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CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A descoberta dos vírus gigantes levou à quebra de paradigmas no campo da virologia devido ao tamanho das partículas desses vírus e pela sua complexidade genômica e estrutural. Na última década, a busca por novos vírus gigantes foi intensificada levando a descoberta dos marseillevírus, faustovírus, kaumoebavírus e tupanvírus. Visto a necessidade de elucidar características biológicas e moleculares desses vírus que ainda permanecem sem resposta, esse trabalho teve como objetivo fazer a predição e análise de motivos promotores em vírus da família Marseilleviridae, em faustovírus e kaumoebavírus e a caracterização do efeito citopático do tupanvírus em Acanthamoeba castellanii. A predição e análise de motivos promotores levou a primeira caracterização de um octâmero (AAATATTT) que pode atuar como promotor em vírus da família Marseilleviridae. A distribuição e localização do motivo em relação ao códon de iniciação seguiu um padrão semelhante ao demonstrado para outros promotores descritos entre os membros que compõem o NCLDV. Além disso, a relevância biológica do octâmero predito foi demonstrada e a presença de repetições desse motivo nas regiões intergênicas do genoma de marseillevírus foi associada à elevada capacidade dos marseillevírus de adquirir genes por transferência gênica lateral contribuindo para explicar o seu mosaicismo e plasticidade genômica. Já a busca de motivos promotores em faustovírus e kaumoebavírus revelou que esses vírus compartilham em abundância as mesmas sequências promotoras (TATTT e TATATA) previamente descritas em vírus da família Asfarviridae. Foi demonstrado que os motivos preditos estão presentes em mais de 65% das regiões a montante dos genes compartilhados entre faustovírus, kaumoebavírus e asfarvírus reforçando a relação filogenética entre estes vírus. Além da regulação dos processos transcricionais, um importante desafio para os vírus na natureza é a busca por células hospedeiras. Nesse contexto nós realizamos uma caracterização detalhada do efeito citopático desenvolvido por tupanvírus em cultura de Acanthamoeba castellanii o que levou a descrição de um novo tipo de interação vírus-hospedeiro. Foi demonstrado que a infecção por tupanvírus é capaz de induzir a expressão de um gene que codifica uma proteína ligadora de manose viral e celular sugerindo a importância dessa proteína no ciclo de multiplicação do tupanvírus. Curiosamente, a adição de manose livre durante a multiplicação de tupanvírus levou não só a supressão do aumento do nível de transcritos dos genes da proteína ligadora de manose viral e celular como a inibição da formação do cacho de uma maneira concentração dependente, sugerindo que a formação de cachos correlaciona com a expressão dos genes que codifica a proteína ligadora de manose tanto viral quanto celular. Finalmente, nós demonstramos que os cachos formados durante a multiplicação de tupanvírus são capazes de interagir com células não infectadas contribuindo para a disseminação viral. The discovery of giant viruses led to the breakdown of paradigms in virology field due virus particle size and genomic and structural complexity. In the last decade, the search for new giant viruses intensified leading to the discovery of marseillevirus, faustovirus, kaumoebavirus and tupanvirus. In order to elucidate the biological and molecular informations of these viruses that remain unclear, this work aimed to predict and analyze the promoter motifs in Marseilleviridae family viruses, in faustovirus and kaumoebavirus, further to characterize the cytopathic effect of tupanvirus in Acanthamoeba castellanii. The analysis of promoter motifs led to the first characterization of an octamer (AAATATTT) that can act as a promoter in the Marseilleviridae family. The distribution and localization of the motif relative to the start codon followed a pattern similar to that demonstrated for other promoters described among NCLDV members. In addition, the biological relevance of the predicted octamer was demonstrated and the motifs repetitions in intergenic regions of the marseillevirus genome was associated with the high ability of the marseillevirus to acquire genes by lateral gene transfer contributing to explain their mosaicism and genomic plasticity. The search for promoter motifs in faustovirus and kaumoebavirus revealed that these viruses share in abundance the same promoter sequences (TATTT and TATATA), as previously described in viruses of the Asfarviridae family. It has been demonstrated that the predicted motifs are present in more than 65% of the genes shared among faustovirus, kaumoebavirus and asfarvirus, reinforcing the phylogenetic relationship between these viruses. In addition to the regulation of transcriptional processes, an important challenge for viruses in nature is the search for host cells. In this context, we performed a detailed characterization of the cytopathic effect of tupanvirus in the culture of Acanthamoeba castellanii, which led to the description of a new type of virus-host interaction involving the tupanvirus. Tupanvirus infection has been shown to be capable of inducing the expression of genes encoding a viral and cellular mannose binding protein (MBP), suggesting the importance of the MBP in tupanvirus multiplication cycle. Interestingly the presence of mannose led not only to suppression of the increase in transcripts level of the viral and cellular MBP genes, but also led to the inhibition of amoebal-bunches formation at a concentration dependent, suggesting that the bunches formation correlates with the expression of the viral and cellular MBP genes. Finally, we demonstrate that the amoebal-bunches formed during multiplication of tupanviruses are able to interact with uninfected cells contributing to viral spread.

O Vaccinia virus (VACV) desempenhou um importante papel para a humanidade devido ao seu uso durante a campanha de erradicação da varíola. Além disso, atualmente o VACV tem sido amplamente utilizado no desenvolvimento de vacinas recombinantes. Com o fim da campanha de vacinação da varíola, outros Orthopoxvirus têm emergido em todo o mundo, tais como Cowpox virus, Monkeypox virus e VACV. VACV é o agente etiológico da vaccínia bovina (VB), uma zoonose emergente que tem sido associada a problemas econômicos, sociais, veterinários e de saúde pública, principalmente no Brasil. Apesar da importância atual e histórica do VACV, há poucas informações sobre sua circulação, prevalência, origem e manutenção no ambiente, assim como reservatórios naturais e diversidade. Os VACV brasileiros (VACV-BR) são separados em dois grupos com base na diversidade genética e biológica: grupo 1 (G1) e grupo 2 (G2). Os vírus do G2 apresentam placas de lise de maior tamanho e são altamente virulentos em modelo murino Balb/c, ao contrário dos vírus do G1. Além disso, polimorfismos demonstrados em genes de VACV, tais como A56R, A26L e C23L, têm sido utilizados em estudos filogenéticos confirmando a dicotomia entre os vírus do G1 e G2 de VACV-BR. Neste estudo, foi investigada a diversidade clonal de amostras de campo coletadas durante surtos de VB. Os resultados demonstram que clones do G1 de VACV-BR foram mais frequentemente isolados. A análise molecular e biológica corroborou estudos anteriores, confirmando a cocirculação de duas linhagens de VACV no Brasil. Além disso, foi possível detectar a cocirculação das duas variantes (G1 e G2) na mesma amostra. Dois clones apresentaram um perfil misto, apresentando características de ambos os grupos, com base na análise molecular dos genes A56R, A26L e C23L, talvez como resultado do aumento da taxa de recombinação em uma população mista. Algumas mutações, bem como inserções e deleções em sequências de nucleotídeos do gene A56R foram observadas entre clones da mesma amostra. Estes resultados fornecem informações sobre o perfil de diversidade entre clones de VACV circulando no Brasil. Vaccinia virus (VACV) played an important role for humanity because of its use during the smallpox eradication campaign. Furthermore, currently VACV has been widely used as a vector of the recombinant vaccines. Following smallpox eradication, other orthopoxviruses have emerged worldwide, such as Cowpox virus, Monkeypox virus and VACV. VACV is the etiologic agent of the bovine vaccinia (BV), an emerging zoonosis that has been associated with economic, social, veterinary and public health issues, mainly in Brazil. Despite the current and historical VACV importance, there is little information about its circulation, prevalence, origins and maintenance in the environment, natural reservoirs and diversity. Brazilian VACV (VACV-BR) are grouped into two groups, based on genetic and biological diversity: group 1 (G1) and group 2 (G2). G2 strains displays higher plaque sizes and are virulent to mice, unlike G1. Moreover, polymorphisms observed in VACV genes, such as A56R, A26L and C23L genes, have been used in phylogenetic studies and further confirmed the dichotomy between G1 and G2 VACV-BR. In this study, was investigated VACV clonal diversity from field samples, during BV outbreaks. The results demonstrated that the G1 VACV-BR viruses were more frequently isolated. Molecular and biological analysis corroborated previous reports and confirmed the co-circulation of two VACV-BR lineages. Furthermore, it was co-detect the two variants (G1 and G2) in a same sample. Two clones showed a mosaic profile, with both G1 and G2 features based on the molecular analysis of A56R, A26L and C23L genes, maybe as a result of an increased recombination rate in a mixed population. Indeed, some single nucleotide polymorphism (SNPs) and insertions and deletions (INDELs) in A56R nucleotide sequences were observed among clones of a given virus population. These results provide information about the diversity profile in VACV clones.