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The constant changes in eating habits led to the generation of products that add health benefits to those who consume them, as improvements of a physiological nature when related to the products available on the market. Among these products, D-tagatose appears as a promising substitute for sucrose, presenting 90% sweetness and low caloric value (1.5 kcal. g-1), when compared to common sugar (4.0 kcal. g-1). This sweetener is poorly absorbed by the body, does not raise blood sugar levels, and has prebiotic, antioxidant and anti-diabetic properties. One of the ways to obtain D-tagatose is through the isomerization of D-galactose catalyzed by the enzyme L-arabinose isomerase (L-AI). This study evaluates different strategies for obtaining the recombinant enzyme L-AI from Enterococcus faecium DBFIQ E36 in E. coli aiming to replace the induction method, which uses 0.5 mM of Isopropyl β-1-D-thiogalactopyranoside (IPTG) by the auto-induction method, aspiring to enable its availability at commercial level. For the process of obtaining the recombinant protein, glucose and glycerol were used as carbon sources, lactose (commercial) and lactose from whey as induction agents at concentrations of 2 and 4 g.L-1. Whey is considered a by-product of dairy industry and has stood out as a promising raw material applied in biotechnological processes. Cultivations by the auto-induction method are considered low cost, do not present cytotoxicity and since the bacteria select the sources of carbon and the inducer available in the medium, there is no need to monitor the process for adding lactose. The L-AI extracts achieved catalytic activities of 1.67 ± 0.14 U. mL-1 and 0.7 ± 0.04 U. mL-1, when produced using commercial lactose and IPTG, respectively. The extracts induced with lactose derived from whey showed catalytic activity of 3.8 U. mL-1. Evaluating the scale increase, the expression of the enzyme using commercial lactose in a bioreactor at 300 rpm with a useful volume of 3L and an oxygen transfer flow of 0.6 L.min-1, showed its maximum enzymatic activity with 8h of culture (2.7 ± 0.01 U.mL-1). L-AI exhibited the best catalytic activities at 50 °C, pH 5.6 and greater bioconversion of D-galactose isomerization reaction to D-tagatose when reaction occurred using 500 mM D-galactose reaching a concentration of 97.7 mM and 20% yield, after 28h. Thus, this study presented promising and innovative protocols for the effective expression of recombinant protein through auto-induction methods using commercial lactose and lactose from whey. A busca constante por mudanças nos hábitos alimentares levou à geração de produtos que agregam benefícios à saúde de quem os consome, apresentando vantagens de caráter fisiológico quando relacionados aos produtos disponíveis no mercado. Dentre esses produtos, a D-tagatose surge como um promissor substituto da sacarose, apresentando 90% de doçura e baixo valor calórico (1,5 kcal. g-1), quando comparada ao açúcar comum (4,0 kcal. g-1). Esse edulcorante é pouco absorvido pelo organismo, não eleva as taxas de açúcar no sangue, apresenta propriedades prebióticas, antioxidantes e antidiabéticas. Uma das formas de obtenção da D-tagatose é através da isomerização da D-galactose, catalisada pela enzima L-arabinose isomerase (L-AI). Esse estudo avalia as diferentes estratégias para a obtenção da enzima recombinante L-AI de Enterococcus faecium DBFIQ E36 em E. coli, visando a substituição do método de indução, com emprego de 0,5mM de Isopropil β-1-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) pelo método de autoindução, voltando-se para possibilitar sua disponibilidade à nível comercial. Para o processo de obtenção da proteína recombinante, foram empregados glicose e glicerol, como fontes de carbono, lactose (comercial) e lactose proveniente de soro de leite, como agentes de indução, nas concentrações de 2 e 4g.L-1. O soro de leite é considerado um subproduto da indústria de laticínios e tem se destacado como uma promissora matéria-prima aplicada em processos biotecnológicos. Os cultivos pelo método de autoindução, além de serem considerados de baixo custo, não apresentam citotoxidade e não é necessário monitoramento do processo para adição da lactose, uma vez que as bactérias realizam a seleção das fontes de carbono e do indutor, disponíveis no meio. Os extratos de L-AI alcançaram atividades catalíticas de 1,67 ± 0,14 U. mL-1 e 0,7 ± 0,04 U. mL-1, quando produzidos com uso da lactose comercial e IPTG, respectivamente. Os extratos induzidos com a lactose derivada do soro de leite apresentaram atividade catalítica de 3,8 U. mL-1. Avaliando o aumento de escala, a expressão da enzima com uso da lactose comercial, em biorreator, a 300 rpm, com volume útil de 3L e fluxo de transferência de oxigênio de 0,6 L.min-1, apresentou sua máxima atividade enzimática com 8h de cultivo (2,7 ± 0,01 U.mL-1). A L-AI exibiu as melhores atividades catalíticas a 50°C, pH 5,6 e maior bioconversão da reação de isomerização da D-galactose em D-tagatose, quando a reação ocorreu com uso de 500 mM de D-galactose, atingindo uma concentração de 97,7 mM e rendimento de 20%, após 28h. Assim, este estudo apresentou protocolos promissores e inovadores para a expressão efetiva da proteína recombinante, através dos métodos de autoindução, com emprego da lactose comercial e lactose procedente do soro de leite.

