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Tir é uma proteína efetora intrinsecamente desordenada (IDP) de Escherichia coli Enteropatogénica (EPEC) e Enterohemorrágica (EHEC) que é translocada para o interior do hospedeiro. Na região C-terminal (C-Tir), este efetor mimetiza quatro motivos, conhecidos como ITIMs, que contêm tirosinas (Y454, Y474, Y483, Y511) que são fosforiladas por cinases do hospedeiro. Os padrões de fosforilação resultantes são reconhecidos por uma série de proteínas do hospedeiro que desencadeiam mudanças na sinalização e nos processos celulares do mesmo. Destas proteínas, destaca-se a fosfatase SHP-1, essencial em vias de sinalização de resposta imunitária. Nesta dissertação propusemos clarificar os aspetos moleculares da interação entre C-Tir e o domínio C-SH2 de SHP-1 e perceber como molecularmente a fosforilação molda essa interação. Através da espetroscopia de RMN, foi realizada a reatribuição das ressonâncias da versão fosforilada de C-Tir e foram analisadas as propensões de estruturas secundárias. Este estudo permitiu a identificação de regiões com tendência para hélices-α, localizadas em zonas conhecidas por interagir com proteínas do hospedeiro. A fosforilação é descrita como um requisito para a interação entre C-Tir e SHP-1. Contudo, os ensaios de interação realizados entre as duas proteínas pré-fosforilação sugerem que a mesma pode ocorrer intrinsecamente, através da região ITIM, que compreende Y511, identificada como uma região com preponderância para estrutura hélice-α. Foi monitorizada a cinética e a extensão da fosforilação das quatro tirosinas, demonstrando que todas são fosforiladas simultaneamente, com Y454 a ser a mais rápida e Y483 a ser a mais lenta. Além disso, foi verificado que C-Tir fosforilada interage com o domínio C-SH2, através das quatro regiões ITIM. A região ITIM que contém Y454, cuja fosforilação é mais rápida, é a que apresenta menos afinidade para C-SH2, comparativamente com as restantes que apresentam afinidades semelhantes entre elas. Este trabalho abre caminho para novos estudos sobre os mecanismos de virulência com implicações na saúde e na doença. Tir is an intrinsically disordered protein (IDP) from Enteropathogenic (EPEC) and Enterohemorrhagic (EHEC) Escherichia coli that is translocated into the host. In its C-terminal region (C-Tir), this effector mimics four motifs, commonly known as ITIMs, containing tyrosine residues (Y454, Y474, Y483, Y511) that are phosphorylated by host kinases. The resulting phosphorylation patterns are recognized by various host proteins that trigger changes in signaling and host cellular processes. Among these proteins is SHP-1 phosphatase, an essential protein in signaling pathways of the immune response. In this thesis, we proposed clarifying the molecular aspects of the interaction between C-Tir and the C-SH2 domain of SHP-1 and understanding how phosphorylation shapes this interaction. Using NMR spectroscopy, we reassigned the backbone NMR resonances of the phosphorylated version of C-Tir and analyzed its secondary structural propensities. This study allowed us to identify regions with a tendency for helical structures located at sites known to interact with host proteins. Phosphorylation seems to be essential for the interaction between Tir and SHP-1. However, binding assays between the two proteins pre-phosphorylation suggests that it can occur intrinsically through the ITIM region comprising Y511, identified to adopt a partial-folded α-helix We also monitored the kinetics and the extension of the phosphorylation reaction of the four tyrosines in the ITIM regions. In doing so, we found that the four positions are phosphorylated simultaneously, with Y454 being the fastest and Y483 being the slowest. Moreover, we showed that phosphorylated C-Tir interacts with the C-SH2 via its four ITIMs. The ITIM region containing Y454, whose phosphorylation is faster, is the one with a lower affinity for the C-SH2, than the others with similar binding strengths. This work paves the way for further studies to understand virulence mechanisms with implications for health and disease.

Orientador: Prof. Dr. David Corrêa Martins Júnior Tese (Doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Neurociência e Cognição, Santo André, 2021. O Transtorno do Espectro da Esquizofrenia (SCZ) é caracterizado por ser um transtorno complexo e multifatorial. Variantes genéticas raras - ou seja, variantes com uma frequência do menor alelo < 1% na população e variantes comuns tem contribuição para o SCZ. Por outro lado, a herdabilidade do SCZ varia de 50-80%, indicando que fatores epigenéticos exercem um papel fundamental. O SCZ apresenta um claro dimorfismo sexual: ela costuma ser diagnosticada em homens durante a adolescência - e em mulheres de forma tardia, a partir dos 25 anos. Desta forma, a integração de dados que abordam tanto contribuições genéticas (expressão gênica) e/ou ambientais (metilação de DNA), podem refletir de uma forma mais abrangente as alterações das vias biológicas importantes no contexto da doença. Em sua maioria, os algoritmos que propõem a integração desses tipos de dados utiliza genes diferencialmente expressos (DEG) e genes diferencialmente metilados (DMG). Entretanto, essas propostas atuais resultam em um pequeno conjunto de genes, que pode não refletir os genes e vias biológicas alterados no SCZ. O NERI é um algoritmo capaz de integrar dados de PPI, genes sementes e expressão gênica. Ele utiliza a análise de caminhos mínimos entre todos os pares de semente da rede, selecionando os melhores caminhos através da concordância dos valores de co-expressão e comparando esses valores entre duas condições (sub-redes) diferentes. Adaptamos o algoritmo NERI para utilizar além da expressão gênica, a metilação de DNA (provenientes do córtex pré-frontal dorsolateral de homens e mulheres), por meio de uma nova abordagem integrativa, não dependentes da utilização de DEG ou DMG. Utilizamos 3 conjuntos de genes sementes que apresentam risco para SCZ, expressos no cérebro fetal em 3 períodos da gestação distintos. Selecionamos os genes que apresentavam a maior concordância entre as sub-redes de co-expressão e co-metilação. Demonstramos que os genes com maior concordância: I) apresentam concordância somente quando analisados no contexto de redes de co-expressão e co-metilação - existe baixa correlação entre os sinais de expressão gênica e metilação de DNA; II) homens e mulheres com SCZ apresentam genes concordantes únicos - porém, apontam para vias metabólicas semelhantes, sugerindo que estes genes fazem parte do mesmo módulo na rede do interatoma humano; III) apresentaram altíssima importância estrutural dentro da rede do interatoma humano; IV) genes DEG e DMG no SCZ estariam localizados na periferia da rede do interatoma e apresentaram pouco enriquecimento para vias biológicas. Demonstramos que além de ser possível integrar dados biológicos de diferentes tipos, essa nova abordagem é capaz de encontrar padrões únicos de co-expressão e co-metilação, apontando para genes centrais de elevada importância no interatoma humano - que previamente não foram associados ao SCZ. Schizophrenia Spectrum Disorders (SCZ) is characterized by being complex and multifactorial. Rare genetic variants - those with the lowest allele frequency

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2020. Interações proteína-proteína (PPI) são processos-chave para a manutenção da vida. As proteínas sofrem diversas pressões seletivas para serem funcionais o que inclui pressões para a manutenção das interações. Nesse contexto, observamos a coevolução de pares de proteínas, que é quando a evolução de uma delas afeta a evolução da outra e vice versa. A Coevolução pode ser quantificada por medidas de correlação entre as substituições de aminoácidos, como por exemplo a transinformação (I). Essas medidas podem ser utilizadas para resolver diferentes problemas biológicos no contexto de PPI, a saber: (i) predição de contatos tridimensionais, (ii) predição de interfaces de interação, (iii) predição de redes de interação e (iv) proposição de pareamento de sequências homólogas de proteínas que interagem. É sabido que diversas fontes contribuem para os valores de I, entretanto entender como cada uma dessas fontes contribui para a resolução desses problemas permanece um desafio. Nesse sentido, esta Tese de Doutorado tem como objetivo entender como a evolução, a coevolução e a estocasticidade influenciam nos valores I e mais do que isso, compreender qual a usabilidade dessas diferentes fontes na resolução do problema (iv). Utilizando alinhamentos de sequências e estruturas disponíveis em bancos de dados, eu mostro aqui que a quantidade de I resultado da coevolução pode ser a mais interessante para a resolução do problema (iv). Isso porque a essa quantidade é a que possui menor degeneração, isto é, nos permite distinguir melhor entre arranjos de pareamento que fazem sentido biológico de arranjos aleatórios e deve ser a única fonte em sistemas que coevoluem em organismos diferentes. Além disso essa fonte de informação coevolutiva pode ser captada apenas em interfaces de interação corretas e de curta distância. Por fim, apresento perspectivas em otimizações para resolução de problemas do tipo (IV). Protein-protein interactions (PPI) are a key process for maintenance of life. Proteins are under diverse selective pressures to maintain their function and interactions. I this context, we observe the coevolution of protein pairs, which is when the evolution of one affect the evolution of other and vice-versa. The coevolution can be quantified by correlation metrics between the amino acids substitution, like mutual information (I). These metrics can be used to solve different biological problems like: (i) structural contacts prediction, (ii) interaction interface prediction, (iii) network interaction prediction and (iv) interactinng proteins homologous pairing. It has been known that different sources contributes to I values, however, to understand how each one of these sources contributes for these problems remains a challenge. In this way, this PhD thesis has as goal understand how the evolution, the coevolution and the stochastic influences I values and more than that, understand the usability of this different sources to solve problem (iv). Using multiple sequence alignments and structures available in data bases, I show here that the I resulted of coevolution can be the best choice to solve the problem (iv). Because, these quantity has less degeneration than others, that is, I resulted from coevolution allow us to distinguish better biological pairing from random pairing and must be the unique source in systems who evolved in different organisms. Furthermore, this source of coevolutive information could be found just in correct interfaces defined by short distances. finaly, I show perspectives in maximization to solve the problem (iv).

