally treated and untreated were performed); the extraction temperature (130 to 150 °C) and contact time cells/solvent (5, 15, 30 and 45 min). Once defined the best treatment of the biomass to be used with propylene carbonate, and its influence on the process, the molecular weight of the extracted polymer was verified. The P(3HB) extraction method combining the biomass treatment using high pressure homogenizer and propylene carbonate at 150 °C for 5 min, was the most efficient for achieving high recovery percentages P(3HB) (93.6 %) and purity (99.0 %) in a shorter time of contact of the cells with the solvent, in addition to less degradation of the molecular weight of the polymer. The third part relates the study of the process variables using high pressure homogenization and propylene carbonate on the purity and recovery of P(3HB) and at the characteristics of the extracted polymer. In this part of the work, different operating pressures (500, 900, 1300 and 1500 bar) and number of passages (1, 2 and 3) were tested as wellas the contact time between the cells and the solvent (5 and 15 min). The best performance was obtained by the combination of treatment with high-pressure homogenizer (900 bar) and extraction with propylene carbonate, during 5 min, at 150 ºC, the recovery of P(3HB) was 97.8 % with only one biomass passage through the homogenizer. The characterization of the polymer extracted in the best condition, showed that it had thermal characteristics and molecular weight similar to the comercial P(3HB). The last part of this work related the effect of propylene carbonate reutilization on the percentage of recovery and purity of the extracted biopolymer and the evaluation of the solvent loss during the steps of the process. The ability to recover 80 % of propylene carbonate in the extraction process P(3HB) was observed. Since 20 % of unrecovered propylene carbonate, 5 % is related to the loss of solvent in the separation process of this water, the remainder being losses from filtration steps (11 %) and cellular debris (4 %). The recovered solvent was reused eleven times without losses in the yield and purity of the obtained polymer. Thus, the set of data from this study is relevant to improve the P(3HB) extraction process produced by C. necator, it proposes the development of an efficient extraction method that combines high pressure homogenization and propylene carbonate, a low toxicity solvent which can be reused in the extraction process, contributing to reduction of production costs of this biopolymer, which makes the extraction of P(3HB) with this solvent more competitive in respect to economy of the process.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2015. Os Polihidroxialcanoatos (PHAs), com destaque para o Poli(3-hidroxibutirato) (P(3HB)) e o Poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (P(3HB-co-3HV)), são poliésteres biodegradáveis, produzidos intracelularmente por muitos microrganismos. A bactéria Cupriavidus necator destaca-se por ser capaz de acumular mais de 80 % de sua massa seca em polímero e assimilar diferentes fontes de carbono. O custo de produção desses polímeros ainda é elevado e a utilização de substratos de baixo custo, como resíduos agroindustriais, aparece como alternativa para diminuição dos custos. Resíduos agroindustriais, entretanto, apresentam baixa ou moderada concentração de carbono, exigindo estratégias de cultivo como a batelada sequencial com reciclo externo de células para garantir a obtenção de processos com alta produtividade. Modelos estruturados, que levam em conta as reações metabólicas envolvidas no processo, têm tido utilização destacada em processos biotecnológicos como uma ferramenta na predição de condições de cultivo que maximizem a produção do produto. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a produção de P(3HB) e P(3HB-co-3HV), por C. necator, utilizando substrato com baixa concentração de glicose e adição de ácido propiônico, em cultivos realizados em batelada sequencial com reciclo externo de células, conduzidos sob exaustão ou limitação de nitrogênio ao longo da fase de produção. Além disso, pretendeu-se desenvolver e validar um modelo fenomenológico estruturado, baseado na Análise de Fluxos Metabólicos (AFM), para auxiliar na compreensão do comportamento metabólico de C. necator e obter condições de processo que maximizem a produção de P(3HB), a partir de glicose, no sistema com reciclo externo de células. Os resultados mostraram que a alimentação de nitrogênio em concentração limitante durante a fase de produção, no sistema batelada sequencial com reciclo externo de células, aumentou a produtividade do processo, frente aos resultados obtidos a partir da exaustão de nitrogênio durante a fase de produção neste mesmo sistema. Na produção de P(3HB-co-3HV), verificou-se que a relação entre as unidades 3HV/3HB aumentou ao longo de toda a fase de produção. O modelo fenomenológico foi construído a partir de 17 metabólitos chave e 15 reações estequiométricas. Equações que descrevem a inibição pela concentração inicial de glicose e nitrogênio foram também consideradas no modelo. O modelo foi validado para diferentes estratégias de cultivo: batelada, batelada alimentada, batelada sequencial com e sem reciclo de células e alimentação de nitrogênio na fase de produção. Um cultivo em modo batelada sequencial com reciclo externo de células, alimentação de nitrogênio na fase de produção e concentrações iniciais de substrato não inibitórias foi realizado. A produtividade volumétrica (1,35 g.L-1.h-1) foi 35 % superior à obtida por Ienczak et al. (2015) que utilizaram sistema em batelada sequencial com reciclo de células. Estes resultados mostraram que a estratégia proposta no presente trabalho é eficiente na obtenção de alta densidade celular (86,3 gXt.L-1) e produtividade de processo, e que o modelo fenomenológico estruturado desenvolvido pode ser muito útil na predição de condições de maximização da produção de P(3HB) por C. necator, a partir de glicose. Abstract : Polyhydroxyalkanoates (PHAs), highlighting the Poly(3-hydroxybutyrate) (P(3HB)) and the Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (P(3HB-co-3HV)), are biodegradable polyesters