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Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2022-02-22T12:36:44Z No. of bitstreams: 1 PDF - Isabela Motta Felício.pdf: 1225450 bytes, checksum: d36e7e458695173b20597b71e7dcccfb (MD5) Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2022-02-22T14:00:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Isabela Motta Felício.pdf: 1225450 bytes, checksum: d36e7e458695173b20597b71e7dcccfb (MD5) Made available in DSpace on 2022-02-22T14:01:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Isabela Motta Felício.pdf: 1225450 bytes, checksum: d36e7e458695173b20597b71e7dcccfb (MD5) Previous issue date: 2020-03-04 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES In recent decades, microbial resistance has become a serious risk to public health, a phenomenon resulting from the indiscriminate use of antibiotic antibiotics by health institutions, the population, in agriculture and agriculture, or by gene recombination or mutation between species. With bacterial resistance, food pathogens are a major concern for the food industry, consumers and safety authorities. The use of bioactive products derived from secondary metabolism of vegetables is a viable alternative, as is the case of Carvacrol oil (CV), a phenolic monoterpene with proven antimicrobial activity. However, characteristics, such as its hydrophobia, oxidation facility, instability in the presence of light, heat and humidity, can limit its application as a food additive. With this, the use of emulsified systems, such as nanoemulsions (NEs) appear as an alternative, in order to increase the stability of these compounds and increase their solubility. Furthermore, the choice of nanoemulsified systems as antimicrobial agents is important, as they interact with microbial cell membranes, causing them to stop growing. Thus, the objective of this work was the development, characterization and evaluation of the antimicrobial activity against the bacteria Staphylococcus aureus UFPEDA02, Escherichia coli UFPEDA224, Pseudomonas aeruginosa UFPEDA416, Salmonella enteritidis ATCC13076 and Salmonella typhimurium ATCC14028 of a NE containing CV. To obtain a stable NE, a study of HLB identification of the CV by the microemultocrit method was first carried out, so at the end an HLB value of 11 was found for the CV used in this study. Then, a study was carried out to obtain a NE with greater stability, for that, it varied the proportions of CV (3 and 5%), surfactants (a mixture of Tween 80® and Span 80®) (2, 5 and 9%) and water (86, 88, 90, 92 and 95%). From the prepared NEs, just the one with 3% oil, 9% surfactant and 88% water (NECV) remained stable for up to 90 days. The high energy emulsification methodology was used to obtain the systems, where the NEs went through four cycles of homogenization in the sonicator and ultrasound bath. The amount of oil in the NECV system was performed using analytical methodology developed in the UV-VIS spectrophotometer, which obtained an encapsulation efficiency of 99.45% ± 0.019 (equivalent to 2.98 mg CV per mL of NE). Then, it was characterized as for the macroscopic aspect, presenting liquid aspect with white color. During the 90 days, no creaming formation or phase separation was observed, which NECV remained with an expected average droplet size (D90 = 164.5 ± 0.69 nm), PDI (D90 = 0.118 ± 0.024), zeta potential (D90 = -14.6 ± 0.529 mV) and pH (D90 = 5.52 ± 0.011). After this, the antibacterial activity of the isolated compound and the nanoemulsified system was evaluated by the microdilution method, in which Rezasurin was used as a visual indicator of cellular metabolism. In terms of antibacterial activity, NECV (MIC: 256 µg / mL for E. coli and Samonella spp., 128 µg / mL for S. aureus and P. aeruginosa) obtained a better result when compared to the free compound against strains