D-Tagatose is a ketohexose, which presents unique properties as a low-calorie functional sweetener possessing a sweet flavor profile similar to D-sucrose and having no aftertaste. Considered a generally recognized as safe (GRAS) substance by FAO/WHO, D-tagatose can be used as an intermediate for the synthesis of other optically active compounds as well as an additive in detergent, cosmetic, and pharmaceutical formulations. This study reports important features for L-arabinose isomerase (EC 5.3.1.4) (L-AI) use in industry. We describe arabinose (araA) gene virulence analysis, gene isolation, sequencing, cloning, and heterologous overexpression of L-AI from the food-grade GRAS bacterium Enterococcus faecium DBFIQ E36 in Escherichia coli and assess biochemical properties of this recombinant enzyme. Recombinant L-AI (rL-AI) was one-step purified to homogeneity by Ni2+-agarose resin affinity chromatography and biochemical characterization revealed low identity with both thermophilic and mesophilic L-AIs but high degree of conservation in residues involved in substrate recognition. Optimal conditions for rL-AI activity were 50 °C, pH 5.5, and 0.3 mM Mn2+, exhibiting a low cofactor concentration requirement and an acidic optimum pH. Half-life at 45 °C and 50 °C were 1427 h and 11 h, respectively, and 21.5 h and 39.5 h at pH 4.5 and 5.6, respectively, showing the high stability of the enzyme in the presence of a metallic cofactor. Bioconversion yield for D-tagatose biosynthesis was 45% at 50 °C after 48 h. These properties highlight the technological potential of E. faecium rL-AI as biocatalyst for D-tagatose production. Fil: Manzo, Ricardo Martín. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Desarrollo Tecnológico para la Industria Química. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Desarrollo Tecnológico para la Industria Química; Argentina Fil: Antunes, André Saraiva Leão Marcelo. King's College London; Fil: de Sousa Mendes, Jocélia. Universidade Estadual do Ceará; Brasil Fil: Hissa, Denise Cavalcante. Universidade Estadual do Ceará; Brasil Fil: Goncalves, Luciana Rocha Barros. Universidade Estadual do Ceará; Brasil Fil: Mammarella, Enrique José. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Desarrollo Tecnológico para la Industria Química. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Desarrollo Tecnológico para la Industria Química; Argentina

D-Tagatose is a rare sugar with a low caloric value, similar to sucrose, which has 92% of sweetness, but only 38% of the caloric value, approximately 1.5 kg.cal-1. It is considered an antihyperglycaemic agent, due to its low absorption and metabolism by the human organism. In addition, it has several benefits, such as its high antidiabetic potential for the treatment of type II diabetes and prebiotic effect. D-Tagatose can be produced by the enzymatic method from D-Galactose using as the biocatalyst the enzyme L-arabione isomerase. The L-AI enzyme used in this work was obtained from Enterococcus faecium expressed in Escherichia coli. In order to optimize the production of D-Tagatose by biological processes the isomerization reaction was studied. An experimental design of type 2³ with 3 replicates at the central point was carried out to analyze and find the best conditions of pH, temperature and initial concentration of substrate that achieve the highest conversion of D-Galactose in D-Tagatose. In addition, alternative techniques, such as the use of ultrasound and borate buffer were also analyzed. The concentration of D-Tagatose produced was determined by the colorimetric method using spectrophotometer. The results showed that there is a high influence of temperature and pH on the enzymatic reaction. The experimental design resulted in optimum D-Tagatose production at 55 ° C, pH 5.6 and substrate concentration of 164 mM reaching a yield of 29,77 %. It can also be seen that ultrasound increased the effect of temperature on the reaction. In addition, the work indicates that the enzymatic reaction of D-Galactose isomerization in D-tagatose occurs in the temperature range in which the process is non-spontaneous. Thus, it is concluded that the reaction conditions are capable of altering the speed of the enzymatic reaction, but its equilibrium is well defined. A D-Tagatose é um açúcar raro com baixo valor calórico, similar a sacarose possuindo 92% do seu poder de dulçor, porém com apenas 38% do valor calórico, aproximadamente 1,5 Kg.cal-1. É considerado um agente anti-hiperglicemante, devido a sua baixa absorção e metabolização pelo organismo humano. Além disso, possui vários benefícios, como o seu alto potencial antidiabético para o tratamento de diabetes tipo II e efeito prebiótico. A D-Tagatose pode ser produzida através do método enzimático a partir da D-Galactose utilizando como biocatalisador a enzima L-arabione isomerase, A enzima L-AI utilizada nesse trabalho foi obtida de Enterococcus faecium expressa em Escherichia coli. Com o intuito de otimizar a produção de D-Tagatose, por processos biológicos, a reação de isomerização foi estudada. Realizou-se um planejamento experimental do tipo 2³ com 3 repetições no ponto central para analisar e encontrar as melhores condições de pH, temperatura e concentração inicial de substrato que promovem a maior conversão de D-Galactose em D-Tagatose. Além disso, técnicas alternativas, como o uso do ultrassom e do tampão borato, também foram analisadas. A concentração de D-Tagatose produzida foi determinada pelo método colorimétrico utilizando espectrofotômetro. Os resultados mostraram que existe uma forte influência da temperatura e do pH sob a reação enzimática. O planejamento experimental resultou no ponto ótimo de produção de D-Tagatose nas condições de 55 °C, pH 5,6 e concentração de substrato de 164 mM, obtendo um rendimento de 29,77 %. Também observou-se que o ultrassom aumentou o efeito da temperatura na reação. Além disso, o trabalho aponta que a reação enzimática de isomerização da D-Galactose em D-Tagatose ocorre na faixa de temperatura na qual o processo é não espontâneo. Com isso, conclui-se que as condições reacionais são capazes de alterar a velocidade da reação enzimática apesar do seu equilíbrio já é bem definido.