produced intracellularly by many microorganisms. The bacterium Cupriavidus necator stands out due its ability to accumulate more than 80 % of its dry mass in polymer and, assimilate different carbon sources. These biopolymers present high production cost and the utilization of low cost substrates, as agroindustrial wastes, is an alternative to reduce this cost. However, the agroindustrial wastes present moderate or low carbon concentration, requiring culture strategies as the repeated batch with external cell recycle to ensure the achievement of high process productivity. Structured models, which take into account the metabolic reactions involved in the process, have been largely applied in biotechnological process as a tool in predicting culture conditions that can maximize the product production. The aim of the present work was to evaluate the P(3HB) and P(3HB-co-3HV) production, by C. necator, using substrate with low glucose concentration and propionic acid addition, in repeated batch cultures with external cell recycle, conducted in exhaustion or limitation of nitrogen during the production phase. Also, it was intended to develop and to validate a structured phenomenological model, based in the Metabolic Flux Analysis (MFA), to help in the comprehension of the metabolic behavior of C. necator and in obtaining process conditions that maximize the P(3HB) production, from glucose, in the system with external cell recycle. The results showed that the limited nitrogen feeding during the production phase, in the repeated batch system with external cell recycle, increased the process productivity, compared to the results obtained from the nitrogen exhaustion during the production phase in the same system. In the P(3HB-co-3HV) production, it was verified that the relation between the 3HV/3HB units increased during all the production phase. The phenomenological model was built considering 17 key metabolites and 15 stoichiometric reactions. Equations that can describe the growth inhibition by the initial concentration of glucose and nitrogen were also considered in the model. The model was validated to different culture strategies: batch, fed batch, repeated fed batch with or without cell recycle and nitrogen feeding during the production phase. One repeated batch culture with external cell recycle, nitrogen feeding during the production phase, and not inhibitory initial glucose and nitrogen concentrations, was performed. The volumetric productivity (1.35 g.L-1.h-1) obtained was 35 % higher than the results reported by Ienczak et al. (2015), which applied a repeated batch system with external cell recycle. These results showed that the strategy proposed in the present work is efficient in obtaining high cell density (86.3 gXt.L-1) and process productivity, and, the phenomenological model developed can be useful in predicting conditions that maximize the P(3HB) production by C. necator, from glucose.

Mestrado em Biotecnologia - Biotecnologia Industrial e Ambiental O objetivo deste trabalho consistiu na valorização do folhelho de uvas brancas, um subproduto da indústria vitivinícola rico em monossacarídeos, através da produção de polihidroxialcanoatos (PHAs) pelos microrganismos Cupriavidus necator e Haloferax mediterranei. Os PHAs são poliésteres intracelulares acumulados por microrganismos como reservas de carbono, com valor comercial pela sua natureza biodegradável e biocompatível. De modo a avaliar a produção de PHAs pelos dois microrganismos, realizaram-se ensaios em meio definido suplementado com glucose e manose (meio sintético MG), os açúcares predominantes no extrato, em extrato aquoso de folhelho (EAF) suplementado com os constituintes do meio mineral. Dos ensaios realizados em erlenmeyer com C. necator em EAF verificou-se que a bactéria era capaz de crescer a uma taxa específica máxima de 0,19 h-1 até uma concentração de biomassa final de 17,11 g/L, com uma acumulação de 30,38% P(3HB) (mPHA/mX). No ensaio realizado em reator descontínuo com regulação de pH, em meio 50% (v/v) EAF, verificou-se o melhor resultado de produção, com a acumulação de 85,60 % P(3HB) mPHA/mX. H. mediterranei revelou-se incapaz de crescer significativamente em EAF. No ensaio realizado com H. mediterranei em meio sintético com 2% de glucose verificou-se uma taxa específica de crescimento máxima de 0,03 h-1, uma concentração de biomassa final de 23,66 g/L e uma acumulação de 4,89 g/L P(3HB/3HV) (17,21% mPHA/mX). O polímero produzido por H. mediterranei foi identificado como P(3HB/3HV), constituído por 90,04% HB/ 9,96% HV. Neste trabalho foi verificada pela primeira vez a adequação do EAF como meio para produção de PHAs. Estes resultados são uma contribuição valiosa no processo de valorização deste subproduto agroindustrial, e adjacente propósito de redução de custos na produção de PHAs. The aim of this work was the valorization of the white grape skins, a byproduct of the wine industry, through the production of polyhydroxyalkanoates (PHAs) using Cupriavidus necator and Haloferax mediterranei. PHAs are intracellular polyesters stored in the cell as carbon source, with commercial value as bioplastics due to its biodegradable and biocompatible nature. Accumulation tests were carried using defined synthetic medium supplemented with glucose and mannose (main sugars in the extract) and white grape skins aqueous extract (GSAE) supplemented with mineral medium constituents. From the tests performed in erlenmeyer with C. necator in GSAE it was found that bacteria could grow to a maximum specific rate of 0.19 h-1 to a final biomass concentration of 17.11 g.L-1, with an accumulation of 30.38% P(3HB) (mPHA/mX). When production tests were performed in a batch reactor with pH regulation, using 50% (v/v) GSAE, best result of accumulation were achieved, with accumulation of 85.60% P(3HB) (mHB/mX). H. mediterranei revealed to be unable to grow significantly in GSAE. In the test with H. mediterranei in synthetic medium containing 2% glucose, there was a specific maximum growth rate of 0.03 h-1, a final biomass concentration of 23.66 g.L-1 and an accumulation of 4.89 g.L-1 P(3HB/3HV) (17.21% mPHA/mX). The polymer produced by H. mediterranei was identified as P(3HB/3HV) consisting of 90.04% HB/ 9.96% HV. This work recognizes for the first time the suitability of the GSAE as a substrate for PHA production. These results are a valuable contribution to the valorization of this agro-industrial by-product, and adjacent cost reduction in the PHA production process.