Orientador: Rosiane Lopes da Cunha Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Este trabalho abordou o uso de duas tecnologias emergentes, o aquecimento ôhmico e o ultrassom, para promover alterações estruturais em proteínas lácteas e permitir a formação de matrizes alimentícias com características diferenciadas. No aquecimento ôhmico foi analisada a funcionalização do caseinato de sódio (proteína de estrutura flexível) e de proteína isolada do soro (estrutura globular) sob a ação de campos elétricos. Ambas proteínas mostraram alterações conformacionais sendo que o caseinato apresentou-se mais solúvel e formou géis com menor capacidade de retenção de água. Quando utilizadas as proteínas do soro juntamente com o caseinato notou-se um efeito interativo entre elas, mais pronunciado que com o uso de aquecimento convencional, resultando na formação de uma rede gelificada ácida mais frágil e também com menor capacidade de retenção de água. De maneira geral, a aplicação de campos elétricos intermediários foi capaz de promover pequenas alterações nas proteínas que podem estar relacionadas ao equipamento utilizado ou mesmo a um limite de alterações que pode ser alcançado pela técnica. Nos estudos com ultrassom, as mesmas proteínas lácteas foram utilizadas. Foi realizado inicialmente uma extensa investigação sobre as alterações promovidas por ultrassom, a partir do qual observou-se que curtos tempos de processos são mais eficientes na promoção de modificações estruturais e que é possível que ocorra uma ação moduladora (efeito chaperona) do caseinato de sódio sobre a agregação das proteínas do soro. Assim podese modular o processo de agregação com a utilização de ultrassom em combinação com moléculas denominadas chaperonas. A partir das condições que promoveram maiores alterações realizou-se um estudo a fim de se observar a funcionalidade atingida pelo ultrassom em matrizes emulsionadas. Houve uma redução da estabilidade das emulsões a altas concentrações de proteínas do leite, que pode estar associada à competição entre as proteínas pela interface. No entanto, o efeito cooperativo entre as proteínas não ficou evidente. A aplicação dos processos, aquecimento ôhmico e ultrassom, foram de grande valia para a observação de modificações proteicas, já conhecidas em outros processos convencionais. Dessa forma foi possível ressaltar a utilização dessas técnicas (por ação do calor e campos elétricos e pelo efeito da cavitação a temperatura controlada) como promotoras de modificações conformacionais e de interações roteicas; permitindo que em estudos futuros o papel de ambas possa ser avaliado de forma mais aprofundada trazendo contribuições essenciais do ponto de vista tecnológico Abstract: This work addressed the use of two emerging technologies, ohmic heating and ultrasound, to promote structure alterations in milk proteins and allow the formation of food matrices with singular characteristics. In ohmic heating, functionalization of sodium caseinate (protein with flexible structure) and whey protein isolate (globular protein) under the action of electric fields was analyzed. Both proteins showed conformational changes, with caseinate being more soluble and forming acid gels with less water holding capacity. When whey proteins were used together caseinate an interactive effect was noticed between them, more pronounced than with the use of conventional heating, resulting in the formation of more fragile acidic gelled network and also with less water holding capacity. In general, the application of intermediate electric fields was able to promote minor changes in proteins that may be related to the equipment employed or even to a limit of changes that can be achieved by the technique. In ultrasound studies, the same milk proteins were used. Initially, an extensive investigation was carried out on the changes promoted by ultrasound, from which it was observed that short process times are more efficient in promoting structural changes and that it is possible to occur a modulating action (chaperone effect) of sodium caseinate on the aggregation of whey proteins. Therefore, the aggregation process can be with the use of ultrasound in combination with molecules called chaperones. Based on the conditions that promoted major changes, a study was carried out in order to observe the functionality achieved by ultrasound in emulsified matrices. There was a reduction in the stability of emulsions in high concentrations of milk proteins, which may be associated with the competition between proteins for the interface. However, the cooperative effect between proteins was not evident. The application of the processes, ohmic heating and ultrasound, were of great value for the observation of protein changes, already known in other conventional processes. In this way, it was possible to emphasize the use of different techniques (due to the action of heat and electric fields and cavitation effect at controlled temperature) as promoters of conformational changes and protein interactions; allowing that in future studies the role of both can be evaluated more deeply bringing essential contribution from the technological point of view Doutorado Engenharia de Alimentos Doutora em Engenharia de Alimentos CNPQ 207273/2015-4;141768/2016-9

Orientador: Andrea Balan Fernandes Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os transportadores ABC (ATP-Binding Cassette) formam uma grande superfamília de complexos de proteínas que promovem o transporte de uma ampla gama de substratos através de membranas biológicas em eucariotos e procariotos. Estruturalmente consistem em dois domínios transmembrana hidrofóbicos (TMDs) e dois domínios citoplasmáticos de ligação ao nucleotídeo (NBDs). No caso dos importadores, uma proteína periplasmática ou domínio de ligação ao substrato (SBP) adicional é responsável pela afinidade e a especificidade do transporte. Os importadores ABC de açúcares são de grande importância na nutrição e sobrevivência de bactérias patogênicas e a identificação e caracterização destes sistemas é um passo para o conhecimento sobre a fisiologia do microrganismo. Este trabalho, teve como objetivo principal o estudo de quatro sistemas ABC relacionados ao transporte de açúcares em M. tuberculosis: LpqY/SugABC, Rv2038c-41c, UspABC e UgpAEBC, por meio de análises comparativas genômicas, filogenéticas e estruturais. Os resultados evidenciaram que os transportadores ABC Rv2038c-41c e UgpAEBC são exclusivos de espécies patogênicas do gênero Mycobacterium e podem estar relacionados à infecção e patogenicidade. A comparação das SBPs, TMDs e NBDs de M. tuberculosis com ortólogos putativos e análises filogenéticas mostraram que os componentes se dividem em quatro grupos de acordo com a função dos transportadores. Análises estruturais associadas às de filogenia, revelaram que os componentes de membrana são os mais diversificados e que as principais diferenças nesses TMDs se encontram na região de interface com a proteína periplasmática. Os NBDs são os mais conservados e as SBPs divergem principalmente na região do sítio de interação com os ligantes. Estudos de modelagem e docagem molecular sugerem que LpqY seja uma proteína ligadora de trealose e Rv2041c de açúcares cíclicos. Adicionalmente, avaliamos a possibilidade de estudar as interações entre TMDs e NBDs dos transportadores ABC utilizando-se peptídeos miméticos às hélices de acoplamento. Para tal, foram usados peptídeos das hélices de acoplamento dos componentes transmembrana MalF e MalG e o componente citoplasmático MalK, do sistema de transporte de maltose MalEFGK2 de Escherichia coli. Ensaios biofísicos de fluorescência (Fluorescência Diferencial de Varredura, DSF; Termoforese em microescala, MST) e estudos de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) mostraram que MalK se liga aos peptídeos com um Kd entre 47.8 e 20.9 µmol L-1, e que MalK sofre desestabilização térmica na presença de MgCl2 e ATP, e do peptídeo MalFch. As análises de SAXS mostraram que os dois peptídeos desencadeiam mudanças conformacionais na proteína MalK. A análise da fluorescência intrínseca do triptofano mostrou que a fluorescência dos dois únicos triptofanos em MalK não muda na presença de ambos os peptídeos. Este trabalho evidenciou o papel dos transportadores ABC de açúcares em M. tuberculosis, e a partir de uma abordagem multidisciplinar mostrou o papel destes componentes na família de transportadores ABC. O uso de peptídeos codificando as hélices de acoplamentos dos componentes transmembrana, se mostrou como uma alternativa interessante para estudos de interação proteína-proteína nestes transportadores, e essa abordagem pode servir como modelo para o estudo destas interações em outros sistemas de membrana e futuros estudos de inibição destes transportadores em bactérias patogênicas Abstract: ABC (ATP Binding Cassette) transporters form a large superfamily of protein complexes that mediate the transport of a wide range of substrates across biological membranes in eukaryotes and prokaryotes. Structurally, they consist of two hydrophobic transmembrane domains (TMDs) and two cytoplasmic nucleotide-binding domains (NBDs). In the case of importers, an additional periplasmic substrate-binding protein or domain (SBP) is responsible for the affinity and specificity of the transport. Sugar ABC importers are of great importance for the nutrition and survival of pathogenic bacteria and the identification and characterization of these systems is a step towards knowledge about the physiology of the microorganism. This work had as main objective the study of four ABC systems related to sugar transport in M. tuberculosis, LpqY/SugABC, Rv2038c-41c, UspABC and UgpAEBC, through comparative genomic, phylogenetic, and structural analyzes. The results showed that the ABC transporters Rv2038c-41c and UgpAEBC are exclusive to pathogenic species of Mycobacterium genus and may be related to infection and pathogenicity. The comparison of M. tuberculosis SBPs, TMDs and NBDs with putative orthologs and phylogenetic analyzes showed that the components are divided into four groups according to the function of the transporters. Structural analyzes associated with those of phylogeny revealed that the membrane components are the most diversified and the main differences in these TMDs are found in the interface region with the periplasmic protein. NBDs are the most conserved and SBPs differ mainly in the region of the site of interaction with the substrates. Molecular modeling and docking studies suggest that LpqY and Rv2041c are a trehalose-binding protein and a cyclic sugar-binding protein, respectively. Additionally, we evaluated the possibility of studying the interactions between TMDs and NBDs of ABC transporters, using peptides mimetizing to the coupling helices. For this purpose, peptides from the coupling helices of the transmembrane components MalF and MalG and the cytoplasmic component MalK from the MalEFGK2 maltose ABC transport system of Escherichia coli were used. Biophysical fluorescence assays (Differential Scanning Fluorescence, DSF; Microscale thermophoresis, MST), and small angle X-ray scattering (SAXS) studies showed that MalK binds to peptides with a Kd between 47.8 and 20.9 µmol L-1, and that MalK undergoes thermal destabilization in the presence of MgCl2 and ATP, and of the MalFch peptide. SAXS analyzes showed that both peptides trigger conformational changes in the MalK protein. Analysis of the intrinsic fluorescence of tryptophan showed that the fluorescence of the only two tryptophans in MalK does not change in the presence of both peptides. This work highlighted the role of sugar ABC transporters in M. tuberculosis, and from a multidisciplinary approach showed the role of these components in the ABC transporter family. The use of peptides encoding the coupling helix of the transmembrane components, proved to be an interesting alternative for studies of protein-protein interaction in these transporters, and this approach can serve as a model for the study of these interactions in other membrane systems and future transporter inhibition studies in pathogenic bacteria Doutorado Genética de Microorganismos Doutora em Genética e Biologia Molecular CAPES 001 FAPESP 2018/20162-9