S. aureus, P. aeruginosa and S. typhimurium. Furthermore, there was a bactericidal effect against E. coli, P. aeruginosa and Salmonella spp. The results obtained indicated that NECV can be incorporated as a food additive to prevent and control microbial growth. Nas últimas décadas, a resistência microbiana frente aos antibacterianos tornou-se um sério risco a saúde coletiva, fenômeno esse decorrente do uso indiscriminado de antibióticos antibióticos por instituições de saúde, população, na agropecuária e na agricultura, ou de recombinação gênica ou mutação entre as espécies Com a resistência bacteriana patógenos alimentares são uma grande preocupação para a indústria de alimentos, consumidores e autoridades de segurança. O uso de bioativos derivados de metabolismo secundário dos vegetais correspondem uma alternativa viável, como é o caso do óleo de Carvacrol (CV), um monoterpeno fenólico com atividade antimicrobiana comprovada. No entanto, características, como sua hidrofobia, facilidade de oxidação, instabilidade na presença de luz, calor e umidade, podem limitar sua aplicação como aditivo alimentar. Com isso, o uso de sistemas emulsionados, como as nanoemulsão (NEs) surgem como uma alternativa, afim de aumentar a estabilidade desses compostos e aumentar sua solubilidade. Além do mais, a escolha de sistemas nanoemulsionados como agentes antimicrobianos é importante, pois esses interagem com as membranas das células microbianas, fazendo com que interrompa o crescimento das mesmas. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi o desenvolvimento, caracterização e avaliação da atividade antimicrobiana frente as bactérias Staphylococcus aureus UFPEDA02, Escherichia coli UFPEDA224, Pseudomonas aeruginosa UFPEDA416, Salmonella enteritidis ATCC13076 e Salmonella typhimurium ATCC14028 de uma NE contendo CV. Para obtenção de uma NE estável, primeiramente foi realizado um estudo de identificação de HLB do CV pelo método de microemultócrito, assim ao final encontrou-se um valor de HLB de 11 para o CV empregado neste estudo. Em seguida, foi realizado um estudo para se obter uma NE com uma maior estabilidade, para isso variou-se as proporções de CV (3 e 5%), surfactantes (uma mistura de Tween 80® e Span 80®) (2, 5 e 9%) e água (86, 88, 90, 92 e 95%). Das NEs preparadas, apenas a com 3% de óleo, 9% de surfactante e 88% de água (NECV) permaneceu estável por até 90 dias. A metodologia de alta energia de emulsificação foi utilizada para obtenção dos sistemas, onde as NEs passaram por quatro ciclos de homogeneização no aparelho de sonicação e banho de ultrassom. A quantidade de óleo no sistema NECV foi realizada utilizando metodologia analítica desenvolvida no espectrofotômetro de UV-VIS, a qual obteve uma eficiência de encapsulação de 99,45% ± 0, 019 (equivalente a 2,98 mg de CV por mL de NE). Em seguida, foi caracterizado quanto ao aspecto macroscópico, apresentando aspecto líquido com cor branca. Durante os 90 dias, não foi observada formação de cremação ou separação de fases, na qual a NECV se manteve com um tamanho médio de gotícula (D90 = 164.5 ±0.69 nm), PDI (D90 = 0.118 ± 0.024), potencial zeta (D90 = -14.6 ± 0.529 mV) e pH (D90 = 5.52 ± 0.011) esperado. Posteriormente, foi avaliada a atividade antibacteriana do composto isolado e do sistema nanoemulsionado pelo método da microdiluição, na qual foi usado a Rezasurina como indicador visual de metabolismo celular. Da atividade antibacteriana, a NECV (CIM: 256 µg / mL para E. coli e Samonella spp., 128 µg / mL para S. aureus e P. aeruginosa) obteve melhor resultado quando comparado ao composto livre frente as linhagens S. aureus, P. aeruginosa e S. typhimurium. Além disso, houve efeito bactericida contra E. coli, P. aeruginosa e Salmonella spp. Os resultados obtidos indicaram que a NECV pode ser incorporada como aditivo alimentar para prevenir e controlar o crescimento microbiano.