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2012 O poli(3-hidroxibutirato) - P(3HB), é um poliéster natural e biodegradável, produzido por cultura bacteriana, sendo considerado um atrativo substituto para os polímeros petroquímicos. O glicerol, por sua vez, que teve sua disponibilidade no mercado ampliada em decorrência da política nacional de estímulo à adição de biodiesel nos combustíveis fósseis, pode ser utilizado para diversas finalidades. Dentre elas, destaca-se seu uso como fonte de carbono no cultivo de micro-organismos. Diante da disponibilidade de glicerol, objetivou-se neste trabalho utilizá-lo como fonte de carbono adicional na produção de P(3HB). Foram realizados ensaios preliminares nos quais foi avaliada a possibilidade do uso do glicerol proveniente da produção do biodiesel na biossíntese do P(3HB). Em seguida, foram realizados ensaios planejados por meio de um delineamento composto central rotacional (DCCR) 23 com 3 pontos centrais no qual foram avaliadas a influência da temperatura e das concentrações de açúcar invertido e glicerol no crescimento de Cupriavidus necator, bem como na produção e acúmulo do polímero pela célula, ensaio este que foi em seguida validado em triplicata avaliando sua cinética. A melhor condição validada teve sua escala ampliada para biorreator de 2 L, também com avaliação cinética e extração dos filmes para a sua caracterização físico-química, térmica e mecânica. E, finalmente, foram realizados os ensaios de biodegradação em solo e exposição em câmara de envelhecimento acelerado, com avaliação do material degradado. Nos ensaios preliminares constatou-se que o glicerol bruto poderia ser utilizado como fonte de carbono adicional ao meio de cultivo de C. necator. Os resultados do DCCR revelaram que o aumento da temperatura levou a um incremento na produção e no acúmulo de P(3HB) e que, quando foram utilizados 15 g L-1 de glicerol, chegou-se a resultados de acúmulo 15 % superiores, porém não considerados como estatisticamente significativos. O modelo obtido no DCCR foi validado para todas as condições para o acúmulo percentual de P(3HB) e para a produção de polímero diferiu em 3 % do valor experimental obtido para a condição a 38 °C, 15 g L-1 de açúcar invertido e 15 g L-1 de glicerol, para as demais condições testadas o modelo foi validado. Em biorreator, foram realizados cinco ensaios, sendo que para os ensaios com adição de glicerol bruto como substrado ou cosubstrato não houve crescimento ou produção de P(3HB) viável para extração. Na caracterização dos polímeros sintetizados em biorreator com e sem adição de glicerol puro, verificou-se que o uso do glicerol não modificou as propriedades dos filmes, mas foi possível afirmar que os polímeros obtidos e extraídos nesse trabalho eram mesmo o P(3HB). Em solo, as amostra degradaram em 35 dias, enquanto na exposição dos filmes à câmara de envelhecimento acelerado notou-se maior estabilidade das amostras o que permitiria a aplicação do polímero no ambiente, sem que ele se degradasse Abstract: Poly(3-hydroxybutyrate) - P(3HB) is a natural, biodegradable polyester, produced by bacterial fermentation, and considered an attractive replacement for petrochemical polymers. Glycerol had expanded its availability in the market due to the national policy of encouraging the addition of biodiesel in fossil fuels, the glycerol can be used for several purposes. Among them, its use as a carbon source for the cultivation of microorganisms has been highlighted. Through the availability of glycerol, this study aimed to use it as an additional carbon source on the production of P(3HB). First of all, preliminary tests were conducted to evaluate the possibility of the use of glycerol from the biodiesel production in the biosynthesis of P(3HB). Then, tests were conducted planned by a central composite rotatable design (CCRD) 23 with three central points in order to evaluate the influence of the temperature and the concentrations of inverted sugar and glycerol on Cupriavidus necator growth, as well as the production and accumulation of the polymer into the cell. The experiments were made in triplicate and the kinetics were evaluated. The best condition of the process had their range expanded to 2 L bioreactor. The kinetic were evaluated and the films obtained had its physical-chemical, thermal and mechanical properties evaluated. Finally, biodegradation in soil assays were performed and exposure chamber accelerated aging was performed, with evaluation of the degraded material. In preliminary tests it was found that crude glycerol could be used as an additional carbon source to the culture medium of C. necator. The results of the CCRD revealed that the increase of the temperature led to an increase in the production and accumulation of P(3HB) and when 15 g L-1 of glycerol were added to the medium, an accumulation of 15% was reached, but not considered as statistically significant. The model obtained in CCRD was validated for all conditions for the accumulation percentage of P (3HB) and the polymer production differed in 3 % of the value obtained for the experimental condition at 38 °C, 15 g L-1 of inverted sugar and 15 g L-1 of glycerol, for the other conditions tested the model was validated. Five tests were performed in bioreactor, and no growth or production of P (3HB) viable for extraction was identified for assays with crude glycerol as substrate or co-substrate. In the characterization of the polymers synthesized in bioreactor with and without addition of pure glycerol, it was found that the use of glycerol did not modify the film properties, but it was possible to say that the polymers extracted were P(3HB). In soil, the samples degraded in 35 days, while the films that was exposed at the accelerated aging chamber presented greater stability of the samples which would allow the application of the polymer in the environment without degradation.