O transcriptograma, um método utilizado na análise de transcriptomas, utiliza dados de interação proteína-proteína para construir uma lista ordenada de genes. Nesta lista, genes são posicionados de forma que a probabilidade de interação entre seus produtos decaia exponencialmente com o aumento da distância entre suas posições. A lista ordenada de genes é então utilizada para calcular o valor de expressão médio de genes funcionalmente associados numa janela com raio configurável, permitindo a expressão diferencial de grupos gênicos não pré-definidos em estudos caso-controle. O objetivo deste estudo é a implementação de um pacote em R que use transcriptogramas e integre funcionalidades de pacotes já conhecidos pela comunidade científica, capaz de realizar: expressão diferencial, enriquecimento funcional, e visualização de rede. O pacote transcriptogramer foi implementado e encontra-se disponível no Bioconductor, um repositório para softwares open source desenvolvidos na linguagem R para utilização em bioinformática. Numa comparação entre o transcriptogramer e um pipeline combinando funcionalidades dos pacotes limma e topGO, observou-se que o transcriptogramer identificou aproximadamente 10 vezes mais termos do Gene Ontology significativamente enriquecidos, dentre os quais foram encontrados a maioria dos termos identificados pelo pipeline convencional. The transcriptogram, a method used on transcriptomes analysis, uses protein-protein interaction data to build an ordered gene list. On this list, genes are placed such that the probability of interaction between its products exponentially decreases with the increase of the distance between its positions. The ordered gene list is then used to calculate the average expression value of functionally associated genes in a window with settable radius, allowing the differential expression of non-predefined gene sets in case-control studies. This study aims to implement an R package that uses transcriptograms and integrates features from packages known by the scientific community, able to perform: differential expression, functional enrichment, and network visualization. The transcriptogramer package was implemented and is available at Bioconductor, a repository for open source softwares developed in the R language for use in bioinformatics. In a comparison between the transcriptogramer and a pipeline combining features from limma and topGO packages, was noticed that the transcriptogramer identified nearly 10 times more Gene Ontology terms significantly enriched, among which most of the terms identified by the conventional pipeline were found.

Orientador: Andréa Dessen de Souza e Silva Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As interações entre proteínas desempenham papéis biológicos importantes nas células, como no caso da biossíntese do peptideoglicano (PG), maior componente da parede celular bacteriana e responsável por definir a morfologia e proteger a célula do estresse causado pela alta pressão osmótica intracelular presente tanto em bactérias Gram-negativas como Gram-positivas. A síntese do PG é um processo dinâmico e altamente complexo, consistente de muitos passos de síntese que são orquestrados por diferentes enzimas localizadas em diferentes espaços na célula. As ligases Mur (MurC a MurF) são as proteínas responsáveis por catalisar a síntese dos precursores de PG no citoplasma juntamente com as proteínas MurG e MraY, as quais também estão relacionadas com a síntese dos precursores do PG na membrana, lipídeo I e lipídeo II, respectivamente. Esse grupo de proteínas são essenciais para a sobrevivência da bactéria e são encontradas somente em células de organismos procariota, deste modo, tornando-se alvos potenciais para o desenvolvimento de novos antibióticos. No presente trabalho foi realizada a expressão e purificação de MraY de Streptococcus pneumoniae, proteína integral de membrana, e foi analisada a sua possível interação com a enzima MurF. Existem muitas evidências sobre a formação de complexos entre essas proteínas, no entanto este trabalho descreve de forma inédita a interação direta entre as ligases Mur de Streptococcus pneumoniae, as quais formam um mega-complexo em solução. Também observamos que a interação entre essas proteínas está fortemente relacionada com a presença dos seus estados oligoméricos. Outro achado inédito é a habilidade de MurG de se auto associar em diferentes espécies, dependendo da concentração de detergente em solução, representando um processo dinâmico, importante para a montagem do mega-complexo entre as ligases Mur, uma vez que a interação entre essas proteínas também foi observada neste estudo. Assim, a formação do mega-complexo pode ser explorada como um mecanismo regulatório espacial e temporal da síntese do peptideoglicano Abstract: Protein interactions play important biological roles for cells, as in the case of the biosynthesis of peptidoglycan (PG), the major component of the bacterial cell wall. The PG is involved in the determination of cell morphology and protection against osmotic stress, both in Gram-negative and Gram-positive bacteria. The synthesis of PG is a dynamic and highly complex process, which requires many steps mediated by different enzymes located in different compartments of the cell. The Mur (MurC to MurF) ligases are responsible for the catalysis of the synthesis of PG precursors in the cytoplasm, together with the MurG and MraY proteins, which are related to the synthesis of lipid I and lipid II respectively. These proteins are essential for bacterial survival and are found only in prokaryotic organisms, and are thus potential targets for the development of new antibiotics. Here we present the expression and purification of MraY from Streptococcus pneumoniae, an integral membrane protein, as well as its analysis of the interaction with MurF. There is vast evidence regarding the formation of complexes between these proteins; however, this work describes, for the first time, the direct interaction between the Mur ligases of Streptococcus pneumoniae, which form a mega-complex in solution. We also observed that the interaction between these proteins is strongly related to the presence of their oligomeric forms. Interestingly, we have found that S. pneumoniae MurG is able to self-associate and form different oligomeric species in solution. This fact represents a dynamic process, important for the assembly of a mega-complex within the cytoplasm, and could be representative of a spatial and temporal PG-regulatory mechanism Doutorado Genética de Microorganismos Doutora em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2013/02451-0

