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Orientadora: Profa. Dra. Chirlei Glienke Coorientadora: Dra Daiani C. Savi Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 26/03/2019 Inclui referências: p. 52-60 Resumo: O bioma Pantanal é caracterizado pela inundação sazonal que ocorre periodicamente, gerando um ecossistema específico. Este bioma abriga espécies que tem capacidade para tolerar as mudanças drásticas que ocorrem na concentração de água, durante os períodos de seca e cheia. Entre as espécies de plantas adaptadas a estas condições está a planta medicinal Vochysia divergens Pohl. Esta planta é amplamente utilizada na medicina popular, pela produção de substâncias bioativas e tem se apresentado promissora para a prospecção de microrganismos endofíticos. Neste sentido, isolados obtidos da planta medicinal V. divergens apresentaram potencial antimicrobiano contra o fungo fitopatogênico Phyllosticta citricarpa, em estudo prévio. Estes isolados foram inicialmente identificados como pertencentes à família Xylariaceae, família que passou por revisão taxonômica nos últimos dois anos, e assim vários gêneros pertencentes a essa família foram recentemente realocados para a família Hypoxylaceae. O presente trabalho tem como objetivo caracterizar morfologicamente e filogeneticamente isolados endofíticos da planta V. divergens presentes na coleção de cultura, anteriormente classificados como pertencendo a família Xylariacea. E ainda, avaliar o potencial biotecnológico dos mesmos frente a microrganismos de interesse clínico e agronômico. Com base em análise multigênica, todos os isolados anteriormente classificados como pertencendo a família Xylariaceae foram caracterizados como pertencentes a família Hypoxylaceae. O isolado CMRP686 foi identificado como Daldinia placentiformis e os isolados CMRP681, CMRP683, CMRP685 como Hypoxylon griseobrunneum. Além dessas espécies, o isolado CMRP688 foi descrito como uma nova espécie, Hypoxylon vochysiae, espécie irmã de H. griseobrunneum, ambos pertencentes ao clado HY-6, de acordo com revisão taxonômica recente da família. Os extratos produzidos a partir desses isolados apresentaram atividade antimicrobiana inibindo o crescimento de patógenos clínicos e de fungos fitopatogênicos. Resultados promissores foram obtidos com extrato produzido a partir do cultivo da linhagem D. placentiformis CMRP686, que inibiu o desenvolvimento da bactéria Stenotrophomonas maltophilia, com halo de inibição de crescimento de 17 mm, e no teste de CIM as menores concentrações foram obtidas por diferentes extratos testados contra Acinetobacter baumannii. Já contra os fungos fitopatogênicos, o extrato com maior atividade foi produzido a partir da linhagem CMRP688 (Hypoxylon vochysiae), que inibiu o crescimento micelial de Phyllosticta citricarpa em 54%. Contudo, todos os isolados apresentaram atividade antimicrobiana, a qual foi dependente da linhagem e do meio de cultura utilizado para a produção dos metabólitos secundários. Desta forma, representando linhagens promissoras para futuros estudos químicos e biológicos, no intuito de otimizar e potencializar o uso de microrganismos endofíticos na indústria agronômica e farmacêutica. Abstract: The Pantanal biome is characterized by seasonal flooding that occurs periodically, generating a specific ecosystem. This biome is home to species able to tolerate the drastic changes that occur in the concentration of water during periods of drought and flood. Among the species of plants adapted to these conditions is the medicinal plant Vochysia divergens Pohl. This plant is widely used in folk medicine for the production of bioactive substances and has been promising for the prospecting of endophytic microorganisms. In this sense, isolates of the medicinal plant V. divergens presented antimicrobial potential against the phytopathogenic fungus Phyllosticta citricarpa, in a previous study. These isolates were initially identified as belonging to the family Xylariaceae, a family that underwent taxonomic revision in the last two years and, therefore, several genera of this family were recently relocated to the family Hypoxylaceae. The present study aims to characterize morphologically and phylogenetically the endophytic isolates of the V. divergens present in the culture collection, previously classified as belonging to the family Xylariacea. And another to evaluate the biotechnological potential of extracts produced by these isolates in the treatment and control of microorganisms of clinical and agronomic interest. Based on the multigenic analysis, all isolates were identified as belonging to the family Hypoxylaceae. CMRP686 isolate was identified as Daldinia placentiformis and isolates CMRP681, CMRP683, CMRP685 as Hypoxylon griseobrunneum. In addition to these species, CMRP688 isolate was described as a new species, Hypoxylon vochysiae, sister species of H. griseobrunneum, both belonging to the HY-6 clade, according to the recent taxonomic review of the family. The extracts produced from these isolates presented antimicrobial activity inhibiting the growth of clinical pathogens and phytopathogenic fungi. The best result was observed with the extract of D. placentiformis CMRP686, which inhibited the development of the bacterium Stenotrophomonas maltophilia with the largest inhibition zone (17 mm), and in the CIM test the lowest concentrations were obtained by different extracts tested against Acinetobacter baumannii. Regarding the activity against phytopathogenic fungi, the best result was CMRP688 (Hypoxylon vochysiae), which inhibited the mycelial growth of Phyllosticta citricarpa by 54%. However, all the isolates presented antimicrobial activity, dependent on the strain and the culture medium used for the production of the secondary metabolites. In this way, it represents promising strains for future chemical and biological studies, in order to optimize and potentiate the use of endophytic microorganisms in the agronomic and pharmaceutical industries

Orientadora : Profª. Drª. Chirlei Glienke Coorientadora : Prof. Dr. Holger Bruno Deising Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 30/05/2017 Inclui referências e anexos Bibliografia: f. 91-100 Resumo: O Brasil destaca-se por ser o terceiro maior produtor mundial de milho, entretanto, apesar desta alta produtividade, esta cultura é afetada por um grande número de doenças. Estas doenças acarretam em perdas na produção, sendo a antracnose uma das doenças fúngicas com maior relevância, de distribuição mundial. O fungo responsável pela antracnose é o Colletotrichum graminicola. Em estudos funcionais de genes associados a virulência e patogenicidade nesta espécie, foi demonstrado que o processo de penetração na planta é atenuado em transformantes com mutação ou deleção dos genes allantoicase e/ou urease (MÜNCH et al, 2011, GLIENKE et al, 2015). Com base nesses trabalhos sugere-se que as enzimas allantoicase e urease são importantes para os estágios iniciais do processo de infecção no hospedeiro por C. graminicola. A fim de determinar em que estágio do desenvolvimento do fungo e onde essas enzimas celulares atuam neste fitopatógeno, foram obtidos e analisados mutantes de C. graminicola para os genes urease e allantoicase (ALA1:eGFP e URE1:eGFP), os quais apresentam fusão dos genes alvo com o gene repórter eGFP. Os mutantes foram caracterizados, sendo selecionados somente aqueles que apresentavam cópia única do cassete inserido no local correto e fluorescência em microscopia. Todos os mutantes apresentando essas características, assim como três ectópicos referentes a cada transformação foram avaliados quanto aos sintomas produzidos em folhas de milho destacadas, localização subcelular através do gene repórter, quanto ao crescimento em meio de cultura com restrição de nitrogênio, bem como a atividade das enzimas urease e allantoicase. Com base nos resultados de microscopia de fluorescência, sugere-se que as enzimas urease e allantoicase estão presentes principalmente no citoplasma de esporos de C. graminicola antes da germinação e formação de apressório, sendo que a fluorescência é fortemente reduzida nos estágios iniciais do processo de infecção, ou seja, em tubos germinativos, em hifas de penetração e biotróficas. Nenhuma fluorescência foi observada em hifas necrotróficas do fungo. Palavras-chave: Zea mays, Colletotrichum graminicola, eGFP, urease, allantoicase. Abstract: Brazil is the third largest producer of maize in the world, however despite this productivity, the culture is affected by a large number of diseases, which lead to losses in production. Anthracnose is one of the main fungal diseases and has a worldwide distribution. The fungus responsible for the anthracnose disease is Colletotrichum graminicola. In functional studies of genes associated with virulence and pathogenicity processes in this specie, it has been shown that the plant penetration process is attenuated in transformants with mutation or deletion of allantoicase and/or urease genes (GLIENKE et al, 2015; MÜNCH et al, 2011). Based on these studies, it is suggested that the enzymes allantoicase and urease are important to the initial penetration stages for C. graminicola. To determine the development stage and the cellular location these enzymes act in this pathogen, the objective was to obtain and analyze C. graminicola mutants (ALA1:eGFP and URE1:eGFP) with fusion of the target genes, allantoicase and urease, with the reporter gene eGFP. The mutants were characterized and only those which presented a single copy of the construct in the right position and fluorescence in microscopy were selected. All the selected mutants and three ectopics for each gene were evaluated by produced symptoms in detached maize leaves, cellular localization through the reporter gene, ability to grow in nitrogen limitation medium, as well as the enzymes activity for urease and allantoicase gene. Based on the results, we conclude that the enzymes urease and allantoicase are present mainly in the cytoplasm of the C. graminicola conidia before germination and appressoria formation, the fluorescence is severely reduced in the initial stage of infection, i.e. in germ tube and biotrophic and penetration hyphae. No fluorescence was observed in necrotrophic hyphae of C. graminicola. Keywordse: Zea mays, Colletotrichum graminicola, eGFP, urease, allantoicase.

Orientadora : Profª Drª Chirlei Glienke Coorientadora : Profª Drª Daiani C. Savi Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 27/04/2017 Inclui referências : f. 71-77 Resumo: O Pantanal é uma planície de inundação periódica detentora de uma biodiversidade singular, e possui diversas plantas com conhecimento tradicional associado às suas propriedades medicinais. Entre estas, a planta Vochysia divergens, conhecida como Cambará, é utilizada em tratamentos de resfriados, tosse, febre e pneumonia, e se mostra promissora para a prospecção de microrganismos. Dos quais os endófitos isolados de plantas medicinais têm sido associados a uma ampla gama de metabólitos secundários com atividade biológica. Neste contexto, o presente trabalho objetivou o isolamento e a bioprospecção de actinomicetos endofíticos da planta medicinal V. divergens. Um total de 10 isolados obtidos foram identificados por meio do sequenciamento parcial do gene 16S rRNA e análise morfológica, como Aeromicrobium ponti, Williamsia serinedens, Streptomyces thermocarboxydus, Microbacterium sp., Sphaerisporangium sp., Micrococcus sp., Microbispora sp. e Actinomadura sp.. Afim de selecionar a melhor condição de cultivo para produção de metabólitos secundários, foram avaliadas duas condições diferentes de meio de cultura e temperatura. Todas as condições utilizadas resultaram na produção de metabólitos com atividade biológica, porém os melhores resultados foram no cultivo em caldo SG (Soja e glucose) a 36°C. Nestas condições, o extrato a partir da fermentação da linhagem Aeromicrobium ponti (LGMB491) apresentou atividade contra Staphylococcus aureus sensível à meticilina (MSSA) e S. aureus resistente à meticilina (MRSA), com CIM de 0,02mg/mL e 0,04mg/mL, respectivamente. O extrato oriundo da linhagem Microbacterium sp. (LGMB471) apresentou inibição total do crescimento micelial do fitopatógeno Phyllosticta citricarpa com CIM de 0,16mg/mL. Neste estudo, o conhecimento da comunidade endofítica da planta medicinal V. divergens foi ampliado por meio do isolamento de novos gêneros associados a esta planta, alguns deles isolados pela primeira vez como endófitos. Palavras chaves: Vochysia divergens. Pantanal. Actinomicetos endofíticos. MRSA. Abstract: The Pantanal is a periodic flood plain with a unique biodiversity, and has several plants with traditional knowledge associated with its medicinal properties. The plant Vochysia divergens, known as Cambará, is used for treatment of colds, cough, fever and pneumonia, and is very promising for microorganisms' prospection. Endophytic microorganisms isolated from medicinal plants have been studied due to the production of a wide range of secondary metabolites with biological activity. In this context, the present work aimed at the isolation and bioprospection of endophytic actinomycetes from medicinal plant V. divergens. Ten strains of endophytic actinomycetes were identified by partial 16S rRNA gene sequencing and morphological analysis, as belonging to Aeromicrobium ponti, Williamsia serinedens, Streptomyces thermocarboxydus, Microbacterium sp., Sphaerisporangium sp., Micrococcus sp., Microbispora sp. and Actinomadura sp. In order to select the best culture conditions for production of secondary metabolites, two different culture media and two temperatures were evaluated. All the conditions used resulted in the production of metabolites with biological activity, but the best conditions are cultivation in SG broth at 36°C. In these conditions, the extract from the fermentation of Aeromicrobium ponti (LGMB491) showed high activity against methicillin-sensitive Staphylococcus aureus (MSSA) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA), with MIC of 0.02mg/mL and 0.04mg/mL, respectively. The extract from the Microbacterium sp. (LGMB471) showed total inhibition of the mycelial growth of phytopathogen Phyllosticta citricarpa with MIC of 0.16mg/mL. In this study, we broadened the knowledge about the endophytic community of the medicinal plant V. divergens through the isolation of rare actinomycetes, some of them isolated for the first time as endophytes. Key-words: Vochysia divergens. Pantanal. Endophitics actinomycetes. MRSA.

Orientadora : Profª Drª Chirlei Glienke Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 22/09/2015 Inclui referências : f.52-57;59-67 Área de concentração Resumo: A reprodução sexual em fungos é controlada pelos genes mating type presentes no locus MAT, que é representado por dois idiomorfos - MAT1-1 e MAT1-2. Em espécies heterotálicas há a presença exclusiva de um dos dois idiomorfos, necessitando o encontro de linhagens com mating types opostos para que ocorra a reprodução sexuada. Em contrapartida, espécies homotálicas possuem ambos os idiomorfos em seu genoma, conferindo a esses indivíduos a capacidade de se reproduzir sem necessariamente precisarem de um parceiro compatível. Nesse trabalho nós investigamos a estrutura do locus MAT em Phyllosticta citricarpa, o agente causal da Mancha Preta dos Citros (MPC). Essa doença causa lesões em frutos e folhas de plantas de citros, onde podem ser encontrados esporos assexuados do fungo (picnidiósporos), enquanto que os esporos sexuados (ascósporos), que são a principal fonte de dispersão da doença em campo, são encontrados em folhas caídas em estado de decomposição no solo. Apesar de intensivo estudo, seu ciclo sexual nunca foi observado em cultura pura in vitro. Através da análise das sequências genômicas de dois isolados de P. citricarpa, foi identificado o gene da DNA lyase e, como previamente descrito na literatura, os genes mating type estavam localizados na região flanqueadora 3' desse gene. Os resultados evidenciam que esse fungo é heterotálico devido à presença exclusiva de MAT1-1 ou MAT1-2 em linhagens distintas. A fim de caracterizar o locus MAT, foram desenhados primers para amplificação dessa região. Com base nesses resultados foi demonstrado que P. citricarpa possui cópias completas e aparentemente funcionais dos genes mating type, contendo os domínios de alta mobilidade (High Mobility Group - HMG) e alpha box, presentes em diferentes isolados. Além dos genes MAT1-1-1 e MAT1-2-1, foram localizados os genes MAT1-1-4 na região flanqueadora 5' do gene MAT1-1-1 e o gene MAT1-2-5, localizado na região flanqueadora 5' do gene MAT1-2-1. Um protocolo de PCR multiplex foi desenvolvido para diferenciar os idiomorfos de P. citricarpa, podendo ser utilizado em estudos de distribuição e incidência de genes mating type, a fim de determinar a ocorrência de reprodução sexual e facilitar estudos de cruzamento in vivo e in vitro. Palavras-chave: Phyllosticta citricarpa, Mancha Preta dos Citros, reprodução sexual, genes mating type. Abstract: Sexual reproduction in fungi is controlled by mating type genes located at the MAT locus, which is represented by two idiomorphs - MAT1-1 and MAT1-2. In heterothallic species there is the presence of only one of the two idiomorphs, requiring the encounter of opposite mating types strains to occur sexual reproduction. In contrast, homothallic species have both idiomorphs in its genome, giving these individuals the ability to reproduce without necessarily requiring a compatible partner. In this study, we investigated the structure of this locus in the phytopathogenic fungus Phyllosticta citricarpa, the epidemiological agent of citrus black spot (CBS) disease. This disease causes lesions on fruits and leaves of citrus plants, where can be found asexual spores of the fungus (picnidiospores), while sexual spores (ascospores), which are the major source of spreading the infection in the field, are found in fallen leaves in state of decomposition. Despite intensive study, its sexual state has never been observed in single-spore culture. Through analysis of the genome sequences of two individual P. citricarpa isolates, the sequence of the DNA lyase gene was identified and, as previously reported in the literature, the mating type genes were located in the 3' flanking region of this gene. The results suggested that P. citricarpa is heterothallic (self-sterile), owing to the exclusive presence of the MAT1-1 or MAT1-2 gene in individual strains. In order to characterize the MAT locus, we designed primers to amplify this region. Based on this analysis, P. citricarpa was found to have complete and apparently functional copies of MAT genes, containing ?-1 and HMG domains, present in different isolates. In addition to MAT1-2-1 and MAT1-1-1 genes, the MAT1-1-4 gene was located in the 5' flanking region of the MAT1-1-1 gene and the MAT1-2-5 gene was located in 5' flanking region of the MAT1-2-1 gene. A multiplex PCR protocol was also developed to differentiate P. citricarpa idiomorphs, which can be used in distribution and incidence studies of mating type strains, in order to determine the occurrence of sexual reproduction and to facility crossing studies in vitro and in vivo. Keywords: Phyllosticta citricarpa, Citrus Black Spot, sexual reproduction, mating type genes.

Orientadora : Profª. Drª. Chirlei Glienke Coorientador : Prof. Dr. Fabricio Packer Gonçalves Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 28/03/2014 Inclui referências : f. 42-44;61-63;67-71 Resumo: A Mancha Preta dos Citros (MPC) é uma doença que ameaça a Citricultura brasileira, causando lesões em frutos e sua queda prematura em estágios mais severos, levando a prejuízos de produção e rejeição no mercado consumidor. É causada pelo fungo Phyllosticta citricarpa, presente em folhas caídas em decomposição na forma sexuada (ascósporos) e nas lesões dos frutos, em folhas aderidas à planta e ramos secos na forma assexuada (picnidiósporos). O uso de fungicidas sistêmicos ainda é a principal alternativa de controle, mas se depara com os principais problemas do seu uso excessivo como toxicidade ambiental, acúmulo de resíduos nos frutos e seleção de patógenos resistentes. A busca por um controle alternativo pode envolver microrganismos endofíticos de plantas medicinais, uma vez que é conhecido seu potencial biotecnológico e poder protetor da planta hospedeira, mas depende do conhecimento do ciclo infeccioso do patógeno sob vários aspectos. Sabe-se da importância do manejo de ramos secos no controle da doença mas pouco se conhece sobre a participação dos ramos na epidemiologia da MPC. Técnicas tradicionais de isolamento em meio de cultura juntamente com ensaios moleculares têm agilizado o diagnóstico de doenças, oferecendo dados importantes sobre vários patosistemas. Adicionalmente, o uso de microrganismos transformados geneticamente para expressão de uma proteína repórter, como a green fluorescente protein (gfp), trazem uma nova ferramenta para o monitoramento desses microrganismos e entendimento do seu ciclo infeccioso. No presente estudo foram avaliados 128 ramos de área de alta incidência da MPC, pertencentes a quatro estados fenológicos: novo, jovem, velho e seco. O isolamento destes tecidos revelou 1,6% de amostras positivas para P. citricarpa, apenas em tecidos de estado fenológico velho, enquanto a extração de DNA direto dos tecidos seguido de PCR espécie específico não revelou a presença do patógeno. Foi avaliada a sobrevivência do fungo patogênico em ramos de citros destacados, pela inoculação de suspensão conidial da linhagem transformante LGMF06-T2 (gfp) de P. citricarpa. Foi possível recuperar o fungo inoculado dos tecidos após 45 dias da sua inoculação, não sendo recuperado após 90 e 135 dias. A espécie inoculada foi confirmada por microscopia de fluorescência, e este resultado sugere a sobrevivência do patógeno nos ramos por pelo menos 45 dias. Adicionalmente, foi avaliado o efeito do extrato metabólico do fungo endofítico Diaporthe terebinthifolii sobre a formação de picnídios de P. citricarpa em ramos autoclavados. Fragmentos de 1 cm de ramos autoclavados foram depositados sobre meio ágar-agua e em suas laterais foram inoculados fragmentos miceliais do patógeno. Comparou-se o crescimento micelial e formação de picnídios nos ramos tratados com o extrato do fungo endofítico com relação aos ramos não tratados e ramos tratados com fungicida comercial. Observou-se que o extrato reduz a formação de picnídios comparativamente ao controle negativo, apresentando efeito similar ao promovido pelo fungicida. Tais resultados confirmam o potencial do extrato do fungo D. terebinthifolii no controle do patógeno P. citricarpa. Palavras-chave: Mancha Preta dos Citros, Phyllosticta citricarpa, endófitos, controle alternativo Abstract: The Citrus Black Spot (CBS) is a threat to the Brazilian Citrus, causing fruit lesions and premature fruit drop in more severe cases, leading to yield losses and fruit rejection in the consumer market. CBS is caused by the fungus Phyllosticta citricarpa, which ascospores are the sexual stage, found in decomposing fallen leaves, and picnidiospores are the asexual stage, present in fruit lesions, attached leaves and dried branches. Systemic fungicides are the main control alternative, but its overuse causes problems like the environmental toxicity, residues accumulation in fruits and also the selection of resistant pathogens. The search of an alternative disease control method may involve endophytic microorganisms of medicinal plants, due to their biotechnological potential and protective power of the host plant, but it is important to know about the infectious cycle of the pathogen. We know the importance of handling dry branches for CBS control but there is a lack of information about this pathosystem, mainly about the influence of branches in the disease epidemiology. The use of traditional isolation techniques coupled with molecular techniques have enhanced the diagnosis of diseases, providing important data on the interaction between the plant and the pathogen. Additionally, the use of genetically transformed microorganisms for the expression of a reporter protein, such as green fluorescent protein (GFP) brings a new tool to understand the pathogen infectious cycle. In the present study, we evaluated 128 branches in area of high incidence of CBS, belonging to four growth stages: new, young, old and dried. The isolation of these tissues showed 1.6% of samples with the presence of P. citricarpa, only in branches in old growth stages, while the method used for DNA extraction and PCR directly from the branches tissue did not reveal the pathogen. We also evaluated the fungus survival in detached citrus branches by inoculating a conidial solution of the LGMF06-T2 transformed strain expressing the green fluorescent protein (GFP). The pathogen was reisolated from the branches after 45 days of inoculation, with the gfp strain confirmed by fluorescence microscopy. These findings suggests that the pathogen can survive in branches for at least 45 days. Additionally, we evaluated the control effect of metabolic extract of the endophytic fungus Diaporthe terebinthifolii over micelial growth and pycnidia formation of P. citricarpa in autoclaved branches. Branches fragments (1 cm) were placed on water agar media and mycelium fragments of the pathogen were inoculated on its sides. It was evaluated the micelial growth and pycnidia formation on the branches treated with the the endophytic fungus extract, compared with non-treated branches and branches treated with commercial fungicide. The extract treatment reduced the formation of pycnidia compared to the non-treated branches, and its inhibition was similar to the fungicide treatment. These findings confirm the potential of D. terebinthifolii extract in the control of P. citricarpa. Keywords: Citrus Black Spot, Phyllosticta citricarpa, epidemiology, disease control, endophytes, alternative control

Orientadora : Profª Drª Vanessa Kava Coorientadora : Profª Drª Chirlei Glienke Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 28/11/2014 Inclui referências : f.65-69;85-90;113-115;118-122 Área de concentração : Genética Resumo: A Mancha Preta dos Citros (MPC) é uma doença que causa lesões nas principais variedades de frutos cítricos e, em casos mais severos, causa sua queda prematura, levando a prejuízos de produção e perdas no mercado consumidor. É causada pelo fungo Phyllosticta citricarpa, cujos esporos são encontrados em folhas aderidas à planta e em lesões nos frutos na forma assexuada (picnidiósporos), e na forma sexuada (ascósporos) em folhas em decomposição no solo. Neste trabalho foram investigados os mecanismos que desencadeiam o ciclo sexual em diferentes isolados de Phyllosticta citricarpa, obtidos de diferentes regiões geográficas e de diferentes hospedeiros, buscando reconhecer sistemas de compatibilidade existentes. Testes de compatibilidade em variadas condições descritas na literatura e em outras condições propostas neste estudo foram realizados com 165 isolados de Phyllosticta. Algumas condições ensaiadas, previamente descritas na literatura, mostraram-se inadequadas para ensaios de compatibilidade entre diferentes isolados de P. citricarpa. Estruturas semelhantes a corpos de frutificação imaturos foram observadas na zona de encontro entre os isolados LGMF 76 e 114, porém não foram obtidos ascósporos. Na produção de ascósporos estão envolvidos os genes mating type (MAT) que regulam o desenvolvimento da reação sexual. Estes genes foram identificados após o desenho de primers específicos para esta espécie, com o objetivo de caracterizar este importante fitopatógeno quanto à dinâmica de recombinação possível em campo. Dos 148 isolados investigados, 21,62% apresentaram o gene MAT 1-1-1, 78,38% o gene MAT1-2-1. Considerando que os ascósporos, desempenham um papel importante no ciclo da Mancha Preta dos Citros, condições de produção e liberação destes esporos foram recriadas em laboratório com o desenvolvimento de caixas com temperatura, ventilação e umidade controlada, onde plantas axênicas desenvolvidas a partir do embrião de sementes de citros e livres de microrganismos foram utilizadas. Ainda, aspectos da colonização dos frutos pelo fitopatógeno foram investigados, avaliando-se a relação entre o crescimento, colonização de folhas e produção de picnídios frente aos principais terpenos produzidos na casca dos frutos cítricos e que comprovadamente exercem um papel no processo de atração de pragas e patógenos. Em todos os testes realizados foi possível detectar que os terpenos influenciam de diferentes formas o crescimento e a produção de picnídios de P. citricarpa. Este pode ser mais um passo no entendimento do mecanismo de interação entre planta-patógeno, podendo se tornar uma futura forma de controle dessa doença. Palavras - chave: Mancha Preta dos Citros, Phyllosticta citricarpa, mating type, terpenos, interação planta-patógeno Abstract: The citrus black spot (CBS) is a disease that causes lesions on the main varieties of citrus fruits and, in more severe cases, causes its premature drop, leading to production and consumer market losses. It is caused by the fungus Phyllosticta citricarpa, whose spores are found over leafs attached to the plant and in the lesions of fruits in the asexual form (pycnidiospores), and in the sexual form (ascospores) in decomposing leafs in the soil. The present study investigated the mechanisms that trigger the sexual cycle in different isolates of Phyllosticta citricarpa, obtained from different geographic regions and different hosts, seeking to recognize existing compatibility systems. Compatibility tests on various conditions described in the literature and in other conditions proposed in this study were performed with 165 Phyllosticta isolates. Some conditions tested, previously described in the literature, have proved inadequate for testing compatibility between different isolates of P. citricicarpa. Structures similar to immature fruiting bodies were observed in the area of contact between the isolates LGMF 76 and 114, however ascospores were not obtained. The production of ascospores involves the mating type (MAT) genes which regulate the development of sexual response. These genes were identified after drawing primers specific for this species, with the objective of characterizing this important phytopathogen regarding the dynamics of possible field recombination. Of the 148 isolates investigated, 21.62% presented the MAT 1-1-1 gene and 78.38% the MAT1-2-1 gene. Considering that the ascospores play an important role in the citrus black spot cycle, production conditions and release of these spores were recreated in the laboratory with the development of boxes with controlled temperature, ventilation and humidity, where axenic plants grown from the embryo of citrus seeds and free from microorganisms were utilized. Still, aspects of colonization of the fruit by the phytopathogen were investigated by evaluating the relationship among growth, leaf colonization and production of pycnidia front of the main terpenes produced in the peel of citrus fruits and proven to play a role in the process of attraction of pests and pathogens. In all tests conducted it was possible to detect that the terpenes influence in different ways the growth and production of P. citricarpa pycnidia. This can be another step in the understanding of the mechanism of interaction between plant-pathogen, and may become a future way of controlling this disease. Key - words: citrus black spot, Phyllosticta citricarpa, mating type, terpenes, plant-pathogen interaction

Orientadora : Drª Chirlei Glienke Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 30/09/2014 Inclui referências : f. 69-84 Área de concentração Resumo: O considerável aumento das infecções fúngicas causadas por agentes oportunistas conferiu significativa importância a estas patologias nos últimos anos. Os principais fatores associados a esta patologia se relacionam a alterações na resposta imunológica do paciente. Entre os fungos oportunistas destacam-se as leveduras do gênero Candida, que possuem distintos mecanismos de virulência e expressiva variabilidade genética. O tratamento da candidíase tornou-se um grande desafio diante do aumento da resistência destas leveduras e o pequeno número de drogas disponíveis para terapêutica. Entre os distintos mecanismos de resistência das leveduras Candida spp, destacam-se as bombas de efluxo e as alterações mutacionais no gene ERG11. Neste contexto, foi realizada a investigação do polimorfismo no gene ERG11 de isolados de leveduras Candida spp e a correlação com o padrão de suscetibilidade ao antifúngico fluconazol. Para tanto, foram isolados 120 leveduras da saliva de pacientes diabéticos, transplantados renais e pessoas saudáveis, totalizando 190 idividuos. Foram realizados testes de suscetibilidade por meio do E-test®, segundo o documento M44-A2 (CLSI), para determinação da concentração inibitória mínima (CIM) ao Fluconazol. Para a identificação das espécies Candida spp amplificou-se por PCR, fragmentos do gene 28S do rDNA e da região ITS1-5.8S-ITS2 rDNA. Para a análise do polimorfismo do gene ERG11, amplificou-se fragmentos utilizando-se primers específicos para cada espécie de Candida spp. Os resultados encontrados demonstram que os pacientes diabéticos foram os mais colonizados por leveduras, com 68,75% de isolamento, seguidos dos transplantados com 51,35%. A espécie Candida albicans foi a espécie mais isolada, compondo 66,7% dos isolados, pertencentes a seis grupos populacionais. As mutações no gene ERG11 foram 82,8% (121) sinônimas e 17,1% (25) de sentido trocado, identificadas como F105L, D116E, K119N e S137L em C. albicans, e T224C e G263A em C. tropicalis. As mutações encontradas no gene ERG11 não influenciaram no padrão de suscetibilidade ao fluconazol. Desta forma, os pacientes diabéticos foram os mais colonizados por leveduras, sendo C. albicans a espécie mais frequente e a que apresentou maior diversidade genética. O polimorfismo encontrado nos fragmentos do gene ERG11 não provocou diminuição no padrão de suscetibilidade dos isolados frente ao antifúngo fluconazol. PALAVRAS-CHAVE: Transplantados; C. albicans; Fluconazol; ERG11. Abstract: ISOLATED OF Candida FROM DIABETIC AND RENAL TRANSPLANTED PATIENTS: ANALYSIS PHYLOGENETIC, FLUCONAZOL RESISTANCE, AND GENE ERG11 POLYMORPHISM The considerable increase in fungal infections caused by opportunistic agents attributed significant importance to these infections in recent years. The main factors associated with this disease are related to changes in the patient's immune response. Among the opportunistic fungi are the yeasts of the genus Candida, which have different mechanisms of virulence and a high genetic variability. The treatment of candidiasis has become a major challenge before the increased resistance these yeasts and the small number of drugs available for treatment. Among the various resistance mechanisms of yeast Candida spp, we highlight the efflux pumps and mutational changes in the ERG11 gene. In this context, the research was conducted the polymorphisms in ERG11 gene isolated from yeast Candida spp and correlates with the susceptibility to Fluconazole. For this, 120 yeasts saliva of diabetic patients, kidney transplant recipients and healthy individuals were isolated. Susceptibility testing by the E-Test® were performed, according to the document M44-A2 (CLSI) for determination of MIC to Fluconazole. For the identification of the species Candida spp, fragments of 28S rDNA gene and regions ITS1-5.8S-ITS2 of the rDNA gene were amplified by PCR. For the analysis of polymorphism of ERG11 gene, fragments using specific primers for each species of Candida spp were amplified. The results demonstrate that diabetic patients were the most colonized by yeast, with 68.75% of isolation, followed by transplanted with 51.35%. The species Candida albicans was the most frequent species, making up 66.7% of the isolated belonging to six population groups. Mutations in ERG11 gene were 82.8% (121) silent and 17.1% (25) changed direction, identified as F105L, D116E, K119N and S137L in C. Albicans, and T224C and G263A in C. tropicalis. The mutations found in the ERG11 gene did not influence the pattern of susceptibility to Fluconazole. It was demonstrated that diabetic patients were the most colonized by yeasts, being C. albicans the most frequent kind and the one which had the greatest phylogenetic variation. The polymorphisms found in the gene fragments ERG11 did not caused decrease in the isolated front susceptibility to antifungal fluconazole standard. KEYWORDS: Transplanted; C. albicans; Fluconazol; ERG11.

Os projetos com espécies nativas dependem da disponibilidade de sementes e mudas nas quantidades requeridas e com a qualidade apropriada. O mercado contudo, não oferece sementes de inúmeras espécies, e para muitas inexistem estudos visando conhecer a estrutura genética das populações naturais, informação indispensável para formação de lotes de sementes com qualidade genética, entre as quais o vassourão-branco (Piptocarpha angustifolia Dúsen ex Malme). O vassourão-branco é comum nas clareiras, capoeirões e no estrato secundário da floresta com Araucária. Além das aptidões madeireiras e para recuperação ambiental, apresenta potencial para compor sistemas silvipastoris. Os objetivos deste trabalho foram: adaptar protocolo para a extração de DNA genômico; quantificar a variabilidade genética intra e inter populacional e estabelecer critérios para a seleção das árvores-matrizes, com base na genotipagem, para coleta de sementes em populações naturais de vassourão-branco. As árvores amostradas de vassourão-branco, das quais foram coletadas folhas para extração do DNA genômico, estão localizadas em fragmentos florestais em Curitiba e São José dos Pinhais (PR) e Rio Negrinho (SC). Para extração do DNA genômico foram utilizadas duas folhas com tecido jovem, pesando aproximadamente dois gramas, que foram maceradas em almofariz após adição de nitrogênio líquido. A extração do DNA getiômico das folhas do vassourão-branco, foi eficiente com qualidade e nas quantidades requeridas para execução da metodologia da PCR-RAPD. As dissimilaridades genéticas entre as populações de Rio Negrinho (SC) e Curitiba (PR) e entre São José dos Pinhais (PR) e Rio Negrinho (SC) foi moderada, contudo entre Curitiba e São José dos Pinhais (PR) foi grande. A correlação entre a distância geográfica e dissimilaridade genética entre as populações foi baixa. A maior parte da variabilidade genética encontra-se dentro das populações que apresentam-se estruturadas. A seleção dos indivíduos para coleta de sementes deve pressupor a obtenção da maior dissimilaridade possível, objetivando maior variabilidade genética no lote de sementes. As árvores mais dissimilares geneticamente dos agrupamentos devem ser consideradas, pela contribuição para obtenção da maior variabilidade genética do lote de sementes

Orientadora : Profª Drª Vanessa Kava-Cordeiro Co-orientadora : Profª Drª Chirlei Glienke Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 30/05/2012 Inclui referências Área de concentração Resumo: A citricultura brasileira é responsável por grande parte da produção mundial de citros. Entre as doenças que acometem a produção destaca-se a Mancha Preta dos Citros (MPC). Esta patologia vegetal de difícil controle é provocada pelo fungo Phyllosticta citricarpa (McAlpine) Van der Aa. Apesar de não deteriorar o conteúdo interno, o patógeno induz o aparecimento de lesões na casca do fruto, o que acarreta recusa para o comércio in natura e em casos mais severos promove a queda prematura dos frutos, reduzindo a produtividade. Restrições fitossanitárias impostas pelos países importadores acarretam a rejeição de cargas inteiras de frutos com sintomas, ocasionando grandes prejuízos aos países produtores. Devido aos problemas ambientais e de saúde, muitos fungicidas utilizados na agricultura vem sendo removidos do mercado, o que cria uma necessidade da substituição alternativa destes agroquímicos para o controle de pragas e patógenos. Neste contexto, a utilização de microrganismos no controle biológico e na bioprospecção de produtos naturais aparece como uma ciência promissora. Microrganismos endofíticos tem se destacado pelo crescente número de novos compostos bioativos obtidos a partir do seu estudo. O uso de microrganismos endofíticos isolados de citros com ação antagônica a P. citricarpa possui oportuno potencial na bioprospecção de compostos para o controle da MPC. Fungos endofíticos de citros foram testados em laboratório quanto ao antagonismo à P. citricarpa. De 68 morfotipos isolados, 6 apresentaram-se promissores em teste de cultura pareada. Em teste de metabólitos voláteis, o isolado LGMF1254 apresentou os melhores resultados. Este fungo foi capaz de causar inibição no diâmetro de colônia de P. citricarpa em 60%, pela produção de metabólitos voláteis. Os voláteis deste fungo também inibiram em 100% a formação de picnídios do fitopatógeno em ensaio com folhas cítricas. Em testes com frutos cítricos em condições controladas, os voláteis não inibiram o aparecimento de lesões em frutos oriundos de regiões com alta incidência da doença. Por outro lado, em teste com indução de lesões em frutos cítricos em condições controladas, houve diminuição em 26% no diâmetro médio das lesões de MPC. Tal resultado é de grande importância uma vez que a exposição de frutos pós-colheita a um composto volátil é de fácil operacionalização, especialmente em frutos destinados a exportação. Este é o primeiro relato de um composto volátil produzido por um fungo endofítico de citros com ação antagonista a Phyllosticta citricarpa. Palavras chave: Phyllosticta citricarpa, metabólitos voláteis, Mancha Preta dos Citros, antagonismo Abstract: The Brazilian citrus industry is responsible for much of the world production of citrus. Among the diseases affecting this production, there is the Citrus Black Spot (CBS). This plant pathology, which is difficult to control, is caused by the fungus Phyllosticta citricarpa (McAlpine) Van der Aa. Although there is no damage in the internal contents, the pathogen induces the appearance of lesions on the fruit skin, which leads to refusal to trade in natura, and in severe cases promotes the premature fall of fruit, reducing productivity. Phytosanitary restrictions imposed by importing countries lead to the rejection of entire loads of fruit with symptoms, causing great losses to producing countries. Due to environmental and health problems, many fungicides used in agriculture have been removed from the market, which generates a necessity of alternative replacement of chemicals to control pests and pathogens. In this context, the use of microorganisms for the biological control and biopanning of natural products appears as a promising science. Endophytic microorganisms have been highlighted by the growing number of new bioactive compounds obtained from these studies. The use of endophytic microorganisms isolated from citrus with antagonistic action against P. citricarpa has appropriate potential of biopanning of the compounds for the control of the CBS. Endophytic fungi isolated from citrus were tested in the laboratory on the antagonism to P. citricarpa. Of 68 endophytic fungi isolated from citrus, 6 showed to be promising in paired culture test. In test of volatile metabolites, the isolate LGMF1254 showed the best results. This fungus was able to cause inhibition in colony diameter of P. citricarpa by 60%, by the production of volatile metabolites. The volatiles of this fungus also inhibited by 100% the formation of pycnidia of the pathogen in citrus leaves essays. In tests with citrus fruit under controlled conditions, the volatiles did not inhibit the appearance of lesions on fruit from regions with high incidence of the disease. On the other hand, in test with lesion induction in citrus under controlled conditions there was 26% decrease of mean diameter of lesions of the CBS. This result is of great importance, since the exposure of postharvest the volatile compound is an easy operation, particularly in fruit intended for export. This is the first report of an endophytic fungal volatile compound with the antagonist action against Phyllosticta citricarpa. Keywords: Phyllosticta citricarpa, volatile compounds, Citrus Black Spot, antagonism

Orientadores : Profª Drª Chirlei Glienke, PhD Pedro Crous Co-orientadora : Profª Drª Vanessa Kava Cordeiro Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 31/07/2012 Inclui referências Área de concentração : Genética Resumo: Espécies do gênero Diaporthe (Phomopsis) têm sido descritas em uma ampla gama de hospedeiros como fitopatogênicas, endofíticas, saprofíticas e recentemente foram descritas causando problemas de saúde em humanos e outros mamíferos. Esse trabalho teve como objetivo reavaliar o gênero Diaporthe através de análise taxonômica e filogenética e esclarecer a taxonomia de Diaporthe endofíticos com potencial antagonista contra Phyllosticta citricarpa agente causal da Mancha Preta dos Citros. No presente estudo nós investigamos 243 isolados usando dados de sequências de DNA em multilocus. Foram selecionados dentre nove genes os cinco melhores para resolução taxonômica. As regiões gênicas selecionadas, região espaçadora interna transcrita do rDNA (ITS1, 5.8S, ITS2), regiões parciais dos genes fator 1-alfa de elongação da tradução (TEF1), beta-tubulina (TUB), histona H3 (HIS) e calmodulina (CAL), resolveram 95 clados. Quinze novas espécies foram descritas, Diaporthe arengae, D. brasiliensis, D. endophytica, D. hongkongensis, D. inconspicua, D. infecunda, D. mayteni, D. neoarctii, D. oxe, D. paranensis, D. pseudomangiferae, D. pseudophoenicicola, D. raonikayaporum, D. schini and D. Terebinthifolii, Quatorze novas combinações foram introduzidas em Diaporthe e a espécie D. anacardii foi epitipificada. A taxonomia de Diaporthe endófitos das plantas medicinais Spondias mombin, Schinus terebinthifolius, Aspidosperma tomentosun e Maytenus ilicifolia com potencial antagonista contra P. citricarpa foi esclarecida. Embora as espécies de Diaporthe no passado tenham sido identificadas principalmente com base na associação com o hospedeiro, os resultados deste estudo confirmam que o mesmo táxon pode estar associado a diferentes hospedeiros, o que sugere que eles se movem livremente entre os mesmos. Em contrapartida, alguns patógenos de plantas e endofíticos parecem ser estritamente restritos a determinado hospedeiro. Devido ao comportamento de diversidade ecológica entre os membros do gênero Diaporthe, esse trabalho sugere que descrições de novas espécies ocorram apenas quando empregados dados moleculares. Abstract: Species in the genus Diaporthe (Phomopsis) have been reported as plant pathogens, non-pathogenic endophytes or saprobes from a wide range of hosts and have also been recently reported as the cause of health problems in humans and other mamals. The current study aimed to resolve the taxonomy and phylogeny of a large collection of Diaporthe species occurring on diverse hosts, either as pathogens, saprobes, or as harmless endophytes, including endophytic Diaporthe with antagonistic potentials against the Phyllosticta citricicarpa the causative agent for Citrus Black Spot. In the present study we investigated 243 isolates using multilocus DNA sequence data. Nine genes were evaluated and the five best have been selected for taxonomic resolution. The selected gene regions were the rDNA internal transcribed spacer (ITS1, 5.8S, ITS2) region, and partial translation elongation factor 1-alpha (TEF1), beta-tubulin (TUB), histone H3 (HIS) and calmodulin (CAL) genes resolved 95 clades. Fifteen new species are described, namely Diaporthe arengae, D. brasiliensis, D. endophytica, D. hongkongensis, D. inconspicua, D. infecunda, D. mayteni, D. neoarctii, D. oxe, D. paranensis, D. pseudomangiferae, D. pseudophoenicicola, D. raonikayaporum, D. schini and D. terebinthifolii. A further 14 new combinations are introduced in Diaporthe, and D. anacardii is epitypified. The taxonomy of endophyte Diaporthe from the medicinal plants Aspidosperma tomentosun, Maytenus ilicifolia, Spondias mombin and Schinus terebinthifolius, with antagonistic potential against P. citricicarpa was clarified. Although species of Diaporthe have in the past chiefly been distinguished based on host association, results of this study confirm several taxa to have wide host ranges, suggesting that they move freely among hosts, frequently co-colonising diseased or dead tissue. In contrast, some plant pathogenic and endophytic taxa appear to be strictly host specific. Given this diverse ecological behaviour among members of Diaporthe, the current study suggests that new species descriptions should only happen when there is molecular data.

Resumo: A bioprospecção de plantas medicinais e microrganismos endofíticos constitui uma atividade promissora na pesquisa e detecção de novos compostos com atividades biológicas de interesse na área da saúde e na área agronômica. Croton urucurana Baill (Euphobiaceae) é uma planta amplamente utilizada na medicina tradicional em países como Brasil, Paraguai e Uruguai. Entre as várias propriedades medicinais atribuídas à planta, destaca-se seu uso para tratar doenças de etiologia infecciosa. No presente trabalho foi avaliada a atividade antibacteriana e antifúngica de diferentes extratos de C. urucurana contra as bactérias gram positivas Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis e Streptococcus mutans, bactérias gram negativas Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa e contra os fungos filamentosos Microsporum gypseum, Fonsecaea monophora e Guignardia citricarpa. Devido ao fato de que nos últimos anos vários trabalhos vêm demonstrando a importância dos microrganismos endofíticos de plantas medicinais como fontes de compostos bioativos, neste trabalho também se realizou a bioprospecção de fungos endofíticos isolados da planta. Avaliou-se o potencial antibacteriano e antifúngico como também a capacidade de produção de compostos bioativos em diferentes meios de cultura desses microrganismos. Em relação à atividade da planta, comparando a atividade antimicrobiana de extratos brutos da folha e casca do caule, este último demonstrou maior atividade. As bactérias mais sensíveis a esse extrato foram P. aeruginosa (CIM: 0,1 mg/mL) e S. aureus (CIM: 0,5 mg/mL). Nenhuma das frações demonstrou uma atividade maior que a do extrato bruto, devido provavelmente a atividade do extrato ser produzida por um sinergismo entre vários princípios ativos. Porém, notou-se que as frações mais polares foram as mais ativas. Para selecionar os fungos endofíticos com maior potencial antimicrobiano foi realizado o teste de antagonismo de 27 isolados endofíticos contra os fungos G. citricarpa e F. monophora. Também foi realizada uma triagem de atividade antibacteriana contra bactérias gram positivas e gramnegativas. Seis isolados foram selecionados para a produção de metabólitos em diferentes meios de cultura: meios líquidos, malte e milho, e meios sólidos arroz e milho. Os extratos obtidos apresentaram diferentes graus de atividade antimicrobiana. A análise dos extratos mais ativos da planta, através de cromatografia em camada delgada demonstrou a presença de metabólitos da classe dos polifenóis. Em relação aos extratos dos endofíticos, o perfil cromatográfico variou bastante em função do fungo e meio de cultura utilizado. O extrato do isolado endofítico FCU 055 Epicoccum sp cultivado em meio sólido milho demonstrou uma interessante atividade antimicrobiana contra G. citricarpa e P. aeruginosa.