O efluente vinhaça de soja, obtido do processo de recuperação do álcool a partir do melaço de soja, apresenta elevada demanda química de oxigênio (DQO) e alta toxicidade, não podendo ser tratado como um efluente residual comum. Diariamente no Brasil, são obtidos 10000 L de etanol com geração de um volume diário de 220000 L de vinhaça de soja, na única unidade industrial de produção de etanol a partir do processamento de soja. A prevalência deste efluente no ambiente representa um novo centro de bases de pesquisas e estudos ligados à gestão ambiental. Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de avaliar a redução da carga poluidora em vinhaça de soja. Foram testados dois tratamentos biotecnológicos utilizando duas linhagens do gênero Cupriavidus, nomeadamente NRRL B-2804 e NRRL B-4383 e uma linhagem de Pseudomonas oleovorans NRRL B-778, no intuito de redução da DQO e produção de um biopolimero com valor econômico agregado. A DQO inicial da vinhaça de soja, foi de 155,18 g.L -1 . Um estudo preliminar foi realizado em diferentes concentrações de vinhaça de soja com o intuito de avaliar os parâmetros de produção de biomassa em teor de massa seca, temperatura e crescimento celular dos microrganismos mais adequados. Aplicaram-se tratamentos conduzidos em dois meios de cultivos MC1e MC2 utilizando ensaios em nonata em frascos de erlenmeyer de 500 mL de capacidade com 150 mL do meio de cultivo aletados para cada tratamento. Os cultivos foram preparados com vinhaça de soja diluída a 30%, caldo nutriente modificado, suplementados com hidrolisado de casca de arroz, onde MC2 foi diferenciado do MC1 por subtrair o meio mineral (MM) de sua composição. No final do estudo, duas linhagens foram selecionadas, C. necator NRRL B-2804 e NRRL B-4383 e 36 unidades experimentais foram preparadas. O decréscimo da DQO e a formação de biomassa em MC1 e MC2 foram avaliados estatisticamente mediante testes de Tukey e de Levene utilizando a ANOVA para descriminação de médias e verificação da homogeneidade entre tratamentos. Os valores máximos de redução de DQO obtidos para MC1 e MC2 inoculados com a linhagem C. necator NRRL B-2804, foram de respectivamente 72% e 65% de remoção para o cultivo em agitador orbital á 180 rpm, 30 ºC em relação a DQO inicial da vinhaça antes do tratamento. O meio MC2 inoculado com a linhagem C. necator NRRL B-4383 foi escolhido e fermentado em biorreator-fermentador TEC-BIO 7,5 L durante 72 h, com remoção da DQO em até 66% nas mesmas condições. A presença de polihidroxialcanoatos (PHAs) na biomassa obtida a partir do meio MC2 inoculado com a linhagem C. necator NRRL B - 2804 foi identificada para temperatura de fusão de 173 ºC, confirmada pela literatura. A redução da DQO obtida para a vinhaça de soja, utilizando meios de cultura contendo resíduos industriais, demonstrou ser um tratamento promissor para novas perspectivas com foco na gestão ambiental, para as condições aplicadas neste estudo, podendo ser melhorado com otimização do bioprocesso utilizado. The effluent vinasse , soybean obtained by the process of recovery of alcohol from molasses , soybean has a high chemical oxygen demand ( COD) and high toxicity and can not be treated as a common waste effluent . By environmental problems and complications that can generate wastewater at the plant , is a new challenge that the choice for your treatment. Daily in Brazil, are obtained 10,000 L of ethanol to generate a daily volume of 220,000 L of soybean vinasse, in the only producing ethanol plant from soybean processing. The prevalence of this effluent in the environment represents a new central basis for research and studies related to environmental management. This work was developed to evaluate the reduction of the pollution load in soybean vinasse. Two treatments were tested (culture medium) using two strains of the genus Cupriavidus, including NRRL B - 2804 and NRRL B - 4383 and a strain of Pseudomonas oleovorans NRRL B -778 . The COD of vinasse, soybean was 155.18 gL-1 . It was conducted a preliminary study in soybean vinasse concentrations and evaluated the parameters such as biomass production in dry matter content, temperature and cell growth of microorganisms suitable for use. Treatments were applied and conducted in two culture media MC1 and MC2 using nonata tests in 500 mL Erlenmeyer flask with 150 mL capacity of culture medium for each finned treatment. The cultures were prepared with soybean vinasse diluted to 30%, modified nutrient broth supplemented with hydrolyzed rice husk, and MC1 was distinguished from the MC2 by subtracting the mineral medium (MM) of its composition. At the end of the study, two strains were selected C. necator NRRL B – 2804, NRRL B – 4383 respectively and 36 experimental units were prepared. The results of COD decrease and biomass formation in MC1 and MC2 were evaluated statistically by Tukey test and Levene using ANOVA for discrimination means and verification of homogeneity among treatments. The maximum reduction of COD obtained for MC1 and MC2 inoculated with the strain C. necator NRRL B- 2804 , respectively was 72% and 65 % of removal for cultivation in orbital shaker at 180 rpm, 30°C within the initial COD before vinasse treatment. The medium inoculated with strain MC2 C. necator NRRL B- 4383 was selected and fermented in a bioreactor - fermenter BIO - TEC 7.5 L for 72 h with 66% of COD removal under the same conditions. The presence of polyhydroxyalkanoates (PHAs) derived from biomass in the medium inoculated with the strain MC2 C. necator NRRL B - 2804 was identified by the fusing temperature of 173°C confirmed in the literature. The COD reduction obtained for the soybean vinasse using culture media containing industrial waste, proved to be a promising treatment for new perspectives with a focus on environmental management, to the conditions applied in this study could be improved by optimization of the bioprocess used.