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica endêmica no Brasil, onde são registrados cerca de 80% dos casos mundiais, e possui como agente etiológico o fungo Paracoccidioides spp. A Malato sintase (MLS) é uma importante enzima relacionada ao metabolismo fúngico, uma vez que é essencial no ciclo do glioxilato, uma via metabólica importante de produção de glicose para parede celular, sendo exclusiva de micro-organismos e plantas. Sua ausência em humanos a torna um alvo interessante de estudo, principalmente, no desenho racional de fármacos. A partir de recentes estudos in vitro, várias proteínas que interagem com a PbMLS (receptor) foram classificadas, porém os modos de interação e as regiões chaves envolvidas nas interfaces proteína-proteína (IPP’s), não foram ainda descritas. Neste trabalho, 6 (seis) proteínas ligantes (PL) foram selecionadas para verificar suas interações com PbMLS. As estruturas tridimensionais dessas proteínas, bem como de PbMLS, foram preditas por homologia, usando o servidor I-TASSER. Simulações de dinâmica molecular (DM) foram realizadas pelo programa GROMACS, e os modos das conformações mais representativas de cada proteína foram determinados baseando-se nas análises de agrupamentos a partir das trajetórias geradas por DM. Simulações de ancoragem molecular com GRAMM-X foram então realizadas entre os modos conformacionais de PbMLS contra os obtidos de PL’s, resultando num total de 36 complexos. Baseado na frequência maior de alguns pequenos fragmentos de proteínas, observados nas IPP’s, 57 peptídeos de tamanhos entre 5 e 20 resíduos de aminoácidos, foram inicialmente selecionados a partir de 5 regiões da PbMLS consideradas mais frequentes na interação proteína-proteína. Simulações com FlexPepDock foram realizadas para otimizar as coordenadas atômicas dos peptídeos complexados com MLS e, concomitantemente, simulações com PepFOLD foram realizadas para avaliar a estabilidade de cada peptídeo em solução. Com base nos mais baixos scores de energia dos peptídeos ligados a MLS bem como na estabilidade de suas estruturas não ligadas em solução , 5 peptídeos foram selecionados como promissores ligantes ao modo 1 de MLS. A estabilidade e os padrões de interações destes peptídeos são avaliados em detalhes. Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis endemic in Brazil, where are recorded about 80% of cases worldwide, and has Paracoccidioides sp. as the etiologic agent. Malate synthase (MLS) is an important enzyme related to the fungal metabolism, once it is essential in the glyoxylate cycle, a secondary metabolic pathway of the citric acid cycle exclusive to microorganisms and plants. Its absence in humans makes this enzyme an interesting subject to study, mainly in rational drug design. From recent in vitro studies, several interacting proteins of MLS (receiver) were classified, but the modes of interaction and key regions involved in protein-protein interfaces (PPIs) have not yet been described. In this work, six (6) binding proteins (BPs) were selected to describe the IP's of MLS. Their tridimensonal structures, as well as MLS, were predicted by homology modeling using I-TASSER server, and subsequent molecular dynamics simulations (MD). The most common conformational modes of each protein were obtained by cluster analysis of the trajectories generated by MD. Molecular docking simulations using Gramm-X were then performed for the conformational modes of MLS against the BP's, resulting in a total of 36 complexes. Based on the higher frequency of some small fragments of proteins observed in the IPP's, 57 peptides with sizes between 5 and 20 residues, were initially selected from 5 regions of MLS which are considered more frequent in protein-protein interaction. FlexPepDock simulations were performed to optimize the atomic coordinates of the peptide complexed with MLS, and concomitantly, PepFOLD simulations were performed to evaluate the stability of each peptide in solution. Based on the lower energy score of peptides linked to MLS, and the stability of their structures in solution (MLS-free), 6 peptides were selected as promising ligands to MLS mode 1. The stability and patterns of interactions of these peptides were evaluated in detail. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Estudos que envolvem estrutura de proteínas lidam na maioria das vezes com uma grande quantidade de informação. Para compreender melhor o processo de interações proteína-proteína é necessário estudar os fenômenos que ocorrem em suas interfaces moleculares. Interações podem ser observadas do ponto de vista de resíduos, porém sabe-se que elas ocorrem na realidade em nível atômico. Vários paradigmas propõem formas distintas para definir interações atômicas e sabe-se que é necessário comparar estes paradigmas para melhorar nossa compreensão sobre interações moleculares, permitindo abranger nosso conhecimento sobre os vários mecanismos e funções celulares. Com isso, propomos aqui o banco de dados CAPRI, para análise comparativa entre três paradigmas distintos que são usados paradefinir contatos em interface proteína-proteína. O banco de dados CAPRI possui informações de cerca de 45 mil complexos proteicos, contendo dados quanto as interações realizadas entre pares de átomos, resíduos e cadeias. Ao todo, quatro tipos de interações são investigadas,sendo elas: pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas, pontes salinas e empilhamento aromático. Os resultados obtidos, juntamente com a obtenção da base de dados criada podem ser acessados através do endereço: http://homepages.dcc.ufmg.br/~pmartins/capri1/. Studies involving protein structures most often deal with a large amount of information. To understand the process of protein-protein interactions is necessary to study the processes that occur in their molecular interfaces. Interactions can be observed at the residue level, but it is known that they occur in reality at the atomic level. Several paradigms propose different ways to define atomic interactions, and it is known that it is necessary to compare these paradigms to improve our understanding of the molecular interactions allowing to expand our knowledge of the many mechanisms and cellular functions. Thus, we propose herethe CAPRI database for comparative analysis of three different paradigms that are used to define contacts in protein-protein interface. CAPRI has information of about 45,000 protein complexes containing data about interactions between pairs of atoms, residue and chains. Four types of interactions are investigated: hydrogen bonds, hydrophobic interactions, salt bridges and aromatic stacking. The results and the database can be accessed through the link: http://homepages.dcc.ufmg.br/~pmartins/capri1/.

O uso de solventes específicos para extração de proteínas determina o tipo de reação química que ocorre entre os componentes proteicos, principalmente quando estes foram submetidos a tratamentos térmicos como a extrusão termoplástica, uma tecnologia de alta versatilidade, baixo custo, alta produtividade e que não gera efluentes. No entanto, é necessário o uso de concentrações adequadas dos solventes para maximizar a extração das proteínas. Neste trabalho foi avaliada a solubilização de proteínas de análogo de carne a base de isolado proteico de soja e glúten vital, submetidos ao processo de extrusão termoplástica a baixa (23%) e alta (60%) umidade. Os solventes utilizados foram: tampão fosfato (pH 7,5) de 10, 20, 40, 60, 80 e 100mM, dodecil sulfato de sódio de 1, 2, 3, 4 e 5%, β-mercaptoetanol de 1, 2, 3 e 4%, Triton X-100 de 1, 2, 3 e 4% e ureia de 6, 7, 8, 9 e 10M. Todos os reagentes foram dissolvidos ou solubilizados em tampão fosfato 40mM (pH 7,5). Os resultados mostraram que as maiores extrações proteicas foram obtidas com o uso de 40mM de tampão fosfato, 2% de dodecil sulfato de sódio, 2% de β-mercaptoetanol, 3% de Triton X-100 e 7M de ureia The use of specific solvents for protein extraction determines the type of chemical reaction, which occurs between the protein components, mainly when the protein was submitted to thermal treatment, such as thermoplastic extrusion, a technology with high versatility, low cost and high throughput and without effluent generation. However, it is necessary to use adequate solvents concentration in order to maximize the protein extraction. The aim of this research was to evaluate the protein solubilization of meat analogue based on isolate soy protein and vital gluten submitted to thermoplastic extrusion process at low moisture content (23%) and high moisture content (60%). The solvents used were: phosphate buffer (pH 7.5) at 10, 20, 40, 60, 80 and 100mM, sodium dodecyl sulphate at 1, 2, 3, 4 and 5%, β-mercaptoethanol at 1, 2, 3 and 4%, Triton X-100 at 1, 2, 3 and 4% and urea at 6, 7, 8, 9 and 10M. All the chemical reagents were dissolved or solubilized in phosphate buffer 40mM (pH 7.5). The results showed that the highest protein extraction were obtained when phosphate buffer 40mM, sodium dodecil sulphate 2%, β-mercaptoethanol 2%, Triton X-100 3% and urea 7M were used

Orientador : Prof. Dr. Luciano Fernandes Huergo Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 09/11/2015 Inclui referências : f. 137-154 Resumo: As proteínas PII são proteínas transdutoras de sinais, ubíquas em bactérias. Elas estão envolvidas com a regulação do metabolismo de nitrogênio e atuam principalmente por interação direta com proteínas alvo em resposta a ligação dos efetores ATP, ADP e 2-oxoglutarato (2-OG). A ligação de efetores por PII acarreta em alterações conformacionais que refletem diretamente na interação de PII com proteínas alvo. Em Azospirillum brasilense existem duas proteínas PII denominadas GlnB e GlnZ, relacionadas com a ativação transcricional de genes do metabolismo de nitrogênio e regulação pós traducional da nitrogenase em resposta a alteração dos níveis celulares de amônio e 2-OG. Visto que proteínas PII têm a capacidade de sensoriar 2-OG, um metabólito diretamente relacionado ao nível de carbono e nitrogênio celular, é possível que proteínas PII possam desempenhar um papel regulatório no metabolismo de carbono, porém essa hipótese ainda não foi confirmada. Como a atuação de proteínas PII se dá principalmente por interação proteína-proteína, o objetivo deste trabalho foi detectar novas proteínas ligantes das proteínas PII em A. brasilense, para melhor compreender o papel de PII no metabolismo deste organismo. Foram realizados ensaios de interação entre a proteína GlnZ com cauda 6xHis imobilizada em coluna de afinidade e extratos proteicos de A. brasilense 2812 (glnB-/glnZ-), com variação dos efetores ADP, ATP e 2-OG para interação e eluição das proteínas. As proteínas obtidas foram analisadas por espectrometria de massa e classificadas em grupos funcionais. Dentre as proteínas identificadas destacou-se a proteína BCCP (componente da enzima acetil- CoA carboxilase - ACC) por já ter sido descrita por interagir com PII em Arabidopsis thaliana. O gene accB (BCCP) foi clonado do genoma de A. brasilense FP2 e ensaios in vitro foram realizados para caracterização do complexo PII-BCCP. Foram realizados ensaios de atividade com a enzima ACC de Escherichia coli (EcACC) e com proteínas PII de E. coli (EcGlnB), A. brasilense (AbGlnB) e Synechococcus elongatus (SeGlnB) para verificação do efeito de PII na atividade de ACC. Os dados obtidos sugerem uma função conservada de GlnB na regulação da biossíntese de ácidos graxos através de inibição de ACC, uma vez que as proteínas GlnB diferentes organismos foram capazes de inibir a enzima EcACC. O efeito inibitório de EcGlnB e AbGlnB sobre EcACC foi afetado por altas concentrações de 2-OG e por uridililação de PII. Esses dados, juntamente com a análise de variantes de GlnB, sugerem a participação do loop T de GlnB na interação GlnB-ACC. O modelo proposto para a inibição de ACC por GlnB sugere que isso ocorra em baixos níveis de carbono e altos níveis de nitrogênio, quando a concentração de 2-OG é baixa. Além de BCCP, algumas proteínas encontradas nos ensaios de interação têm alta probabilidade de serem alvos de PII. Dentre elas, outras proteínas do metabolismo de ácidos graxos, e proteínas envolvidas com vias metabólicas diversas, como NAD+ sintetase, proteínas do sistema PTS, Glutamato sintase, RelA e RNAses. Os resultados obtidos indicam que em A. brasilense as proteínas PII podem estar atuando na regulação de processo metabólicos diversos. Abstract: PII proteins are signal transducer proteins, ubiquitous in bacteria. They are involved in nitrogen metabolism regulation and act mostly by direct protein-protein interaction in response to effector binding of ATP, ADP and/or 2-oxoglutarate (2-OG). Effectors binding by PII cause conformational changes, which reflect directly on PII interaction with target proteins. In Azospirillum brasilense there are two PII proteins named GlnB and GlnZ, involved with transcriptional activation of nitrogen metabolism genes and nitrogenase post-translational regulation in response to variation of ammonium and 2-OG cellular levels. Since PII proteins are able of sensing 2-OG, which is directly involved with carbon and nitrogen cellular levels signaling, a role in carbon metabolism by PII proteins have been addressed. As PII act by protein-protein interaction, in this study protein interaction assays were performed using a Histagged GlnZ fusion immobilized on a Ni2+-bound resin and a crude extract of A. brasilense strain 2812 (glnB-/glnZ-), using different levels of the effectors ADP, ATP and 2-OG. Protein that were retained by this affinity chromatography were identified by mass spectrometry and classified into functional groups. One of the identified proteins was BCCP protein (component of acetyl-CoA carboxylase or ACC) which interaction with PII has been described earlier in Arabidopsis thaliana. The accB gene (coding for BCCP) was cloned from A. brasilense FP2 genome allowing in vitro assays to be performed in order to characterize PII-BCCP interaction. Enzymatic assays with Escherichia coli ACC and PII proteins from E. coli, A. brasilense and Synechococcus elongatus were carried out to determine the effect of PII on ACC activity. Our data suggested a conserved role of GlnB regulating fatty acids biosynthesis by inhibiting ACC, since GlnB protein from E. coli, A. brasilense, S. elongatus and A. thaliana produced an inhibitory effect on the acetyl-CoA carboxylase activity. 2-OG levels and the uridylylated state of PII affected the inhibitory effect of EcGlnB and AbGlnB on EcACC. These results and assays using GlnB variants suggest involvement of GlnB T loop in the GlnB-ACC interaction. The proposed model for the inhibition of ACC by GlnB suggests that it occurs in low carbon and high nitrogen levels, when the concentration of 2-OG is low. Besides BCCP, some proteins found in interaction assays have a high probability of being the targets of PII. Among these, other proteins from fatty acids metabolism, and proteins involved in various metabolic pathways, like NAD+ synthetase, PTS system proteins, glutamate synthase, RelA and RNAses. The results indicate that in A. brasilense PII proteins can act in the regulation of many metabolic processes.