Coalho cheese is a semi-hard cheese typically produced in the Northeast region of Brazil using an enzymatic coagulating agent and mesophilic lactic acid starter cultures. Some physicochemical characteristics of this product, such as low acidity, high moisture and pH, may favor the survival and growth de pathogenic bacteria frequently associated to food outbreaks. Increasing concerns about the safety of cheeses, have led to the development of alternative preservation techniques using naturally derived ingredients as essential oils (EOs) to ensure the microbiological quality of these products. EO from Origanum vulgare L. (oregano – OVEO) has recognized inhibitory effects against pathogenic bacteria associated to cheeses, however, there is a lack of information regarding the effects of OVEO toward lactic acid bacteria used as starter cultures in processing of these products. Considering these aspects, with the present study aimed to evaluate the effects of OVEO on the cell viabilities of strains Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes, well as of strains Lactococcus spp. used in the processing of coalho cheese. These effects were measured by determination of minimum inhibitory concentration (MIC) of OVEO in microdilution in broth and assessing the viability of pathogenic and starter strains in cheese based broth containing OVEO (0.60 μL.mL-1, 1.25 μL.mL-1, 2.5 μL.mL-1 e 5 μL.mL-1) at 37 °C, 24 h and in semi-solid coalho cheese (0.60 μL.g-1, 1.25 μL.g-1 e 2.5 μL.g-1) at 10 °C during 72 h. The major constituents of OVEO, identified by gas chromatography coupled to mass spectrometry GC-MS were carvacrol (69,0%) and thymol (14.12%). MIC of OVEO was 2.5 μL.mL-1 against both S. aureus and L. monocytogenes and 0.6 μL.mL-1 against the tested starter co-culture. Assays in cheese-based broth containing OVEO at 0.6 μL.mL-1 revealed no decrease in viable cell counts of both pathogenic bacteria, while the starter co-culture decreased 1.0 CFU.mL-1 after 24 h of exposure compared with the initial viable counts. OVEO at 1.25 μL.mL-1 and 2.5 μL.mL-1 caused reductions of up to 2.0 log CFU.mL-1 and 2.5 log CFU.mL-1 in S. aureus and L. monocytogenes, respectively. At these same concentrations, OVEO severely affected the cell viability of the starter co-culture following a short period of exposure. Higher concentrations of OVEO were required to decrease the viable cell counts of all target bacteria in the semi-solid coalho cheese model compared to cheese-based broth. Over the assessed time points, viable cell counts of Lactococcus spp. in coalho cheese containing OVEO were lower than those of S. aureus and L. monocytogenes. These results suggest that the concentrations of OVEO used to control pathogenic bacteria in semi-hard cheese could be carefully evaluated because of their possible inhibitory effects on the growth and survival of starter lactic acid culture used during the production of this product. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES O queijo de coalho é um queijo semiduro tipicamente produzido na região Nordeste do Brasil, obtido a partir de agentes enzimáticos coagulantes e/ou pelo uso de bactérias ácido láticas. Algumas características físico-químicas deste produto, como baixa acidez, alta umidade e pH, podem favorecer a sobrevivência e/ou crescimento de bactérias patogênicas associados a surtos alimentares. Crescentes preocupações sobre a conservação de queijos, têm direcionado o desenvolvimento de técnicas de conservação a partir da utilização de ingredientes de origem natural, como óleos essenciais (OEs) para garantir a qualidade microbiológica deste produto. OE de Origanum vulgare L. (orégano - OEOV), possui efeito inibitório reconhecido contra diversas bactérias patogênicas associadas a queijos, no entanto, não existem informações sobre o seu efeito frente as bactérias ácido láticas utilizadas como fermentos no processamento desse produto. Considerando estes aspectos, com o presente estudo objetivou-se avaliar os efeitos do OEOV sobre a viabilidade celular de cepas de Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes, bem como de cepas de Lactococcus spp. utilizadas no processamento de queijo de