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2010 Poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidrohivalerato) [P(3HB-co-3HV)] é um biopolímero acumulado intracelularmente por muitos organismos como reserva de carbono e energia, em condições desbalanceadas do meio. Possui propriedades termoplásticas semelhantes às dos plásticos petroquímicos e a vantagem de ser biocompatível e completamente biodegradável. Entretanto possui custo elevado de produção frente aos polímeros convencionais, o que limita o uso. Diferentes estratégias de cultivo para a produção do copolímero P(3HB-co-3HV) por Cupriavidus necator foram avaliadas, com o objetivo de aumentar a produtividade do processo, e, consequentemente, a redução do custo de produção. O monitoramento da concentração de biomassa e da concentração de oxigênio dissolvido indicou as mudanças metabólicas do microrganismo, sinalizando o momento da limitação de nutriente. Esta sinalização facilita o processo produtivo, permitindo que as alimentações de nitrogênio e ácido propiônico sejam efetuadas a partir do momento exato do início da fase de produção, evitando desperdício de co-substrato. Visando testar a utilização de substratos alternativos de baixo custo, foram realizados testes em bioreator, estudando o crescimento de C. necator em diferentes fontes de carbono (glicose e melaço cítrico). Quando se utilizou melaço cítrico como fonte de carbono, obteve-se maior velocidade específica de crescimento (0,35 h-1) comparada ao cultivo realizado em glicose (0,19 h-1), demonstrando-se dessa forma como substrato promissor para a produção de biopolímeros. A alimentação do elemento limitante (nitrogênio) durante a fase de produção permitiu a formação de um copolímero com 9,3 mol% de acúmulo das unidades 3HV, comparado ao acúmulo de 3,7 mol% em cultura submetida à carência de nitrogênio. No entanto, não foi observado aumento de produtividade em virtude do elevado crescimento residual promovido, o qual prejudicou o acúmulo do polímero. A cinética do crescimento e a transferência de oxigênio dissolvido durante o cultivo foram acompanhados. A velocidade específica de consumo de oxigênio (QO2) e o kLa foram determinados através do método dinâmico. Os resultados mostram que o kLa, a velocidade específica de crescimento (µX) e de respiração (QO2) são afetados pelo aumento da concentração de biomassa. O maior consumo global de oxigênio foi de 595 gO2.L-1.h-1 para uma concentração celular de 18 g.L-1 em cultivo realizado em glicose, sendo que a velocidade específica de consumo de oxigênio para manutenção celular neste cultivo foi de 47,1 mgO2.(gcél.h)-1. A modelagem matemática do crescimento da bactéria foi utilizada para estimar os parâmetros: velocidade específica máxima de crescimento (µmáx), tempo da fase lag (?) e aumento logarítmico da população (A), utilizando melaço cítrico e glicose como substrato. Utilizaram-se três modelos primários de crescimento (Gompertz Modificado, Logístico e Barany e Roberts) e o modelo de Gompertz Modificado foi o que apresentou melhor ajuste às curvas de crescimento da bactéria, para ambas as fontes de carbono testadas. Pelo modelo de Gompertz Modificado foi possível prever o momento da limitação da cultura. Por fim, a caracterização do copolímero produzido a partir das diferentes fontes de substrato testadas mostrou que os mesmos apresentam propriedades térmicas semelhantes ao copolímero industrial e superiores ao homopolímero industrial P(3HB).

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2009. Poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidrohivalerato) [P(3HB-co-3HV)] é um biopolímero acumulado intracelularmente por muitos organismos como reserva de carbono e energia, em condições desbalanceadas do meio. Possui propriedades termoplásticas semelhantes às dos plásticos petroquímicos e a vantagem de ser biocompatível e completamente biodegradável. Entretanto possui custo elevado de produção frente aos polímeros convencionais, o que limita o uso. Diferentes estratégias de cultivo para a produção do copolímero P(3HB-co-3HV) por Cupriavidus necator foram avaliadas, com o objetivo de aumentar a produtividade do processo, e, consequentemente, a redução do custo de produção. O monitoramento da concentração de biomassa e da concentração de oxigênio dissolvido indicou as mudanças metabólicas do microrganismo, sinalizando o momento da limitação de nutriente. Esta sinalização facilita o processo produtivo, permitindo que as alimentações de nitrogênio e ácido propiônico sejam efetuadas a partir do momento exato do início da fase de produção, evitando desperdício de co-substrato. Visando testar a utilização de substratos alternativos de baixo custo, foram realizados testes em bioreator, estudando o crescimento de C. necator em diferentes fontes de carbono (glicose e melaço cítrico). Quando se utilizou melaço cítrico como fonte de carbono, obteve-se maior velocidade específica de crescimento (0,35 h-1) comparada ao cultivo realizado em glicose (0,19 h-1), demonstrando-se dessa forma como substrato promissor para a produção de biopolímeros. A alimentação do elemento limitante (nitrogênio) durante a fase de produção permitiu a formação de um copolímero com 9,3 mol% de acúmulo das unidades 3HV, comparado ao acúmulo de 3,7 mol% em cultura submetida à carência de nitrogênio. No entanto, não foi observado aumento de produtividade em virtude do elevado crescimento residual promovido, o qual prejudicou o acúmulo do polímero. A cinética do crescimento e a transferência de oxigênio dissolvido durante o cultivo foram acompanhados. A velocidade específica de consumo de oxigênio (QO2) e o kLa foram determinados através do método dinâmico. Os resultados mostram que o kLa, a velocidade específica de crescimento (µX) e de respiração (QO2) são afetados pelo aumento da concentração de biomassa. O maior consumo global de oxigênio foi de 595 gO2.L-1.h-1 para uma concentração celular de 18 g.L-1 em cultivo realizado em glicose, sendo que a velocidade específica de consumo de oxigênio para manutenção celular neste cultivo foi de 47,1 mgO2.