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Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-05-23Bitstream added on 2014-11-10T11:57:42Z : No. of bitstreams: 1 000790896.pdf: 1624782 bytes, checksum: 86f691c9d97bad42fa2588df159f183a (MD5) O Vírus da Febre amarela (YFV) causa doença com considerável morbidade e mortalidade nas regiões tropicais. Diversos vírus possuem estratégias para a alteração dos processos celulares. Mecanismos de splicing celulares são essenciais para diversificar a expressão dos genes e podem aumentar seu potencial de gerar proteínas. A replicação de YFV e as interações entre proteínas virais e celulares não são totalmente conhecidas. A proteína celular hSlu7 possui sinal de localização nuclear e tem um papel importante nas reações catalíticas do segundo passo do splicing. Estudos demonstram que sob infecção de YFV hSlu7 transloca para o citoplasma. A translocação de proteínas entre o citoplasma e o núcleo pode representar um mecanismo viral da regulação da expressão gênica. Este estudo teve como objetivo a caracterização da interação entre a proteína hSlu7 e NS5 viral, bem como estudar os efeitos de interações sobre os mecanismos de splicing alternativo após a infecção de YFV. Para identificar interação de NS5 de YFV com hSlu7 foi realizado ensaio de co-imunoprecipitação. Para verificar alteração de splicing celular foram utilizados replicons pEGFP-ADAR, pI12-IL7R, pEFGP-FGFR2, bem como a alteração de isoformas de XBP-1 endógenos. Os resultados indicam que NS5 de YFV interage com proteína hSlu7 e que sua interação pode influenciar no metabolismo RNA celular. YFV demonstrou exercer modulação no splicing celular, a avaliação de replicons sugerem que em splicing dependente de hSlu7, bem como a independente ocorre uma regulação viral atuando sobre sítios de splicing fraco e que a interação hSlu7-NS5 pode alterar direta e indiretamente a regulação trans-acting Yellow fever virus (YFV) causes disease with significant morbidity and mortality in tropical regions. Several viral strategies are avail for recruitment and alteration of the biochemical cellular processes. Cellular splicing mechanisms are essential to diversify the gene expression and increase it’s proteomic potential. Replication of YFV and the interactions between viral and cellular proteins are unknown. The cellular protein hSlu7 has an nuclear localization and an important role in the second catalytic reaction step of the alternative splicing. In our study group demonstrated that under YFV infection hSlu7 translocates to the cytoplasm. The translocation of proteins between nucleus and cytoplasm may represent a viral mechanism of cellular gene expression regulation, interference in the protein availability of the alternative splicing and viral replication control. This study aimed to characterize the interaction between the viral protein hSlu7 and NS5, as well as studying the effects of interactions on the mechanisms of alternative splicing after YFV infection. To identify interaction with YFV NS5 hSlu7 was conducted co-immunoprecipitation assay. To verify changes in cellular splicing replicons were used pEGFP-ADAR, PI12-IL7R, pEFGP-FGFR2 as well as the change of isoforms of XBP-1 endogenous.The results indicated that YFV NS5 protein interacts with hSlu7 and that their interaction may influence cellular metabolism RNA. YFV perform modulation on cellular splicing, the evaluation of replicons suggest that in hSlu7 splicing dependent and independent regulation occurs viral acting on weak splice sites and that the interaction hSlu7-NS5 can change directly or indirectly to regulate trans- acting

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-21Bitstream added on 2014-06-13T21:03:46Z : No. of bitstreams: 1 000741895.pdf: 15459081 bytes, checksum: d63bdd273032427c5d062ded87237abe (MD5) Atualmente os sistemas biológicos vem sendo abordados por diversas áreas de pesquisas, dentre elas a biologia de sistemas. Essa área tem centrado esforços para descrever e compreender as relações entre os componentes bióticos e abióticos desses sistemas, utilizando para isso a teoria de grafos. Uma forma de estudar esses sistemas, é avaliar as interações entre proteínas, que são as interações biomoleculares mais abundantes nas células. Nesse contexto, a presente tese focou no desenvolvimento de um algoritmo computacional capaz de predizer interações entre proteínas de qualquer espécie ou conjunto protéico. Para isso, foram utilizadas técnicas de aprendizado de máquina (sub-área da inteligência artificial) para a construção e aplicação desse preditor, o qual mostrou-se eficaz em predizer interações entre proteínas de mais de 80 espécies diferentes, incluindo interações entre proteínas de parasita e hospedeiro. Esse novo preditor foi aplicado no proteoma de zebrafish (Danio rerio) e humanos (Homo sapiens), gerando assim redes de interações proteicas para ambas as espécies. As interações obtidas foram avaliadas em um contexto geral e o foco das análises foi direcionado para a sub-rede relacionada com as vias de determinação e diferenciação sexual em vertebrados. Os resultados demonstraram uma relativa baixa conservação desses grafos ao longo da evolução dos vertebrados, tanto do ponto de vista global quanto da sub-rede relacionada com a determinação e diferenciação sexual em vertebrados. Além disso, foi possível observar ao menos um hub conservado entre as duas sub-redes, o qual representa um novo alvo a ser avaliado por pesquisas experimentais. Contudo, os dados demonstram que o preditor gerado possui um grande potencial para diversas áreas de estudos e é bastante útil para predição de interações em larga-escala. Além disso, os aspectos evolutivos aqui... Nowadays the biological systems have been analyzed under several research foci, including the system biology. This area focus to describe and understand the relationship between biotic and abiotic factors using the graph theory. The protein interactions are target interactions to the system biology because they are the most abundant biomolecular interactions within a cell. Thus, this thesis reported the development of a computational algorithm to predict proteinprotein interactions for all species or protein sets. The machine learning technique (sub-area of artificial intelligence) were used to develop and apply this method, giving effective results to predict protein-protein interaction for more than 80 different species, including parasitehost associations. This new predictor was applied to the proteome set of zebrafish (Danio rerio) and humans (Homo sapiens), generating the protein-protein interactions for both species. Evolutionary aspects of the protein interactions were studied in a broad context and the focus was directed to the sub-network involved in the vertebrate sex determination and differentiation. The results reported a low conservation of those graphs across the evolution in a general view or for the sub-network related to the vertebrate sex determination and differentiation. Moreover, it was reported at least one conserved hub between both subnetworks, to be further evaluated by experimental procedures. Anyway, the data showed that the predictor here reported may be very useful for several research areas and it is desirable for large-scale prediction procedures. Furthermore, the evolutionary aspects discussed in this thesis open new perspectives concerning system biology and evolutionary pathways of vertebrate sex determination and differentiation