coalho. Estes efeitos foram medidos pela determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) do OEOV em microdiluição em caldo, avaliação da viabilidade das cepas patogênicas e bactérias ácido láticas em caldo base queijo contendo OEOV (0,60 μL.mL-1, 1,25 μL.mL-1, 2,5 μL.mL-1 e 5 μL.mL-1) a 37 °C por 24 h e em queijo de coalho semissólido (0,60 μL.g-1, 1,25 μL.g-1 e 2,5 μL.g-1) a 10 °C ao longo de 72 h. Os constituintes majoritários do OEOV identificados por Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa (CG-MS), foram carvacrol (69,0%) e timol (14,12%). A CIM do OEOV foi de 2,5 μL.mL-1 frente S. aureus e L. monocytogenes e de 0,6 μL.mL-1 frente Lactococcus lactis subsp. lactis e subsp. cremoris em co-cultura. Nos ensaios em caldo base queijo contendo OEOV a 0,60 μL.mL-1, não ocorreu redução na contagem de células viáveis das bactérias patogênicas. Enquanto que observou-se uma diminuição de 1,0 log UFC.mL-1, nas contagens de células viáveis da co-cultura lática em comparação ao inóculo inicial, após 24 h de exposição. O OEOV a 1,25 μL.mL-1 e 2,5 μL.mL-1 causou redução de até 2,0 log UFC.mL-1 e 2,5 log UFC.mL-1 para S. aureus e L. monocytogenes, respectivamente. Nas mesmas concentrações, após um curto período de exposição o OEOV causou redução brusca na contagem de células viáveis da co-cultura lática. Elevadas concentrações do OEOV foram requeridas para a redução na contagem de células viáveis de todas as bactérias no queijo de coalho semissólido comparado com o caldo base queijo. Ao longo dos tempos avaliados, as contagens de células viáveis de Lactococcus spp. no queijo de coalho contendo OEOV foram menores que as contagens de células viáveis de S. aureus e L. monocytogenes. Os resultados sugerem que concentrações de OEOV usado para controlar bactérias patogênicas em queijo de coalho, devem ser cuidadosamente avaliadas, devido aos seus possíveis efeitos inibitórios sobre o crescimento e sobrevivência das bactérias ácido láticas utilizadas no processamento deste produto.

Coalho cheese is obtained by enzymatic coagulation by the action of renin or specific enzymes, as well as using starter lactic acid bacteria (LAB) cultures that positively contribute to organoleptic aspects of the product. Some physicochemical characteristics of this cheese, as high moisture and pH, favor the growth of pathogenic bacteria frequently associated to outbreaks, such as Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes. The development of these pathogens in coalho cheese could be avoided by the adding of synthetic additives, however the growing interest of consumers for natural foods, free or containing low levels of chemical additives, have led the research of natural compounds with antimicrobial properties that can be used in food industry. The essential oil from Thymus vulgaris L. (TVEO), popularly known as thyme, possesses recognized antimicrobial activity against pathogenic bacteria, however there is no information about its effect on bacteria of technological interest, such as starter lactic acid cultures, used cheese manufacture. Considering these aspects, this study was performed to evaluate the inhibitory effect of TVEO on Lactococcus strains commonly used in coalho cheese processing as well as on pathogenic strains S. aureus and L. monocytogenes. For this, the values of minimum inhibitory concentration (MIC) of TVEO were determined against the test strains and the effects of TVEO on bacterial cell viability were assessed in cheese-based broth and in cheese samples. The main constituents of TVEO identified by CG-MS, were thymol (43.19%) and p-cymene (28.55%). The MIC value MIC of TVEO was 2.5 μL/mL against S. aureus and L. monocytogenes, and 1.25 μL/mL against L. lactis subsp. lactis and L. lactis subsp. cremoris in co-culture. In the assays in cheese-based broth containing TVEO at 1.25 μL/mL after 24 h, a decrease of approximately 1 log CFU/mL in the viable cell counts of L. monocytogenes and Lactococcus spp. was observed. At the same concentration, the TVEO presented no inhibitory effects on the growth of S. aureus. Only when TVEO was incorporated in growth media at 5 μL/mL viable cell counts of S. aureus and L. monocytogenes presented a sharp decrease over time, showing kill-time curves shape similar to that obtained when starter co-culture was exposed to TVEO at 2.5 μL/mL. TVEO at 5 μL/mL decrease 2 log CFU/mL the viable cell counts of the starter co-culture after 12 h of exposure. In the assays with coalho cheese added of TVEO at 1.25 μL/g no reduction in viable cells counts of co-culture or pathogenic bacteria was observed. However, OETV at 2.5 μL/g caused a decrease in viable cell counts of all tested bacteria tested after 72 h of exposure, varying from 0.3 to 1.0 log CFU/g. The results suggest that TVEO concentrations required to control pathogenic bacteria in coalho cheese should be carefully considered, since they can have negative effects on the growth and survival of lactic bacteria of the lactic fermentum. O queijo de coalho é obtido por coagulação enzimática através da ação da renina ou enzimas específicas, assim como pelo uso de culturas de bactérias ácido-lácticas (BAL) iniciadoras, que contribuem positivamente para os aspectos organolépticos deste produto. Algumas características físico-químicas desse tipo de queijo, como elevada umidade e pH, favorecem o crescimento de bactérias patogênicas, frequentemente associadas a surtos alimentares, como Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes. O desenvolvimento destes patógenos no queijo coalho pode ser evitado pela adição de antimicrobianos sintéticos; entretanto, o crescente interesse dos consumidores por alimentos mais naturais, livres ou com baixos níveis de aditivos químicos, tem direcionado as pesquisas sobre compostos naturais com propriedades antimicrobianas que possam ser usados na indústria de alimentos. O óleo essencial de Thymus vulgaris L. (OETV), popularmente conhecido como tomilho, tem atividade antimicrobiana reconhecida contra bactérias patogênicas, porém não existem informações sobre seu efeito sobre bactérias de interesse tecnológico, como culturas lácticas iniciadoras, utilizadas no processamento de queijos. Considerando tais aspectos, o presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar o efeito inibitório do OETV sobre cepas de Lactococcus frequentemente utilizadas no processamento de queijo de coalho, bem como sobre cepas das bactérias patogênicas S. aureus e L. monocytogenes. Para isso, foram determinados os valores da concentração inibitória mínima (CIM) do OETV, e os efeitos do OETV sobre a viabilidade das células bacterianas foram determinados em caldo base-queijo e em amostras de queijo de coalho. Os principais constituintes do OETV, identificados por CG-MS, foram timol (43,19%) e p-cimeno (28,55%). O valor da CIM de OETV foi de 2,5 μL/mL frente a S. aureus e L. monocytogenes, e de 1,25 μL/mL contra a L. lactis subsp. lactis e L. lactis subsp. cremoris em co-cultura. Nos ensaios em caldo base-queijo contendo OETV na concentração de 1,25 μL/mL, após 24 h, foi observada uma queda de aproximadamente 1 log UFC/mL nas contagens de células viáveis de L. monocytogenes e de Lactococcus spp. Na mesma concentração, o OETV não apresentou efeito inibitório sobre o crescimento de S. aureus. Somente nos ensaios com o OETV a 5 μL/mL, a contagem de células viáveis de S. aureus e L. monocytogenes apresentou um decréscimo acentuado ao longo do tempo, com as curvas de tempo de morte semelhante àquela obtida para a co-cultura láctea quando exposta ao OETV a 2,5 μL/mL. O OETV a 5 μL/mL provocou uma forte diminuição no número de células viáveis da co-cultura láctica, com contagens de 2 log UFC/mL após 12 h de exposição. Nos ensaios com o queijo de coalho adicionado de OETV a 1,25 μL/g não houve redução na contagem de células viáveis da co-cultura láctica ou das bactérias patogênicas ensaiadas. Porém, a concentração 2,5 μL/g, o OETV provocou uma redução na contagem de células viáveis de todas as bactérias ensaiadas ao longo de 72h de exposição, que variou de 0,3-1,0 log UFC/g. Os resultados sugerem que as concentrações de OETV necessárias para controlar bactérias patogênicas em queijo de coalho devem ser cuidadosamente consideradas, pois podem apresentar efeitos negativos sobre o crescimento e sobrevivência das bactérias que compõem o fermento láctico.