(gcél.h)-1. A modelagem matemática do crescimento da bactéria foi utilizada para estimar os parâmetros: velocidade específica máxima de crescimento (µmáx), tempo da fase lag (?) e aumento logarítmico da população (A), utilizando melaço cítrico e glicose como substrato. Utilizaram-se três modelos primários de crescimento (Gompertz Modificado, Logístico e Barany e Roberts) e o modelo de Gompertz Modificado foi o que apresentou melhor ajuste às curvas de crescimento da bactéria, para ambas as fontes de carbono testadas. Pelo modelo de Gompertz Modificado foi possível prever o momento da limitação da cultura. Por fim, a caracterização do copolímero produzido a partir das diferentes fontes de substrato testadas mostrou que os mesmos apresentam propriedades térmicas semelhantes ao copolímero industrial e superiores ao homopolímero industrial P(3HB). Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) [P(3HB-co-3HV)] is a biopolymer accumulated intracellularly by many microorganisms, as carbon and energy storage, under unbalanced growth. It possesses thermoplastic properties similar to the conventional plastics with advantages of biocompatibility and complete biodegradability. However, its high cost of production related to conventional plastics limits its use. Different strategies of P(3HB-co-3HV) production by Cupriavidus necator were studied, aiming to increase its productivity, and, consequently reducing the cost of production. Culture biomass potential and percentage of dissolved oxygen indicated state changes in C. necator and identified the limitation point during the culture. Further, it facilitated the production process allowing that nitrogen and propionic acid feedings were realized from the beginning of the production phase, without co-substrate waste. Looking for alternatives substrates of low cost, experiments in bioreactor were done, studying C. necator growth in different carbon sources (glucose and citrus molasses). When citrus molasses was used as carbon source, has been obtained a higher specific growth rate (0,35 h-1) compared with glucose (0,19 h-1), the production phase, it was demonstrated it is as a promising substrate for biopolymer production. Nitrogen feeding, during the production phase, allowed the formation of copolymer with higher percentage of 3HV units, with 9,3 mol% compared with accumulation of 3,7 mol% in the culture with nitrogen deficiency. However, there wasn't increase of productivity due to the high residual growth promoted. The kinetics growth and oxygen transfer were monitored during of cultivation. The specific oxygen uptake rate (QO2) and the kLa were determined through the dynamic method. Results show that kLa, as well as the specific growth (µX) and respiration rates (QO2), are affected by the increase in biomass concentration. The highest value of specific consumption rate of oxygen uptake observed was 595 mgO2.L-1.h-1, for a cell concentration of 18 g.L-1, in culture with glucose. The amount of oxygen necessary for cell maintenance was 47,1 mgO2.gcel.h-1. The mathematical modeling of bacterial growth was used to estimate the following parameters: specific maximum growth (µmáx), time of lag phase (?) and logarithmic increase of population (A), using citrus molasses and glucose as carbon source. Three primary models were used (Modified Gompertz, Logistic and Barany and Roberts) and the Modified Gompertz model was present the bets fit to the growth curves of the bacteria, on the different carbon source tested. Through Modified Gompertz model, it was possible to establish the moment of nitrogen limitation in the culture. The copolymer characterization obtained from differents carbon source tested showed that thermal properties were similar to the conventional copolymer and higher that to the conventional homopolymer P(3HB).

FACEPE As pectinas são hidrocolóides naturais, encontrados na parede celular primária das células vegetais e nas camadas intercelulares, contribuindo para adesão entre as células, firmeza e resistência mecânica dos tecidos. Estão presentes em grande quantidade nos subprodutos das indústrias de extração de sucos cítricos, e muitas vezes são descartados de forma inadequada, representando um grande passivo ambiental. Objetivando o aproveitamento desses resíduos como uma alternativa de baixo custo para a produção de polihidroxialcanoatos (PHAs), foi estudado o uso de ácido galacturônico e hidrolisados pécticos para crescimento celular de Cupriavidus necator e Pseudomonas putida. Foram estudados métodos de hidrólise ácida e enzimática, através da aplicação de planejamento fatorial e metodologia de superfície de resposta. Os resultados indicaram que o método de hidrólise enzimática foi mais eficiente permitindo obter um maior rendimento de compostos redutores (CR). As variáveis investigadas foram à concentração da enzima endo-poligalacturonase (endo-PG) e a agitação, mantendo-se a concentração de substrato em 1% (p/v). Os resultados obtidos foram comparados com a performance enzimática realizada com uma maior concentração de substrato (10% p/v) empregando-se diferentes concentrações de enzima. Ambos os resultados indicaram que a concentração enzimática de 10 UI/g de pectina favoreceu a obtenção de CR, permitindo atingir em média 70 g/L de CR a partir de 100 g/L de pectina. Ambos os micro-organismos cresceram na presença de ácido galacturônico, mas apenas C. necator apresentou crescimento satisfatório nos meios formulados com os hidrolisados pécticos, com velocidades específicas de crescimento (μMax) e taxas de conversão de substrato em células (Yx/s) semelhantes aos valores encontrados em estudos com outros substratos, como glicose, açúcar invertido e melaço. Essas condições de cultivo permitiram um crescimento celular acima de 10 g/L e o acúmulo intracelular de polihidroxialcanoatos.