Orientadores: Everson Alves Miranda, Pedro de Alcântara Pessôa Filho Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: O segundo coeficiente virial osmótico, B22, tem sido considerado um preditor para o processo de cristalização. Uma faixa relativamente estreita de valores negativos de B22, -1x10-4 a -8x10-4 mL.mol/g2, é ideal à formação de cristais de acordo com George e Wilson (1994). Essa faixa de valores de B22 é denominada de "janela de cristalização", sendo utilizada para classificar condições adequadas de solvente à formação de cristais. Para valores maiores que -1x10-4 mL.mol/g2, a interação proteína-proteína não é suficientemente forte para a cristalização e nenhuma fase sólida é formada, enquanto para valores menores que -8x10-4 mL.mol/g2, as interações proteína-proteína são muito intensas e precipitados amorfos são formados. Dessa forma, os valores de B22 se tornaram um critério de seleção para a cristalização de proteínas, uma vez que esse coeficiente pode ser determinado por diversos métodos. Este trabalho teve como objetivo determinar experimentalmente diagramas de fases de proteínas (lisozima, insulina suína e bovina) e identificar nesses diagramas, através de análise dos valores do B22, as condições nas quais ocorre a formação de precipitado amorfo, cristalino ou outras fases (por exemplo, fase líquida). O "salting-out" foi o método escolhido para precipitar as proteínas, pois é considerado um dos mais simples e importantes métodos para induzir a cristalização. O sal volátil carbamato de amônio foi o agente de "salting-out" escolhido. As técnicas de espalhamento de luz estático (SLS) e cromatografia de auto-interação (SIC) foram usadas para determinar os valores de B22 para as proteínas em diferentes soluções aquosas de sal a 15 e 25 °C. O fenômeno de "salting-out" foi observado nos diagramas para as três proteínas estudadas. Valores negativos de B22 e altos valores da constante de "salting-out" - entre 1,07 a 3,77 kg/mol - confirmaram que o sal volátil carbamato de amônio empregado neste estudo é um bom agente precipitante. Os valores do B22 para a insulina suína (-250x10-4 a -18x10-4 mol.ml/g2 a 25 °C e -187x10-4 a -45,2x10-4 mol.ml/g2 a 15 °C) e insulina bovina (-999x10-4 a 6,7x10-4 mol.ml/g2 a 25 °C e -533x10-4 a -16,7x10-4 mol.ml/g2 a 15 °C) indicaram a precipitação, o que também foi confirmado pelos ensaios de cristalização. Já para a lisozima, obteve-se formação de cristais independente do valor de B22 encontrado (-20,4x10-4 a -3,6x10-4 mol.ml/g2 a 25 °C e -400x10-4 a -14,4x10-4 mol.ml/g2 a 15 °C). Além disso, os modelos teóricos disponíveis na literatura utilizados para a obtenção de uma estimativa do parâmetro B22 são adequados e válidos para as condições em que a medida experimental não é possível, podendo ser aplicados para o sistema proteína/sal volátil. Dessa forma, este trabalho mostrou que não existe uma "janela de cristalização universal" válida para todos os sistemas e o uso do sal volátil carbamato de amônio como agente de cristalização é uma alternativa ao uso de sais convencionais. Abstract: The osmotic second virial coefficient, B22, has been used as a predictor of crystallization. A relatively narrow range of negative B22 values, -1x10-4 to -8x10-4 mL.mol/g2, is the ideal range for crystal formation according to George and Wilson (1994). This range, referred to as the "crystallization slot", has been used to classify suitable conditions under which proteins will assemble into crystals. For B22 values greater than -1x10-4 mL.mol/g2, the protein-protein interaction is very weak and no solid phase is formed, while for values less than -8x10-4 mL.mol/g2, the protein-protein interactions are very intense and amorphous precipitates are formed. Thus, the B22 value has become a selection criterion for protein crystallization, since this coefficient can be determined by various methods. This study aimed to determine the experimental phase diagrams for proteins (lysozyme and bovine and porcine insulin) and to identify those diagram conditions under which amorphous precipitate, crystals or other phases (for example, liquid phase) are formed, based on the values of B22. The salting-out method to precipitate proteins was chosen because it is considered one of the simplest and most important methods to induce crystallization. The volatile salt ammonium carbamate was chosen as the salting-out agent. Traditional static light scattering (SLS) and the novel self-interaction chromatography (SIC) technique were used to determine B22 values for the proteins in different aqueous salt solutions at 15 and 25 °C. The salting-out phenomenon was observed in the phase diagrams for the three proteins studied. Negative B22 values and high values of the salting-out constant - between 1.07 to 3.77 kg/mole (Cohn, 1925) - confirmed that ammonium carbamate was a good precipitant agent. The B22 values for porcine (-250x10-4 to -18x10-4 mol.ml/g2 at 25 °C and -187x10-4 to -45.2 x10-4 mol.ml/g2 at 15 °C) and bovine (-999x10-4 to 6.7x10-4 mol.ml/g2 at 25 °C and -533x10-4 to -16.7x10-4 mol.ml/g2 at 15 °C) insulin indicated precipitation that was confirmed experimentally. However, lysozyme was obtained as crystals, regardless of the B22 values found (-20.4x10-4 to -3.6 x10-4 mol.ml/g2 at 25 °C and -14.4x10-4 to -400x10-4 mol.ml/g at 15 °C). In addition, thermodynamic models available in the literature and suitable for the conditions under which experimental measurements were done provided a good fit to the data. Thus, this work showed that there is no universal "crystallization slot" applicable to all systems and that for crystallization agent, volatile salt ammonium carbamate can serve as an alternative to conventional salts. Doutorado Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos Doutora em Engenharia Química

Orientadores: Marcelo Menossi Teixeira, Ricardo Aparicio Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O agronegócio da cana de açúcar movimenta cerca de R$ 40 bilhões por ano no Brasil. A cadeia produtiva da cana de açúcar como atividade na economia é responsável por 1,5% do produto interno bruto (PIB) nacional e um dos principais componentes econômicos é a quantidade de sacarose acumulada nos colmos. No entanto, a síntese de sacarose e sua acumulação em plantas superiores é o resultado do produto de uma extensa rede de interações. Quando descarregada nas células do parênquima de armazenamento, a sacarose é metabolizada por diferentes enzimas, sendo a UDP-glucose pirofosforilase (UGPase) uma das enzimas responsáveis pela síntese de sacarose em cana de açúcar. O objetivo deste trabalho foi avaliar o padrão de expressão do gene ScUGPase-1 e os mecanismos regulatórios que controlam a atividade da proteína UGPase de cana de açúcar. Análises por RT-qPCR revelaram que a expressão do gene ScUGPase-1 diminui ao longo da maturação dos colmos e o gene é mais expresso nos entrenós em comparação com o tecido de folha. Porém, nenhuma diferença de expressão significativa foi observada entre dois cultivares contrastantes em teor de sacarose. In vivo, a localização subcelular da proteína ScUGPase-1 indicou uma associação à membrana nos tecidos de folha e colmo. Utilizando anticorpo primário fosfo-específico, observamos a fosforilação da proteína ScUGPase-1 apenas na fração solúvel e microssomal do tecido de folha. In vitro, a proteína ScUGPase-1 formou um complexo com a proteína recombinante caseína quinase 1 (CK1) e sua atividade foi afetada por agentes óxido-redutores. Para complementar os dados de óxido-redução, análises de espalhamento de luz a baixo ângulo (SAXS) forneceram o primeiro modelo estrutural do dímero da proteína ScUGPase-1 em solução, destacando que a interface de dimerização está localizada na região C-terminal. Os dados indicam que a fosforilação, interação protéica e oligomerização podem exercem um papel importante na regulação da proteína ScUGPase-1 durante a síntese de sacarose em cana de açúcar. Abstract:The sugarcane agribusiness generates around R$ 40 billion per year in Brazil, while the entire supply chain of sugarcane is responsible for 1.5% of the gross domestic product (GDP). Sugarcane productivity is mainly determined by the accumulation of sucrose in the culms. However, the synthesis and accumulation of sucrose in plants is the result of an extensive network. When sucrose is unloaded in the storage parenchyma cells, it is metabolized by different enzymes, and UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase) is one of the enzymes responsible for the synthesis of sucrose in sugarcane. The objective of this work was to gain insights on the ScUGPase-1 expression pattern and the regulatory mechanisms that control protein activity. ScUGPase-1 transcript levels were negatively correlated with sucrose content in the internodes and only a slight difference in the expression pattern was observed between two cultivars that differ in their sucrose content. The intracellular localization of ScUGPase-1 indicated association with membranes in both leaves and internodes. Using a phospho-specific antibody, we observed that ScUGPase-1 was phosphorylated in vivo in the soluble and membrane fractions from leaves, but not from internodes. In vitro, the purified recombinant enzyme interacted with recombinant protein casein kinase 1 and its activity was affected by redox modification. To complement the redox data, Small-Angle X-ray Scattering provided the first structural model of the dimer of sugarcane UGPase in solution, highlighting that the dimer interface is located at the C-terminal. The data indicated that phosphorylation, protein interaction and oligomerization may play an important role in the regulation of ScUGPase-1 activity Doutorado Genética de Microorganismos Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Kleber Gomes Franchini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Diversos tipos celulares respondem ao estresse mecânico ativando sinais que culminam com remodelamento e sobrevivência. O estresse mecânico pode atuar como agente modulador da homeostase celular e de numerosos processos patológicos. Evidências sugerem que a Quinase de Adesão Focal (FAK) medeia a resposta de miócitos cardíacos ao estresse mecânico. Contudo, os mecanismos moleculares que regulam a função da FAK ainda não são totalmente conhecidos. No presente trabalho foi demonstrado que a small heat shock protein ?B-Cristalina interage de forma direta e protege a FAK da degradação pela calpaína 2. Ensaios de pull down, cross-linking acoplado a espectrometria de massas, mutagênese sítio dirigida, docking e modelagem molecular demonstraram que as ?-hélices 1 e 4 do domínio FAT da FAK interage no sítio de ligação constituído pelas folhas ?4 e ?8 da ?B-Cristalina. Os dados funcionais e estruturais obtidos indicaram que ocorre um aumento da associação da ?B-Cristalina e o domínio FAT da FAK após mudanças conformacionais associadas com a fosforilação dependente de Src da tirosina 925. Experimentos de pull down demonstraram que a associação com a ?B-Cristalina protege a FAK da proteólise mediada pela calpaína 2. Miócitos cardíacos submetidos ao silenciamento gênico da ?B-Cristalina apresentaram uma menor quantidade de FAK detectada em 125 KDa, indicando que esta interação protege FAK da proteólise. A submissão dessas células ao estiramento cíclico revelou uma maior taxa de morte celular por apoptose, sendo que a superexpressão da FAK restaurou a viabilidade celular. Os achados deste trabalho indicam que o complexo formado entre FAK e ?B-Cristalina apresenta papel fundamental na proteção da FAK da proteólise durante o estresse mecânico, sendo importante na manutenção da sobrevivência celular Abstract: Cell types of diverse function respond to mechanical stress by triggering downstream signals for remodelling and survival. As such, mechanical stress impacts organismal homeostasis and numerous pathologic processes. Evidence suggests that focal adhesion kinase (FAK) mediates the responses of myocytes to mechanical stress, yet the molecular mechanisms to regulate FAK function are unclear. We find that FAK is recognized and protected from calpain-induced degradation by the small heat shock protein alpha-B crystalline (CryAB). A model based in the pull down, crosslinking technology coupled with mass spectrometry, site-directed mutagenesis, molecular docking and molecular modeling indicated that a cleft formed by ?4 and ?8 sheets of ?B-Crystalline is critical to the interaction with ?-helix 1 and ?-helix 4 of FAK. Functional and structural data indicated that CryAB binds directly the FAT domain of FAK upon changes in conformation associated with Src-dependent phosphorylation of tyrosine 925 induced by cell stretch. Pulldown assay indicated that ?B-Crystalline interacts and protects from calpain-induced degradation FAK. Cardiomyocytes depleted of CryAB show reduced FAK quantity detected in 125KDa, indicating that this interaction protects degradation of FAK. The submission of such cells to stretch cyclic revealed a higher rate of cell death via apoptosis, whereas restoration of FAK expression restored cell viability. Our findings highlight a new role for CryAB in forming a complex with FAK that is essential for regulating cardiomyocyte survival in response to mechanical stress Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Ciências

Orientador: Goran Neshich Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Dentro do ambiente celular, há uma variedade de moléculas e a interação entre si regulam praticamente todos os processos necessários e essenciais para a manutenção da vida. Interações entre proteínas estão envolvidas no controle de vários processos intra e intercelulares, como regulação metabólica e da expressão gênica, reconhecimento antígeno-anticorpo etc. que definem as características biológicas do funcionamento da vida entre os diversos organismos. Ao conhecer a interface de interação de uma proteína chave para desenvolvimento de casos patológicos, é possível desenhar drogas com alta especificidade com o sítio de ligação. Para avançar nessa frente, o conhecimento da estrutura proteica é fundamental, porém não suficiente. É necessário conhecermos o sítio de ligação alvo para cada parceiro de interação. Este estudo visa entender as características do nano-ambiente das interfaces proteicas - área através da qual as macromoléculas se comunicam e exercem sua funcionalidade. Propomos utilizar uma abordagem de estudo das características físico-químicas e estruturais dos resíduos formadores de interfaces de complexos conhecidos e com estrutura quaternária resolvida experimentalmente, utilizando um conjunto de dados sem redundância sequencial, extraindo os parâmetros/descritores que descrevem de forma objetiva as diferentes classes de complexos, revelando as características principais sobre interações proteína-proteína. A finalidade deste trabalho é de conhecer os detalhes que definem uma área como interface e aplicá-lo em uma ferramenta preditiva para todas as proteínas com arranjo estrutural conhecido e/ou modelado. Propomos de forma pioneira, o uso de classificadores específicos para cada tipo de aminoácido e independente do uso de descritores sobre conservação de aminoácidos. Resultados obtidos com classificador linear e por ensemble de redes neurais destacam a nossa abordagem, desenhada e aplicada nesta tese, como uma com os melhores indicadores de desempenho na predição precisa dos resíduos de aminoácido na interface entre as abordagens descritas recentemente na literatura. Ainda, enquanto os outros métodos dependem de descritores sobre conservação de aminoácidos, é mostrado aqui que nenhum ganho de desempenho é obtido com a incorporação de tais descritores em nosso modelo classificador. Esse resultado indica que o uso de descritores puramente físico-químicos e estruturais é suficiente para explicar o grau de conservação dos aminoácidos Abstract: Inside cells, there is a variety of molecules and their interactions regulate virtually all necessary and essential processes to the maintenance of life. Interactions among proteins are involved in the control of several processes within and out of the cell, such as, metabolic and gene expression regulation, anti-body and antigen recognition, etc. that defines biological characteristics of life among many organisms. If the protein interface amino acids of a key protein related to a given pathologic phenomenon are known, it is possible to rationally design drugs with high specificity for a specific binding site. To gain insight in this field, the knowledge of the protein three-dimensional structure is mandatory, but not sufficient. It is also necessary to know the interface between the target protein and its partners. This study focuses in understanding the characteristics of the area through which the macromolecules communicate to each other and exercise their function. Here, it is proposed an approach to study the physicochemical and structural characteristics of the interface forming residues with known quaternary structure (experimentally solved). It was selected a sequence non-redundant dataset and by extracting parameters/descriptors, that objectively describe different complex classes, it was possible to unravel the basic characteristics of protein-protein binding. The goal of this study is to unravel the details that outline a specific area as interface and apply it in a form of a predictive tool for all proteins with known atomic structure. It is proposed by the first time, the use of amino acid specific classifiers regarding amino acid type and free of amino acid conservation attributes. The results obtained here by employing linear and ensemble of neural network classifiers show that, based on purely physicochemical and structural descriptors, it is possible to get precise predictions about interface forming residues in protein-protein assemblies. Comparatively, the method described here retains better performance indicators than the ones recently described in the literature. In addition, we showed that, for our method, adding "conservation" attributes does not induce any performance gain, which is a major difference if compared to other described methods. This result indicates the purely physicochemical and structural descriptors are sufficient to explain how conserved amino acids are Doutorado Bioinformática Doutor em Genética e Biologia Molecular

Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico, causador da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica prevalente na América do Sul. A infecção em humanos inicia-se com a inalação de propágulos fúngicos que atingem o epitélio pulmonar. A parede celular desempenha um papel importante na patobiologia do P. brasiliensis, pois está envolvida nas mudanças morfogenéticas associadas com o ciclo de vida deste patógeno. A biossíntese e o remodelamento dos polissacarídeos da parede celular são essenciais para o crescimento do fungo e proteínas glicosilfosfatidilinositol (GPI)-ancoradas estão envolvidas nesses processos. As enzimas da família glicanosiltransferase alongando glicana (GEL) são proteínas GPI-ancoradas que possuem atividade de beta-1,3-glicanosiltransferase e desempenham um importante papel nas ligações cruzadas dos componentes da parede celular em fungos. O genoma de P. brasiliensis possui 3 genes codificantes para beta-1,3-glicanosiltransferases (Gel1p, Gel2p e Gel3p). Com o objetivo de se buscar outras possíveis funções da beta- 1,3-glicanosiltransferase 3 (PbGel3p) em P. brasiliensis, as interações entre essa proteína e outras proteínas do fungo foram investigadas através do sistema de duplohíbrido em Saccharomyces cerevisiae e do ensaio de pull-down. O sistema duplohíbrido permite o estudo das interações in vivo e, através dele, foram identificadas 8 proteínas que interagem com PbGel3p. A interação com a fosfatidilinositol-4-fosfato 5- quinase its3 e com a Dsk1 proteína quinase sugere a participação de PbGel3p no ciclo de divisão celular. A RNA helicase Dbp5p, cuja interação com PbGel3p foi confirmada in vitro através do ensaio de coimunoprecipitação, e a 5'-3' exoribonuclease estão envolvidas no metabolismo de RNAm, sugerindo uma função para PbGel3p nesse processo. A interação entre PbGel3p e a enzima serina esterase/lipase, que participa da via de biossíntese da âncora GPI, também foi confirmada por coimunoprecipitação. PbGel3p interage com o fator de transcrição Ctf1Bp e enzima 3-oxoacil redutase, fato que sugere seu envolvimento no metabolismo de lipídeos de P. brasiliensis. A interação com a proteína de resistência à leptomicina B Pmd1p sugere um papel para PbGel3p na resposta à agentes antifúngicos. O ensaio de pull-down in vitro resultou na identificação da proteína de choque térmico de 70 kDa de P. brasiliensis. A interação com essa proteína sugere que PbGel3p pode atuar na resposta à condições de estresse, como o aumento de temperatura. Com base nesses dados, estudos funcionais devem ser realizados para confirmar a multifuncionalidade de Gel3p em P. brasiliensis. Paracoccidioides brasiliensis is a thermodimorphic fungus that causes paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis prevalent in South America. In humans, infection starts by inhalation of fungal propagules that reach the pulmonary epithelium. The cell wall presents an essential role in the pathobiology of P. brasiliensis, since it is involved in the morphogenetic changes associated with the life cycle of this pathogen. The biosynthesis and remodeling of the cell wall polysaccharide network is required for fungal growth and glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins are involved in these processes. The enzymes of the glucan-elongating (GEL) family are GPI-anchored proteins which have beta-1,3-glucanosyltransferase activity and play important role in the cross-linking of cell wall components in fungi. The P. brasiliensis genome possess 3 genes that encode for beta-1,3-glucanosyltransferases (Gel1p, Gel2p e Gel3p). With the aim of searching for other possible functions for beta-1,3-glucanosyltransferase 3 (PbGel3p) in P. brasiliensis, the interactions between this protein and others proteins of the fungus were investigated through the Saccharomyces cerevisiae two-hybrid system and pull-down assay. The two-hybrid system enables the study of interactions in vivo and, through this approach, 8 proteins which interact with PbGel3p were identified. The interaction with phosphatidylinositol- 4-phosphate 5-kinase its3 and protein kinase Dsk1p suggest the participation of PbGel3p in the cell division cycle. The RNA helicase Dbp5p, whose interaction with PbGel3p was in vitro confirmed by coimunoprecipitation, and the 5'-3' exoribonuclease are involved in the mRNA metabolism suggesting a function for PbGel3p in this process. The interaction between PbGel3p and the lipase/serine esterase, which participates on the biosynthesis of the GPI-anchor, was also confirmed by coimunoprecipitation. PbGel3p also interacts with the transcription factor Ctf1Bp and the 3-oxoacyl reductase enzyme, which suggests its involvement in the lipid metabolism. The interaction with the leptomycin B resistance protein Pmd1p suggests a role for PbGel3p in the response to antifungal drugs. The in vitro pull-down assay resulted in the identification of P. brasiliensis 70 kDa heat shock protein. The interaction with this protein suggests that PbGel3p may act in the response to stress conditions, as in the temperature increase. On basis of these data, functional studies may be carried out in order to confirm the Gel3p multifunctionality in P. brasiliensis.