Made available in DSpace on 2017-07-10T18:08:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Manoela E Boff Zortea.pdf: 4020211 bytes, checksum: 0f828faa5dff1470fa28c16252974f2d (MD5) Previous issue date: 2012-02-16 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The diversity of use of polymeric materials causes concern because the use of non-renewable source for its production, as well as the environmental problems caused by the accumulation of the volume of solid waste generated. Seeking to minimize this problem were sought alternative products similar to plastics of petrochemical origin, one of them is the biodegradable polymer. The polyhydroxyalkanoates (PHAs) are polyesters synthesized by microorganisms from natural substances such as carbon and energy reserves, and accumulated by microbial cell in the form of intracellular granules, which may represent up to 80 % of the dry cell. The most studied polymer of this class is the polyhydroxybutyrate (P(3HB)) a biodegradable polymer that has similar features to the plastics from petroleum. This study aimed to develop for growth of bacteria Cupriavidus necator for the production of poly (3-hydroxybutyrate) using medium supplemented with cassava bagasse, whey and soybean oil. The first crops were carried out using a 2³ factorial design, to obtain the best condition at this stage of growth with the supplements tested. Other experiments used medium limited in nitrogen and higher amounts of supplements. The results obtained from the experimental design showed that the highest biomass production during growth was obtained in experiments which showed through the three supplements in their central levels, followed by testing supplements containing cheese whey and soybean oil combined or the presence of only one of these two components. Four experiments with increasing concentrations of supplement showed that waste and cheese whey hydrolyzed starch presented as good culture media for growth of C. necator, and the increased production of cell biomass (5,8 g.L-1) at the time of the nutrient nitrogen limitation occurred in the culture containing 100 % hydrolyzed starch conversion factor and the best substrate was obtained in cells in medium containing the highest amount supplement cheese whey (50 %). A diversidade de utilização de materiais poliméricos acarreta preocupação devido a utilização de fonte não renovável para a sua produção, bem como os problemas ambientais causados pelo acúmulo do volume de lixo sólido gerado. Procurando minimizar este problema buscaram-se alternativas de produtos semelhantes aos plásticos de origem petroquímica, uma delas é o polímero biodegradável. Os polihidroxialcanoatos (PHAs) são poliésteres sintetizados por micro-organismos como substâncias naturais de reserva de carbono e energia, sendo acumulados pela célula microbiana na forma de grânulos intracelulares, podendo representar até 80% da massa seca celular. O polímero mais estudado desta classe é o polihidroxibutirato (P(3HB)) um polímero biodegradável que possui características semelhantes às dos plásticos provenientes de petróleo. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver estratégias de crescimento da bactéria Cupriavidus necator para produção de poli (3-hidroxibutirato), utilizando meio suplementado com bagaço de mandioca, soro de queijo e óleo de soja. Os primeiros cultivos foram realizados seguindo um planejamento experimental 2³, visando obter nesta etapa a melhor condição de crescimento com os suplementos testados. Os demais experimentos utilizaram meio limitado em nitrogênio e maior quantidade de suplementos. Os resultados obtidos através do planejamento experimental mostraram que as maiores produções de biomassa na fase de crescimento foram obtidas nos experimentos cujo meio apresentava os três suplementos em seus níveis centrais, seguido pelos ensaios que continham os suplementos soro de queijo e óleo de soja combinados ou somente a presença de um destes dois componentes. Quatro experimentos com aumento nas concentrações de suplemento mostraram que os resíduos soro de queijo e hidrolisado amiláceo apresentaram-se como bons meios de cultivo para o crescimento de C. necator, sendo que a maior produção de biomassa celular (5,8 g.L-1) no momento da limitação do nutriente nitrogênio ocorreu no cultivo contendo 100 % de hidrolisado amiláceo e o melhor fator de conversão de substrato em células foi obtido no meio contendo maior quantidade do suplemento soro de queijo (50 %).

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2011 Poli(3-hidroxibutirato) P(3HB) é um produto intracelular produzido por inúmeros micro-organismos, como reserva energética. Cupriavidus necator é a bactéria mais estudada para a produção deste polímero devido à sua capacidade de acumular até 80 % de sua massa seca em P(3HB). Devido aos altos custos de produção, melhorias no processo produtivo são necessárias para que este polímero seja comercialmente competitivo. Estudos já mostraram que a utilização de suplementos ou indutores da produção de P(3HB), como os óleos vegetais, é uma alternativa interessante para aumento de produtividade em polímero.Diversos óleos vegetais in natura já foram testados e apresentaram bons resultados, porém uma alternativa que pode potencializar estes resultados é a suplementação do meio com óleos miniemulsionados, que apresentam maior área de contato entre o óleo e a água. Neste contexto, o presente trabalho objetivou comparar o efeito da suplementação do meio de cultivo com óleo de soja in natura e miniemulsionado, com lecitina de soja, na produção de P(3HB) por C. necator. Os resultados mostraram que a concentração equivalente a 0,3 g.L-1 de ácido oléico promoveu maior aumento de produtividade de polímero do que a concentração equivalente a 0,6 g.L-1. O momento para a suplementação do meio de cultivo foi determinado a partir da análise de atividade enzimática, que mostrou que a adição do suplemento deve ser realizada quando a concentração de nitrogênio no meio é igual a 0,4 g.L-1, pois adicionando o suplemento neste momento, a atividade enzimática alcança valores máximos. Nos cultivos em biorreator, houve aumento de produtividade em ambos os cultivos suplementados, sendo que para a suplementação com o óleo in natura o aumento foi de 0,23 g.h-1, e para a miniemulsão foi de 0,29 g.h-1, ou seja, a miniemulsão não proporcionou melhores resultados. Este comportamento ocorreu provavelmente pelo fato de que a estabilidade das partículas de óleo na miniemulsão dificultaram o consumo deste substrato pelo microorganismo. Os dados de transferência de oxigênio mostraram um comportamento análogo, para os cultivos controle e suplementados com óleo de soja in natura e miniemulsionado, entre a velocidade de respiração microbiana (QO2X) e o coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (KLa). Primeiramente houve um crescimento em ambas as curvas até o início da fase estacionária de crescimento microbiano e posteriormente as curvas decresceram, pois o oxigênio é utilizado em sua maioria, para a manutenção celular, uma vez que o crescimento microbiano é mínimo nesta etapa. O modelo de Zabriskie e Humphrey (1978) pode ser utilizado como uma ferramenta na predição da biomassa celular ao longo do cultivo. O modelo se ajustou bem aos dados experimentais quando o fator de conversão (YX/O) e a velocidade específica de consumo de oxigênio dissolvido para manutenção celular (mo) foram calculados em duas fases distintas, uma de crescimento e outra de produção. No caso do cultivo considerado inteiro os valores de MSE, para os ajustes do modelo aos dados experimentais, dos cultivos controle e suplementados com óleo de soja in natura e miniemulsionado foram respectivamente de 1,41, 6,54 e 5,95, enquanto os valores para o cultivo considerado em duas fases distintas foram de 2,14, 0,58 e 1,12, respectivamente, para os cultivos controle e suplementados com óleo de soja in natura e miniemulsionado. Esta separação promoveu melhores resultados na predição da biomassa, pois a respiração microbiana é diferente nas duas fases. Os resultados deste trabalho mostraram que as suplementações do meio de cultivo com óleo de soja in natura e miniemulsionado, com lecitina de soja, nas condições estudadas, promoveram resultados semelhantes em termos de aumento de produtividade em polímero. Assim, a suplementação com óleo de soja in natura é preferível, pois o óleo não precisa passar por uma etapa de preparação antes da suplementação, o que acarreta custos ao processo. Poly(3-hydroxybutyrate) (P(3HB)) is an intracellular product produced by several microrganisms as energy source. Cupriavidus necator is the most studied bacterium for the production of this polymer due to its ability to accumulate up to 80 % of its dry weight in P(3HB). Due to high production costs, improving the production process is necessary to allow this polymer to be commercially competitive. Studies have shown that the use of supplements or inductors the production of P(3HB), like soybean oil, is an interesting alternative to increase the productivity on polymer. Several vegetable oils in natura have been tested and showed good results, but an alternative that can influence these results is the supplementation of the culture medium with miniemulsion oils, which have a larger contact area between oil and water. In this context, this study compares the effect of culture medium supplementation with in natura and miniemulsioned soybean oil, with soy lecithin, on P(3HB) production by C. necator. The results showed that the equivalent concentration of 0.3 g.L-1 in oleic acid promoted higher polymer productivity than the equivalent concentration of 0.6 g.L-1. The best moment for culture supplementation medium was determined from the analysis of enzymatic activity, which showed that the addition of the supplement should be made when the concentration of nitrogen in the culture medium was 0.4 g.L-1, since adding the supplement at this time, the enzyme activity achieves maximum values. Experiments in bioreactor increased the productivity in both cultures supplemented, for the in natura and miniemulsion soybean oil supplementation the increase of productivity was 0.23 g.h-1 and 0.29 g.h-1, respectively, in other words, the miniemulsion did not provide better results. This behavior occured probably because the stability of oil particles in miniemulsion, making difficult the consumption of substrate by the microorganism. The data of oxygen transfer showed a behavior similar, for the cultures without supplementation and supplemented with soybean oil in natura and miniemulsioned, to the oxygen uptake rate (QO2X) and the volumetric oxygen transfer coefficient (KLa). First there was an increase in both curves until the early stationary phase of bacterial growth and subsequently decreased, because oxygen is used mostly for cellular maintenance, since bacterial growth is minimal at this step. The model proposed by Zabriskie and Humphrey (1978) could be used as a tool for predicting the cellular biomass during the cultivation. The model fits well the experimental data when the yield (YX/O) and the maintenance coefficient for oxygen (mo) were calculated in two distinct phases, one of growth and other of production. When the cultivations were not separate, the MSE values for model fitting to experimental data, for control, in natura and miniemulsioned soybean oil supplementation cultivations were respectively 1.41, 6.54 and 5.95, while the MSE values for cultivations separated in two distinct phases were 2.14, 0.58 and 1.12, respectively, for control, in natura and miniemulsioned soybean oil supplementation cultivations. This separation promoted better results in the prediction of cellular biomass because the bacterial respiration is different in these two phases. The results of this study showed that supplementation of culture medium with soybean oil in natura and miniemulsion soybean oil, with soy lecithin, under the studied conditions, promoted similar productivity increase in polymer. Therefore, supplementation with soybean oil in natura is preferable, because the oil does not need any preparation before supplementation.