Informações de interações de proteínas são fundamentais para a compreensão dos processos celulares. Por esta razão, várias abordagens têm sido propostas para inferir sobre pares de proteínas de redes de todos os tipos de dados biológicos. Nesta tese é proposto um método de bi-clustering, Lbic, baseado num modelo de classificação logística, para analisar dados biológicos binários. O Lbic é comparado com outros dois métodos de bi-clustering apresentados na literatura, mostrando melhores resultados. Seu desempenho também é comparado àqueles de um método supervisionado, análise de correlação canônica com Kernel, aplicado aos mesmos conjuntos de dados. Os resultados mostram que o Lbic alcança desempenho superior aos da aborgadem supervisionada treinada com até 25% do conhecimento da rede alvo

Orientador: Fabio Cesar Gozzo Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica Resumo: A Espectrometria de Massas (MS) é hoje a principal técnica de caracterização de estrutura primária de proteínas devido às vantagens intrínsecas da técnica. As técnicas de cross-linking e footprinting visam desfrutar de tais vantagens para obtenção de informações estruturais de complexos protéicos. Nesse projeto foram realizados estudos de fragmentação de peptídeos contendo como cross-linker o DSS, reagente mais utilizado para esse propósito. Os mecanismos de fragmentação foram propostos baseados na dissociação de peptídeos modelos sintetizados para gerar espécies que mimetizassem experimentos com proteínas. Esses estudos permitiram a identificação de íons marcadores, que foram posteriormente utilizados em experimentos de Varredura de Íons Precursores para auxiliar na detecção de peptídeos modificados. Para realização dos experimentos de footprinting, foi desenvolvida uma linha de luz no LNLS. Posteriormente, foi proposto um novo método de quantificação de cinética de oxidação baseado nos dados de LC-MS, levando em consideração todos os produtos de oxidação formados. Esses métodos foram utilizados no estudo de interação das proteínas Tif34 e Tif35 do fator de iniciação de tradução de Saccharomyces cerevisiae. Os resultados obtidos indicam que Tif34 apresenta dois possíveis sítios de interação para a proteína Tif35 Abstract: Mass Spectrometry (MS) is the most important tool for analyses related to protein primary structure. Cross-Linking and footprinting aim to bring those advantages to gain insights in the spatial structure of protein complexes. In this work the fragmentation of peptides containing DSS, the most used cross-linker, was studied. Fragmentation mechanisms were proposed based on the dissociation of model peptides which were synthesized in order to generate species that would resemble species found in experiments with proteins. Diagnostic ions were identified which allowed the use of Precursor Ion Scan to detect those species. In order to perform footprinting experiments, a new beamline was developed at the LNLS. A new method for quantitation of oxidation kinetics was developed based on LC-MS analysis, which considers every single oxidation product that can be generated. Those methods were thereafter used in the study of the interaction between Tif34 and Tif35, proteins which compose a translation initiation factor of Saccharomyces cerevisiae. The results indicate that Tif34 presents two different sites for the interaction with Tif35 Doutorado Química Orgânica Doutor em Ciências

Orientador: Jorg Kobarg Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A proteína Ki-1/57 que é encontrada tanto no núcleo quanto no citoplasma está associada com atividade de proteína quinase serina/treonina e é fosforilada nestes resíduos após ativação celular. Neste trabalho verificamos que Ki-1/57 interage com a proteína Chromatin-Helicase-DNA-binding domain 3 (CHD3) e com a proteína adaptadora/sinalizadora RACK1 no núcleo. Pelo sistema do duplo híbrido de levedura (SDHL) a proteína arginina metiltransferase 1 (PRMT1) foi selecionada como outra proteína de interação. A PRMT1 integra uma família representada por nove enzimas humanas que catalisam reações de metilação em resíduos de arginina. Em seguida, usando agora a PRMT1 como isca - no SDHL - identificamos as proteínas Ki-1/57 e hnRNPQ, juntamente com outras 13. A maioria delas contêm motivos ¿RGG-box¿ em suas seqüências de aminoácidos, que são conhecidos alvos para metilação. Posteriormente verificamos que Ki-1/57 e seu provável parálogo CGI-55 conservam dois motivos ¿RGG/RXR-box¿ e que são substratos in vitro para a metilação de argininas pela PRMT1. Estudos de mapeamento mostraram que todos os fragmentos contendo o motivo ¿RGG/RXR-box¿ interagem com a PRMT1 e são alvos à metilação in vitro. Ki-1/57 endógena, imunoprecipitada de células L540, mostrou ser metilada in vivo, além de ser um alvo a metilação pela PRMT1 in vitro, somente quando as células são previamente tratadas com o inibidor da metilação Adox. Tratamento das células Hela com o inibidor da metilação (Adox) causa desaparecimento da imuno-marcação citoplasmática de Ki-1/57 e relativa redistribuição do parálogo CGI-55 para o citosol. Assim, pode ser especulado que a metilação destas proteínas deve ser um evento importante para suas localizações subcelulares e conseqüentemente para suas funções. Em resumo, nossos dados sugerem que o SDHL é um método efetivo na identificação de novos substratos celulares para a PRMT1 e poderia ser estendido para a identificação e caracterização de novos substratos para os outros integrantes da família das PRMTs humanas Abstract: The protein Ki-1/57 that is found both in the cytoplasm and nucleus is associated with serine/threonine protein kinase activity and gets phosphorylated on serine and threonine residues upon cellular activation. We demonstrated that Ki-1/57 interacts with the Chromatin-Helicase-DNA-binding domain protein 3 (CHD3) and with the adaptor/signaling protein RACK1 in the nucleus. By utilizing the yeast two-hybrid system (YTHS), we were further able to find the protein arginine-methylatranseferase-1 (PRMT1) as another interacting protein. PRMT1 is a member of the family constituted by 9 human enzymes that catalyze methylation reactions on arginine residues. Afterwards, by using PRMT1 as bait in the YTHS we identified both Ki-1/57 and NSAP1 as interacting proteins, along with 13 other proteins. The majority of them present RGG-box clusters in their amino acid sequences, which are known to be targets for arginine methylation. We further found that Ki-1/57 and its putative paralogue CGI-55 have two RGG/RXR-box clusters conserved between them and that they are substrates for arginine-methylation by PRMT1 in vitro. In mapping studies, we observed that all Ki-1/57 protein fragments containing the RGG/RXRbox clusters interact with PRMT1 and are targets for methylation in vitro. Endogenous cellular Ki-1/57 seems to be methylated in vivo and is a target for methylation by PRMT1 in vitro, only when cells have been previously treated with the methylation inhibitor Adox. Treatment of Hela cells with the inhibitor of methylation (Adox) causes the disappearance of the immuno-staining of Ki-1/57 in the cytoplasm and a relative redistribution of the paralogue CGI-55 to the cytosol. It can therefore be speculated that the methylation of these proteins is important for their sub-cellular localization and in consequence for their function. In summary our data suggest that the YTHS is an effective method for the identification of novel cellular PRMT substrates and could be extended for the identification and characterization of novel substrates to the other components of the human PRMT1 family Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular