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Orientadora: Profª Drª Vanessa Kava Coorientador: Prof. Dr. José Viriato Coelho Vargas Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 20/03/2018 Inclui referências: p.74-83 Resumo: O Brasil tem uma grande variedade de ambientes pouco explorados para prospecção de microalgas com importância biotecnológica. A prospecção de microalgas busca identificar cepas bem adaptadas às condições de crescimento artificial e capazes de sintetizar produtos com alto valor, que podem ser utilizados na indústria de alimentos, nutracêuticos, cosméticos e aquicultura. O Complexo Estuarino de Paranaguá (CEP) constitui um dos maiores sistemas de estuários do Atlântico no sudoeste do Brasil e pode ser fonte de espécies de microalgas com potencial biotecnológico. O objetivo deste estudo foi bioprospectar, identificar e caracterizar a produção de lipídeos de microalgas coletadas em fazendas de ostras em dois locais do CEP, Medeiros e Ponta Oeste. Para isso, alíquotas de água do mar destas duas localidades foram coletadas e as células presentes foram concentradas por filtragem com uma malha de nylon de 20 ?m. As amostras foram enriquecidas em meio F/2 líquido e depois espalhadas em placas de Petri com o mesmo meio semi-sólido. As culturas de seis colônias isoladas que se mantiveram estáveis em condições de cultivo no laboratório foram preparadas para a produção de biomassa e análises de lipídeos. A produção de lipídeos foi observada em células através de microscopia, usando o corante vermelho do Nilo e analisada a partir da extração da biomassa, com o método gravimétrico de Bligh & Dyer. A identificação morfológica destes isolados foi realizada com microscopia óptica e de varredura eletrônica, enquanto que, para a identificação molecular, foram testadas as sequências de DNA das regiões rbcL, ITS, COI-5P e LSU. Dentre as cepas utilizadas, foi possível identificar morfologicamente três gêneros de diatomáceas, Nitzschia, Navicula, e Halamphora, e um isolado de cianobactéria. Das sequências de DNA utilizadas, a região rbcL apresentou os melhores resultados tanto na amplificação quanto no sequenciamento. Uma cepa do gênero Nitzschia apresentou a melhor produção de lipídeos chegando a mais de 26% de lipídeos do total da sua biomassa. O gênero Navicula apresentou quantidade significativa de lipídeos presentes em vesículas, identificadas por microscopia com coloração com vermelho de Nilo, apesar de ter apresentado aproximadamente 11% de lipídeos do total da sua biomassa. Novas estratégias de extração de lipídeos deverão ser utilizadas com este gênero. Este trabalho apresentou o potencial de bioprospecção de microalgas na região do CEP, como fonte de lipídeos. Palavras-chave: microalgas, lipídeos, diatomáceas, DNA-barcode, bioprospecção Abstract: Brazil has a large variety of poorly explored environments for the prospection of microalgae with biotechnological importance. The prospecting of microalgae seeks to identify strains well adapted to the conditions of artificial growth and capable of synthesizing products with high value, which can be used in the food industry, nutraceuticals, cosmetics and aquaculture. The Paranaguá Estuary Complex (CEP) is one of the largest Atlantic estuarine systems in southwest Brazil and may be a source of microalgae with biotechnological potential. The objective of this study was to bioprospect, to identify and to characterize the lipid production of microalgae collected in oyster farms in two locations of CEP, Medeiros and Ponta Oeste. For that, aliquots of sea water from these two locations were collected and the cells were concentrated by filtration with a 20 ?m nylon mesh. Samples were enriched in liquid F/2 medium and then scattered in Petri dishes with the same semi-solid medium. Cultures of six isolated colonies that were stable under culture conditions were prepared for biomass production and lipid analyzes. Lipid production was observed in cells by microscopy using the red Nile dye and analyzed from the biomass extraction using the Bligh & Dyer gravimetric method. The morphological identification of these isolates was performed with optical microscopy and electronic scanning microscopy, while the DNA sequences of the rbcL, ITS, COI-5P and LSU regions were tested for molecular identification. Among the strains used, it was possible to identify morphologically three genera of diatoms, Nitzschia, Navicula, and Halamphora, and a cyanobacteria isolate. From the DNA sequences used, the rbcL region showed the best results in both amplification and sequencing. A strain of the genus Nitzschia showed the best production of lipids reaching more than 26% of the total of its biomass. The genus Navicula presented a significant amount of lipids in vesicles, identified by microscopy with Nile red staining, although it presented approximately 11% of lipids of the total of its biomass. New strategies for lipid extraction should be used with this genus. This work presented the potential of bioprospecting of microalgae in the CEP region, as source of lipids. Keywords: microalgae, lipids, diatoms, DNA-barcode, bioprospection

Orientador : Prof. Dr. José Viriato Coelho Vargas Coorientadora : Profª. Drª. Vanessa Kava Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Mecânica. Defesa : Curitiba, 28/09/2017 Inclui referências Resumo : Microalgas possuem um elevado potencial biotecnológico como fonte de biocombustíveis (biodiesel, biohidrogênio) ou ainda como fonte de outros produtos de elevado valor agregado (produtos farmacêuticos, proteínas, pigmentos entre outros). No entanto, para que o cultivo de microalgas possa ser economicamente competitivo com outras fontes de combustível faz-se necessário a aplicação do conceito de biorrefinaria - instalações produtivas que geram e utilizam matéria prima de origem biológica, operando de forma totalmente integrada. Esta parece ser a estratégia mais acertiva para alcançar a viabilidade do processo de produção. Portanto, os objetivos deste estudo foram isolar e identificar a principal linhagem de microalga utilizada para a produção de biocombustíveis no NPDEAS, utilizando a seqüência de rDNA e análise micromorfológica, e avaliar o potencial desta linhagem na produção de hidrogênio e co-produtos com atividade biológica. Para a purificação da linhagem (LGMM0001), uma aliquita foi semeada em meio de cultivo CHU sólido e uma colônia isolada foi selecionada e mantida em meio CHU líquido. O DNA genômico foi purificado utilizando kit comercial (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha), para identificação molecular, a região ITS (ITS1, 5,8S e ITS2) (Internal Transcribed Spacer) foi amplificada e sequenciada utilizando os iniciadores LS266 e V9G. A caracterização morfológica foi realizada utilizando o microscópio Axio Imager Z2 (Carl Zeiss, Jena, DE). A avaliação da produção de hidrogênio foi realizada seguindo a metodologia de Hemschemeier et al. (2009), todo o procedimento foi feito em duplicata. Por fim, para a pesquisa de atividade biológica, os metabólitos secundários foram extraídos por fracionamento com acetato de etila e clorometano, concentrados e avaliados contra bactérias de interesse clínico. Através de análises de microscopia, foram observadas características gerais compartilhadas pelos gêneros Scenedesmus e Acutodesmus. A plasticidade das características morfológicas desses gêneros reforça a necessidade de mais estudos para a correta classificação das espécies neste grupo utilizando sequenciamento de DNA. A análise da sequência ITS mostrou 100% de homologia com sequências da espécie Acutodesmus obliquus, e a linhagem (LGMM0001) foi classificada como pertencendo a esta espécie. A linhagem de microalgas avaliada foi capaz de produzir hidrogênio, mostrando resultados positivos para a formação do gás, com produção máxima para a linhagem isolada em 68,66±5,01mg/m3 . Assim como para a atividade biológica dos extratos obtidos a partir das fases de cultivo, a qual apresentou o melhor resultado com o extrato obtido do cultivo residual realizado com meio alternativo utilizado nos FBRs do NPDEAS, frente a linhagem patogênica S. aureus. Em conclusão, a linhagem de microalga utilizada neste trabalho foi caracterizada como Tetradesmus obliquus (=Acutodesmus obliquus), e foi capaz de produzir compostos com potencial econômico em associação com o processo de produção de biocombustíveis. Palavras chaves: Acutodesmus, hidrogênio, sequência de rDNA, biorrefinaria, atividade biológica. Abstract : Microalgae have a high biotechnological potential as a source of biofuels (biodiesel, biohydrogen) or as a source of other products with high added value (pharmaceuticals, proteins, pigments among others). However, for microalgae cultivation to be economically competitive with other fuel sources, it is necessary to apply the concept of biorefinery - production facilities that generate and use raw material of biological origin, operating in a totally integrated way. This seems to be the most ambitious strategy to achieve the viability of the production process. Therefore, the objectives of this study were to isolate and identify the main microalgae line used to produce biofuels in NPDEAS using the rDNA sequence and micromorphological analysis and to evaluate the potential of this lineage in the production of hydrogen and co-products with biological activity. For the purification of the lineage (LGMM0001), an aliquite was seeded into solid CHU culture medium and an isolated colony was selected and maintained in liquid CHU medium. The genomic DNA was purified using commercial kit (Macherey-Nagel, Düren, Germany) for molecular identification, the ITS region (ITS1, 5.8S and ITS2) (Internal Transcribed Spacer) was amplified and sequenced using primers LS266 and V9G. Morphological characterization was performed using the Axio Imager Z2 microscope (Carl Zeiss, Jena, DE). The evaluation of the hydrogen production was carried out following the methodology of Hemschemeier and co-workers (2009), the entire procedure was done in duplicate. Finally, for biological activity research, secondary metabolites were extracted by fractionation with ethyl acetate and chloromethane, concentrated and evaluated against bacteria of clinical interest. Through microscopic analysis, general characteristics shared by the genus Scenedesmus and Acutodesmus were observed. The plasticity of the morphological characteristics of these genera reinforces the need for further studies to correctly classify the species in this group using DNA sequencing. ITS sequence analysis showed 100% homology with sequences from the Acutodesmus obliquus species. The lineage (LGMM0001) was classified as belonging to this species. The microalgae line evaluated was able to produce hydrogen, showing positive results for gas formation, with maximum production for the isolated line at 68,66 ± 5,01 mg/m3 . As for the biological activity of the extracts obtained from the cultivation phases, which presented the best result with the extract obtained from the residual culture carried out with alternative medium used in the NPDEAS FBRs, against the S. aureus pathogenic lineage. In conclusion, the microalgae line used in this work was characterized as Tetradesmus obliquus (=Acutodesmus obliquus), and was able to produce compounds with economic potential in association with the biofuel production process. Key-words: Scenedesmus, Acutodesmus, hydrogen, rDNA sequence, biorefinery, biological activity.

Orientador: Prof. Dr. João Alencar Pamphile Tese (doutorado em Biologia Comparada) - Universidade Estadual de Maringá, 2014 RESUMO: A Malpighia emarginata, conhecida popularmente como acerola, foi introduzida no Brasil na década de 1950. É uma espécie arbustiva que se desenvolve em zonas de clima tropical e subtropical, conhecida por sua resistência e rusticidade, além de ser muito atrativa devido ao teor de vitamina C encontrado em seus frutos, que podem ser consumidos in natura ou na forma de sucos e geleias. Os microrganismos endofíticos têm sido isolados de todas as espécies vegetais estudadas e apresentam potencial biotecnológico no controle de patógenos, promoção de crescimento e produção de metabólitos secundários, além da produção de diversas enzimas. As bactérias endofíticas vivem em simbiose com a planta, transitando entre estágios de colonização epifítica e endofítica, e dessa forma podem oferecer benefícios ecológicos ao vegetal ou mesmo ter um efeito neutro. Para que seja garantida a eficiência do controle biológico é necessário conhecer a ecologia do patógeno e do antagonista. As bactérias endofíticas apresentam alto potencial para controle de fitopatógenos, em virtude de sua competição por espaços e nutrientes no interior da planta. Os endófitos, além de apresentarem elevada capacidade para a produção de diversas enzimas, com inúmeras propriedades e aplicações biotecnológicas, também podem ser usados em outras áreas de interesse como na solubilização de fosfato. Para estudar a diversidade de bactérias endofíticas é utilizado o sequenciamento do gene 16S rDNA, que, aliado a técnica de PCR, se tornou um padrão universal na identificação e classificação bacteriana. Dessa forma, os objetivos desse trabalho foram o de estudar a diversidade de bactérias endofíticas presentes em M. emarginata e analisar o potencial biotecnológico desses isolados na solubilização de fosfato inorgânico, no controle biológico de fitopatógenos e também a produção in vitro de enzimas extracelulares. Pelo sequenciamento da região 16S foi possível identificar 36,94% dos isolados, distribuídos nos seguintes gêneros: Acinetobacter, Aureimonas, Bacillus, Cellulomonas, Enterobacter, Microbacterium, Micrococcus, Pseudomonas e Staphylococcus, sendo mais de 30% destes, foram identificados em nível de espécie. Na avaliação da solubilização de fosfato, 17,64% das bactérias apresentaram resultado positivo. Muitos isolados também foram capazes de inibir o crescimento de fitopatógenos em até 89,09%. Os halos produzidos na atividade enzimática chegaram a 4,80. Esses estudos comprovaram a diversidade genética existente na comunidade endofítica de M. emarginata, e demonstra o potencial biotecnológico de alguns isolados, na solubilização de fosfato, no controle biológico e na produção de enzimas de interesse comercial ABSTRACT: The Malpighia emarginata, popularly known as "acerola", was introduced in Brazil in the 1950s. It is a shrub that grows in areas with tropical and subtropical climate, known for its resistance and rusticity, besides being very attractive due to the vitamin C found in its fruit, which can be consumed in natura or as juices and jellies. The endophytic microorganisms have been isolated from all plant species studied and have biotechnological potential for the control of pathogens, growth promotion, production of secondary metabolites and several enzymes. Endophytic bacteria live in symbiosis with the plant and move between stages of epiphytic and endophytic colonization, and thus can provide ecological benefits to the plant or even have a neutral effect. To ensure the efficiency of the biological control is necessary to know the ecology of the pathogen and the antagonist. Endophytic bacteria have a high potential to control pathogens, due to their competition for space and nutrients in the interior of the plant. The endophytes have high capacity for the production of several enzymes with numerous properties and biotechnological applications, and also can be used in other interesting areas, as phosphate solubilization. The sequencing of 16S rDNA gene, combined with PCR technique, became a universal standard for bacterial identification and classification, being used to study the diversity of endophytic bacteria. Therefore, the objectives of this work were to study the diversity of endophytic bacteria present in M. emarginata and analyze their biotechnological potential for the solubilization of inorganic phosphate, the biological control of plant pathogens and the in vitro production of extracellular enzymes. It was possible to identify 36.94% of the isolates by sequencing of 16S, distributed in the following genera: Acinetobacter, Aureimonas, Bacillus, Cellulomonas, Enterobacter, Microbacterium, Micrococcus, Pseudomonas and Staphylococcus; more than 30% were identified to the species level. Regarding the evaluation of the phosphate solubilization, 17.64% of bacteria were positive. Many isolates were also able to inhibit up to 89.09% the pathogens growth The halos produced in the enzyme activity reached up to 4.80. This study demonstrated the existence of genetic diversity in the endophytic community of M. emarginata and the biotechnological potential of some isolates for the phosphate solubilization, biological control and the production of enzymes of commercial interest 124 f. : il. (algumas color.).

Orientadora : Profª Drª Vanessa Kava Coorientadora : Profª Drª Chirlei Glienke Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 28/11/2014 Inclui referências : f.65-69;85-90;113-115;118-122 Área de concentração : Genética Resumo: A Mancha Preta dos Citros (MPC) é uma doença que causa lesões nas principais variedades de frutos cítricos e, em casos mais severos, causa sua queda prematura, levando a prejuízos de produção e perdas no mercado consumidor. É causada pelo fungo Phyllosticta citricarpa, cujos esporos são encontrados em folhas aderidas à planta e em lesões nos frutos na forma assexuada (picnidiósporos), e na forma sexuada (ascósporos) em folhas em decomposição no solo. Neste trabalho foram investigados os mecanismos que desencadeiam o ciclo sexual em diferentes isolados de Phyllosticta citricarpa, obtidos de diferentes regiões geográficas e de diferentes hospedeiros, buscando reconhecer sistemas de compatibilidade existentes. Testes de compatibilidade em variadas condições descritas na literatura e em outras condições propostas neste estudo foram realizados com 165 isolados de Phyllosticta. Algumas condições ensaiadas, previamente descritas na literatura, mostraram-se inadequadas para ensaios de compatibilidade entre diferentes isolados de P. citricarpa. Estruturas semelhantes a corpos de frutificação imaturos foram observadas na zona de encontro entre os isolados LGMF 76 e 114, porém não foram obtidos ascósporos. Na produção de ascósporos estão envolvidos os genes mating type (MAT) que regulam o desenvolvimento da reação sexual. Estes genes foram identificados após o desenho de primers específicos para esta espécie, com o objetivo de caracterizar este importante fitopatógeno quanto à dinâmica de recombinação possível em campo. Dos 148 isolados investigados, 21,62% apresentaram o gene MAT 1-1-1, 78,38% o gene MAT1-2-1. Considerando que os ascósporos, desempenham um papel importante no ciclo da Mancha Preta dos Citros, condições de produção e liberação destes esporos foram recriadas em laboratório com o desenvolvimento de caixas com temperatura, ventilação e umidade controlada, onde plantas axênicas desenvolvidas a partir do embrião de sementes de citros e livres de microrganismos foram utilizadas. Ainda, aspectos da colonização dos frutos pelo fitopatógeno foram investigados, avaliando-se a relação entre o crescimento, colonização de folhas e produção de picnídios frente aos principais terpenos produzidos na casca dos frutos cítricos e que comprovadamente exercem um papel no processo de atração de pragas e patógenos. Em todos os testes realizados foi possível detectar que os terpenos influenciam de diferentes formas o crescimento e a produção de picnídios de P. citricarpa. Este pode ser mais um passo no entendimento do mecanismo de interação entre planta-patógeno, podendo se tornar uma futura forma de controle dessa doença. Palavras - chave: Mancha Preta dos Citros, Phyllosticta citricarpa, mating type, terpenos, interação planta-patógeno Abstract: The citrus black spot (CBS) is a disease that causes lesions on the main varieties of citrus fruits and, in more severe cases, causes its premature drop, leading to production and consumer market losses. It is caused by the fungus Phyllosticta citricarpa, whose spores are found over leafs attached to the plant and in the lesions of fruits in the asexual form (pycnidiospores), and in the sexual form (ascospores) in decomposing leafs in the soil. The present study investigated the mechanisms that trigger the sexual cycle in different isolates of Phyllosticta citricarpa, obtained from different geographic regions and different hosts, seeking to recognize existing compatibility systems. Compatibility tests on various conditions described in the literature and in other conditions proposed in this study were performed with 165 Phyllosticta isolates. Some conditions tested, previously described in the literature, have proved inadequate for testing compatibility between different isolates of P. citricicarpa. Structures similar to immature fruiting bodies were observed in the area of contact between the isolates LGMF 76 and 114, however ascospores were not obtained. The production of ascospores involves the mating type (MAT) genes which regulate the development of sexual response. These genes were identified after drawing primers specific for this species, with the objective of characterizing this important phytopathogen regarding the dynamics of possible field recombination. Of the 148 isolates investigated, 21.62% presented the MAT 1-1-1 gene and 78.38% the MAT1-2-1 gene. Considering that the ascospores play an important role in the citrus black spot cycle, production conditions and release of these spores were recreated in the laboratory with the development of boxes with controlled temperature, ventilation and humidity, where axenic plants grown from the embryo of citrus seeds and free from microorganisms were utilized. Still, aspects of colonization of the fruit by the phytopathogen were investigated by evaluating the relationship among growth, leaf colonization and production of pycnidia front of the main terpenes produced in the peel of citrus fruits and proven to play a role in the process of attraction of pests and pathogens. In all tests conducted it was possible to detect that the terpenes influence in different ways the growth and production of P. citricarpa pycnidia. This can be another step in the understanding of the mechanism of interaction between plant-pathogen, and may become a future way of controlling this disease. Key - words: citrus black spot, Phyllosticta citricarpa, mating type, terpenes, plant-pathogen interaction

Orientadora : Profª Drª Vanessa Kava-Cordeiro Co-orientadora : Profª Drª Chirlei Glienke Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 28/04/2014 Inclui referências Área de concentração : Genética Resumo: A citricultura é uma das principais atividades econômicas no Brasil. A presença de fungos fitopatogênicos ocasiona perda de produtividade e aumento do custo de produção devido ao uso de fungicidas. Com o objetivo inicial de selecionar fungos endofíticos de Citrus sinensis com potencial antagonista contra o fitopatógeno Phyllosticta citricarpa, foram obtidos 1141 isolados fúngicos de 443 folhas, representando 1% de um pomar no estado do Paraná, não afetado pela Mancha Preta dos Citros, doença causada por este fitopatógeno. Um isolado, identificado como Muscodor sp (LGMF1254), apresentou os melhores resultados no teste de antagonismo. Com o objetivo de selecionar outros isolados deste gênero, o isolado LGMF1254 foi utilizado na bioprospecção da planta medicinal Aroeira (Schinus terebinthifolius Raddi). Desta seleção foi obtido mais um isolado (LGMF1255), sendo estes dois os primeiros descritos no Brasil do gênero Muscodor. Fungos do gênero Muscodor são considerados uma promessa no controle biológico pela produção de compostos orgânicos voláteis (COVs). Esses dois isolados apresentaram antagonismo contra P. citricarpa pela produção de COVs. Os compostos majoritários foram identificados como Thujopseno e Ácido benzenodicarboxilico por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas. A identificação e a caracterização dos isolados foram baseadas em macromorfologia, micromorfologia por microscopia eletrônica de varredura e sequenciamento parcial das regiões ITS1-5.8S-ITS2 (Internal Transcribed Spacer) do DNA ribossomal e do gene rpb2 (RNA polymerase II). Os isolados LGMF1254 e LGMF1255 apresentaram identidade absoluta de ITS com M. sutura e M. vitigenus. Com a sequência do gene rpb2 não foi possível diferenciar os isolados LGMF1254 e LGMF1255, porém estes apresentaram diferenças quando comparados com a mesma sequência de M. sutura. A sequência do gene rpb2 de M. vitigenus não está disponível em bancos de dados. Na análise dos resultados, estes primeiros isolados identificados no Brasil receberam a denominação de Muscodor vitigenus latu sensu, pois M. vitigenus é a espécie mais antiga deste clado. Palavras chave: Xylareaceae, Muscodor, Citrus sinensis, Schinus terebinthifolius, Phyllosticta citricarpa, controle biológico, compostos orgânicos voláteis, sequenciamento de DNA, fungo endofítico, fungo fitopatogênico. Abstract:The citrus cultivation is one of the main economic activities in Brazil. The presence of phytopathogenic fungi causes lost productivity and production's cost increase, due to the use of fungicides. With the initial goal of selecting Citrus sinensis endophytic fungi with antagonistic potential against the phytopathogenic Phyllosticta citricarpa, was obtained 1141 fungical isolates of 443 leaves, representing 1% of a Paraná orchard unaffected by the Citrus Black Spot, an illness caused by this phytopathogen. An isolate, identified as Muscodor sp (LGMF1254), presented the best results in the antagonism test. With the aim of selecting other isolates of the same genus, this isolate was used in the Aroeira medicinal plant (Schinus terebinthifolius Raddi) bioprospection. Another isolate (LGMF1255) was obtained in this prospection, being both of them the very first of the Muscodor genus described in Brazil. Muscodor genus fungi are considered a promise in biological control via the production of volatiles organic compounds (VOC's). This two isolates presented antagonism against P. citricarpa by means of the production of VOC's. Using gas chromatography and mass spectrometry, the main compounds were identified as Thujopsene and Benzenedicarboxylic acid. The identification and the characterization of the isolates were based on macromorphology, micromorphology by means of electronic microscopy scanning and regions sequencing ITS1-5.8S-ITS2 (Internal Transcribed Spacer) of the ribosomal DNA and the rpb2 (RNA polymerase II) gene. The LGMF1254 and LGMF1255 isolates presented absolute ITS identity with M. sutura and M. vitigenus. With the rpb2 gene sequence it was not possible to differentiate the LGMF1254 and LGMF1255 isolates, nevertheless, both presented differences when compared to the same sequence of M. sutura. The rpb2 de M. vitigenus gene sequence is not available in databases. In the results analysis, these first isolates received, in Brazil, the designation of Muscodor vitigenus latu sense, since M. vitigenus is the oldest species of this clade. Keywords: Xylareaceae, Muscodor, Citrus sinensis, Schinus terebinthifolius, Phyllosticta citricarpa, biological control, volatiles organic compounds, DNA sequencing, endophytic fungi, phytopathogenic fungi.

Resumo: O aumento na produção de corantes têxteis acarreta grandes problemas ambientais principalmente em corpos d'água, através dos resíduos formados após tingimento das fibras. Com a baixa eficiência dos métodos atualmente aplicados para a eliminação destes resíduos, a biodegradação tornou-se uma alternativa para combater este tipo de poluição. Dentre os organismos utilizados, os fungos apresentam um grande potencial por estarem naturalmente presentes em áreas degradadas e muitos deles produzirem enzimas que degradam moléculas xenobióticas. Microrganismos endofíticos vêm sendo investigados para aplicação em diferentes áreas de interesse biotecnológico. Neste trabalho, de 35 isolados de fungos endofíticos avaliados, cinco (48J, 14JA, 3HAI, 1IIG, BB1) apresentaram potencial para descoloração do corante Remazol azul. Os isolados foram obtidos a partir da planta medicinal "Espinheira-santa" (Maytenus ilicifolia) e correspondem ao gênero Pestalotiopsis. Destes, dois isolados denominados 14JA e 48J foram selecionados para estudos aprofundados por apresentarem potencial de descoloração superior a 50%. Diferentes condições nos meios de cultura foram testados utilizando a avaliação por superfície de resposta para cada um dos isolados selecionados, visando melhores resultados no processo de descoloração. Para o isolado 14JA, a melhor composição do meio foi com 5g/L de galactose como fonte de carbono, 15g/L de uréia como fonte de nitrogênio e 1mM de cobre e 5mM de manganês suplementando o meio, com pH 7,6, além dos ingredientes usuais e para o isolado 48J, 1g/L de galactose, 15g/L de tartarato de amônio em pH 6. A temperatura de incubação foi de 28°C. A atividade descorante do micélio do meio chegou a 53% para o isolado 14JA e 57% para o isolado 48J. A atividade descorante destes isolados é oriunda da ação de uma lacase, associada ao micélio. Com o objetivo de identificar os isolados utilizados em nível de espécie, foram sequenciadas as regiões ITS, ?- tubulina e EF ("Elongation Factor"). As sequências obtidas foram comparadas com o banco de dados do Genbank e os resultados obtidos para as três regiões não foram coincidentes para a identificação das espécies. Os dados de sequências ITS para este gênero são mais abundantes enquanto as sequências de EF mais raras, sendo assim, foram utilizadas principalmente os resultados das regiões ITS sequeniadas para a identificação das espécies. O isolado 48J apresentou identidade genética de 100% com Pestalotiopsis vismae, Os outros isolados, 14JA, 3HAI, 1IIG e BB1, apresentaram identidade genética entre 97 a 99% com Pestalotiopsis mangiferae. O sequenciamento das outras regiões (EF e Beta-tubulina) resultou em identidade genética com outras espécies de Pestalotiopsis. Devido à complexidade taxonômica deste gênero, não foi possível concluir com certeza a que espécie estes isolados pertencem.

Resumo: A aroeira (Schinus terebinthifolius Raddi), uma Anacardiaceae, arbórea comum na América do Sul e conhecida como aroeira-vermelha, possuem importância comercial por se tratar de uma planta com propriedades medicinais, fitoquímicas e alimentícias, pelo consumo de seus frutos a pimenta rosa. Foi relatada a existência de variação na produção de princípios ativos entre plantas localizadas no Campus Politécnico da UFPR (com produção) e a plantas localizadas em Guaraqueçaba (BOROS, 2007). O gênero Colletotrichum é frequentemente isolado como endófito sendo um dos gêneros dominantes, além disso, também inclui alguns dos principais fungos fitopatogênicos principal agente das antracnoses e causa prejuízos econômicos em plantações por todo o mundo. Espécies deste gênero são de difícil identificação. Pileggi et al. (2008) sugeriram a rápida separação das espécies de Colletotrichum gloeosporioides e C. boninense por meio de características morfológicas. Foram isolados microrganismos endofíticos das plantas de Schinus terebinthifolius Raddi com variação na produção de fitoquímicos. Verificou-se que as plantas analisadas são colonizadas por uma grande variabilidade de microrganismos endofíticos, sendo que os principais gêneros isolados nas plantas com produção de princípio ativo foram Colletotrichum, Phyllosticta, Phomopsis e Pestalotiopsis. Nas plantas sem produção de princípio ativo, os principais gêneros endofíticos isolados foram Phyllosticta e Colletotrichum. As plantas analisadas foram colonizadas principalmente pela espécie C. gloeosporioides, sendo encontrada por meio de marcadores RAPD, grande diversidade genética nestes isolados. Utilizando-se os marcadores morfológicos, foi possíve sugerir três grupos de Colletotrichum: C. gloeosporioides L1, C. gloeosporioides L2 e Colletotrichum sp. Assim, verificou-se que características morfológicas são importantes na identificação das espécies de Colletotrichum, porém são insuficientes. Por meio de PCR espécie específico, confirmou-se a identificação das espécies de C. gloeosporioides e foi identificado um isolado como pertencente à espécie C. boninense. Partículas de RNAdf foram encontradas em 3 linhagens de C. gloeosporioides sem no entanto haver associação com características morfológicas ou perfil de RAPD.

Orientadora : Profª Drª Vanessa Kava-Cordeiro Co-orientadora : Profª Drª Chirlei Glienke Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 30/05/2012 Inclui referências Área de concentração Resumo: A citricultura brasileira é responsável por grande parte da produção mundial de citros. Entre as doenças que acometem a produção destaca-se a Mancha Preta dos Citros (MPC). Esta patologia vegetal de difícil controle é provocada pelo fungo Phyllosticta citricarpa (McAlpine) Van der Aa. Apesar de não deteriorar o conteúdo interno, o patógeno induz o aparecimento de lesões na casca do fruto, o que acarreta recusa para o comércio in natura e em casos mais severos promove a queda prematura dos frutos, reduzindo a produtividade. Restrições fitossanitárias impostas pelos países importadores acarretam a rejeição de cargas inteiras de frutos com sintomas, ocasionando grandes prejuízos aos países produtores. Devido aos problemas ambientais e de saúde, muitos fungicidas utilizados na agricultura vem sendo removidos do mercado, o que cria uma necessidade da substituição alternativa destes agroquímicos para o controle de pragas e patógenos. Neste contexto, a utilização de microrganismos no controle biológico e na bioprospecção de produtos naturais aparece como uma ciência promissora. Microrganismos endofíticos tem se destacado pelo crescente número de novos compostos bioativos obtidos a partir do seu estudo. O uso de microrganismos endofíticos isolados de citros com ação antagônica a P. citricarpa possui oportuno potencial na bioprospecção de compostos para o controle da MPC. Fungos endofíticos de citros foram testados em laboratório quanto ao antagonismo à P. citricarpa. De 68 morfotipos isolados, 6 apresentaram-se promissores em teste de cultura pareada. Em teste de metabólitos voláteis, o isolado LGMF1254 apresentou os melhores resultados. Este fungo foi capaz de causar inibição no diâmetro de colônia de P. citricarpa em 60%, pela produção de metabólitos voláteis. Os voláteis deste fungo também inibiram em 100% a formação de picnídios do fitopatógeno em ensaio com folhas cítricas. Em testes com frutos cítricos em condições controladas, os voláteis não inibiram o aparecimento de lesões em frutos oriundos de regiões com alta incidência da doença. Por outro lado, em teste com indução de lesões em frutos cítricos em condições controladas, houve diminuição em 26% no diâmetro médio das lesões de MPC. Tal resultado é de grande importância uma vez que a exposição de frutos pós-colheita a um composto volátil é de fácil operacionalização, especialmente em frutos destinados a exportação. Este é o primeiro relato de um composto volátil produzido por um fungo endofítico de citros com ação antagonista a Phyllosticta citricarpa. Palavras chave: Phyllosticta citricarpa, metabólitos voláteis, Mancha Preta dos Citros, antagonismo Abstract: The Brazilian citrus industry is responsible for much of the world production of citrus. Among the diseases affecting this production, there is the Citrus Black Spot (CBS). This plant pathology, which is difficult to control, is caused by the fungus Phyllosticta citricarpa (McAlpine) Van der Aa. Although there is no damage in the internal contents, the pathogen induces the appearance of lesions on the fruit skin, which leads to refusal to trade in natura, and in severe cases promotes the premature fall of fruit, reducing productivity. Phytosanitary restrictions imposed by importing countries lead to the rejection of entire loads of fruit with symptoms, causing great losses to producing countries. Due to environmental and health problems, many fungicides used in agriculture have been removed from the market, which generates a necessity of alternative replacement of chemicals to control pests and pathogens. In this context, the use of microorganisms for the biological control and biopanning of natural products appears as a promising science. Endophytic microorganisms have been highlighted by the growing number of new bioactive compounds obtained from these studies. The use of endophytic microorganisms isolated from citrus with antagonistic action against P. citricarpa has appropriate potential of biopanning of the compounds for the control of the CBS. Endophytic fungi isolated from citrus were tested in the laboratory on the antagonism to P. citricarpa. Of 68 endophytic fungi isolated from citrus, 6 showed to be promising in paired culture test. In test of volatile metabolites, the isolate LGMF1254 showed the best results. This fungus was able to cause inhibition in colony diameter of P. citricarpa by 60%, by the production of volatile metabolites. The volatiles of this fungus also inhibited by 100% the formation of pycnidia of the pathogen in citrus leaves essays. In tests with citrus fruit under controlled conditions, the volatiles did not inhibit the appearance of lesions on fruit from regions with high incidence of the disease. On the other hand, in test with lesion induction in citrus under controlled conditions there was 26% decrease of mean diameter of lesions of the CBS. This result is of great importance, since the exposure of postharvest the volatile compound is an easy operation, particularly in fruit intended for export. This is the first report of an endophytic fungal volatile compound with the antagonist action against Phyllosticta citricarpa. Keywords: Phyllosticta citricarpa, volatile compounds, Citrus Black Spot, antagonism

Orientadores : Profª Drª Chirlei Glienke, PhD Pedro Crous Co-orientadora : Profª Drª Vanessa Kava Cordeiro Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 31/07/2012 Inclui referências Área de concentração : Genética Resumo: Espécies do gênero Diaporthe (Phomopsis) têm sido descritas em uma ampla gama de hospedeiros como fitopatogênicas, endofíticas, saprofíticas e recentemente foram descritas causando problemas de saúde em humanos e outros mamíferos. Esse trabalho teve como objetivo reavaliar o gênero Diaporthe através de análise taxonômica e filogenética e esclarecer a taxonomia de Diaporthe endofíticos com potencial antagonista contra Phyllosticta citricarpa agente causal da Mancha Preta dos Citros. No presente estudo nós investigamos 243 isolados usando dados de sequências de DNA em multilocus. Foram selecionados dentre nove genes os cinco melhores para resolução taxonômica. As regiões gênicas selecionadas, região espaçadora interna transcrita do rDNA (ITS1, 5.8S, ITS2), regiões parciais dos genes fator 1-alfa de elongação da tradução (TEF1), beta-tubulina (TUB), histona H3 (HIS) e calmodulina (CAL), resolveram 95 clados. Quinze novas espécies foram descritas, Diaporthe arengae, D. brasiliensis, D. endophytica, D. hongkongensis, D. inconspicua, D. infecunda, D. mayteni, D. neoarctii, D. oxe, D. paranensis, D. pseudomangiferae, D. pseudophoenicicola, D. raonikayaporum, D. schini and D. Terebinthifolii, Quatorze novas combinações foram introduzidas em Diaporthe e a espécie D. anacardii foi epitipificada. A taxonomia de Diaporthe endófitos das plantas medicinais Spondias mombin, Schinus terebinthifolius, Aspidosperma tomentosun e Maytenus ilicifolia com potencial antagonista contra P. citricarpa foi esclarecida. Embora as espécies de Diaporthe no passado tenham sido identificadas principalmente com base na associação com o hospedeiro, os resultados deste estudo confirmam que o mesmo táxon pode estar associado a diferentes hospedeiros, o que sugere que eles se movem livremente entre os mesmos. Em contrapartida, alguns patógenos de plantas e endofíticos parecem ser estritamente restritos a determinado hospedeiro. Devido ao comportamento de diversidade ecológica entre os membros do gênero Diaporthe, esse trabalho sugere que descrições de novas espécies ocorram apenas quando empregados dados moleculares. Abstract: Species in the genus Diaporthe (Phomopsis) have been reported as plant pathogens, non-pathogenic endophytes or saprobes from a wide range of hosts and have also been recently reported as the cause of health problems in humans and other mamals. The current study aimed to resolve the taxonomy and phylogeny of a large collection of Diaporthe species occurring on diverse hosts, either as pathogens, saprobes, or as harmless endophytes, including endophytic Diaporthe with antagonistic potentials against the Phyllosticta citricicarpa the causative agent for Citrus Black Spot. In the present study we investigated 243 isolates using multilocus DNA sequence data. Nine genes were evaluated and the five best have been selected for taxonomic resolution. The selected gene regions were the rDNA internal transcribed spacer (ITS1, 5.8S, ITS2) region, and partial translation elongation factor 1-alpha (TEF1), beta-tubulin (TUB), histone H3 (HIS) and calmodulin (CAL) genes resolved 95 clades. Fifteen new species are described, namely Diaporthe arengae, D. brasiliensis, D. endophytica, D. hongkongensis, D. inconspicua, D. infecunda, D. mayteni, D. neoarctii, D. oxe, D. paranensis, D. pseudomangiferae, D. pseudophoenicicola, D. raonikayaporum, D. schini and D. terebinthifolii. A further 14 new combinations are introduced in Diaporthe, and D. anacardii is epitypified. The taxonomy of endophyte Diaporthe from the medicinal plants Aspidosperma tomentosun, Maytenus ilicifolia, Spondias mombin and Schinus terebinthifolius, with antagonistic potential against P. citricicarpa was clarified. Although species of Diaporthe have in the past chiefly been distinguished based on host association, results of this study confirm several taxa to have wide host ranges, suggesting that they move freely among hosts, frequently co-colonising diseased or dead tissue. In contrast, some plant pathogenic and endophytic taxa appear to be strictly host specific. Given this diverse ecological behaviour among members of Diaporthe, the current study suggests that new species descriptions should only happen when there is molecular data.

Resumo: SEM RESUMO

Resumo: A citricultura brasileira destaca-se no cenario mundial do agronegocio. Entretanto, diversas doencas comprometem esta atividade, como a Mancha Preta dos Citros (MPC), causada pelo fungo Guignardia citricarpa. Por ser considerada praga quarentenaria A1 existem rigorosas barreiras fitossanitarias a aceitacao destes frutos, principalmente por parte de paises europeus. A existencia de fungos morfologicamente semelhantes ao patogeno, como e o caso de Phyllosticta capitalensis, dificulta o diagnostico de G. citricarpa. P. capitalensis e encontrado como endofitico cosmopolita em diversos hospedeiros e como patogeno em algumas especies vegetais. A presenca desta especie em culturas distintas e a coexistencia deste endofito com patogenos (como no caso de G. citricarpa em citros) tem sido alvo de questionamentos pela comunidade cientifica. A planta medicinal cambara (Vochysia divergens Pohl) e uma arvore nativa encontrada no Brasil no Pantanal do Mato Grosso do Sul. Apesar da importancia desta planta para este cossistema, pouco e conhecido sobre sua comunidade endofitica. Nenhum registro existe sobre a presenca do fungo P. capitalensis nestas plantas. Este trabalho teve como objetivo realizar um levantamento preliminar da distribuicao do patogeno G. citricarpa em pomares citricos do Parana, por meio de diferentes metodologias e investigar a presenca de fungos do genero Phyllosticta como endofitos em citros e angueira no Parana e em cambara, bem como verificar a diversidade genetica e estruturacao populacional dos isolados de P. capitalensis, por meio de sequenciamento das regioes ITS1-5,8S-ITS2 do rDNA e parcial do gene EFĄ-1. Para tanto, 1372 folhas de citros e 8 folhas de mangueira das regioes Norte, Noroeste e Sudoeste paranaense, de 26 pomares localizados em dez cidades foram submetidas ao isolamento convencional de endofitos. Dos fungos endofiticos obtidos, 68 foram identificados como P. capitalensis pelo teste de producao de pigmento amarelo em meio Agar-Aveia e PCR Multiplex. Nenhum isolado foi identificado como G. citricarpa. Entretanto, por ciPCR, das 253 folhas de citros de 6 pomares, 11 folhas apresentaram banda correspondente a G. citricarpa. Conclui-se que G. citricarpa parece estar presente de forma latente em pomares citricos assintomaticos no noroeste paranaense e que ciPCR e sensivel na deteccao de G. citricarpa em plantas assintomaticas. Assim, esta metodologia podera ser utilizada na adocao e medidas fitossanitarias para prevenir a manifestacao de sintomas e disseminacao da doenca, na certificacao de pomares e mudas livres do patogeno. De folhas de cambara, das 5 plantas provenientes da regiao o Amolar e 4 plantas da Nhecolandia, foram isoladas 594 linhagens morfologicamente semelhantes ao genero Guignardia e Phyllosticta identificadas por PCR multiplex como P. capitalensis. Este e o primeiro relato da presenca desta especie neste hospedeiro. A arvore filogenetica obtida a partir das sequencias demonstrou que as linhagens sequenciadas apresentaram baixa variabilidade, mesmo entre linhagens procedentes de citros e mangueira paranaenses e as linhagens procedentes de cambara. Ressalta-se que as linhagens foram obtidas de arvores localizadas em condicoes ecologicas distintas sugerindo que esta specie tem capacidade de adaptar-se a diversos ambientes. Como a variabilidade evidenciada foi reduzida, torna-se interessante o sequenciamento de outras regioes e genes, para elucidacao e conhecimento das diferencas existentes.

Resumo: Guignardia citricarpa e um ascomiceto de extrema importancia para a citricultura brasileira, pois e o agente causal da Mancha Preta dos Citros. Alguns isolados desta especie apresentam infeccao por virus de RNA dupla fita (RNAdf) com efeitos fenotipicos ainda desconhecidos. No presente estudo, sete isolados de G. citricarpa, previamente identificados como portadores de RNAdf, foram estudados. Estes isolados foram obtidos de 1996 a 2008, sendo um proveniente do estado do Parana, cinco de Sao Paulo e um da Africa do Sul. Diferentes protocolos de purificacao de RNAdf foram investigados e o melhor rendimento foi com a utilizacao de fenol acido (pH 4,7). Uma das formas de se analisar a influencia do RNAdf e atraves da obtencao de linhagens isogenicas, que diferem entre si pela presenca ou ausencia de RNAdf. Com o objetivo de obtencao de linhagens isogenicas, dois protocolos de cura do RNAdf e um de transmissao de RNAdf foram utilizados. Para a cura, foi feito o repique em meio com ciclohexamida, conforme relatado na literatura. Para G. citricarpa este metodo nao foi eficiente, pois o fungo teve seu crescimento completamente inibido mesmo em baixas concentracoes (0,5 ƒÊg/mL). Outro protocolo de cura utilizado foi repique de pontas de hifas em condicoes de cultura a 35oC, ao inves da cultura a 28oC, criando uma condicao de estresse termico para o fungo. Dos sete isolados investigados, apenas tres apresentaram crescimento nestas condicoes. Destes, dois isolados produziram onze setores que foram investigados quanto a presenca de RNAdf. Em nove nao foram observadas bandas de RNAdf apos eletroforese de gel de agarose. Neste momento, estes foram considerados curados do RNAdf. Para a transmissao, foi necessario selecionar isolados de G. citricarpa com caracteristicas que os diferenciassem, alem da presenca/ausencia de RNAdf. Isolados foram investigados quanto ao padrao de bandas de RAPD, porem, nao foi possivel diferencia-los. Optou-se por utilizar uma caracteristica morfologica, a presenca ou ausencia de halo amarelo em meio aveia. Os isolados com RNAdf sao positivos para esta caracteristica. Foram selecionados doze isolados de G. citricarpa sem RNAdf, negativos para esta caracteristica. Apos avaliar a compatibilidade destes isolados com um isolado com RNAdf, experimentos de transmissao foram conduzidos. 27 colonias que nao formaram halo em meio aveia, provenientes de conidios da area de contato entre os isolados, foram investigadas quanto a presenca de RNAdf e 7 delas (28,92%) receberam RNAdf. As linhagens isogenicas foram investigadas quanto a morfologia da colonia e foi possivel verificar que as linhagens com RNAdf apresentam um menor diametro da colonia apos 15 dias de cultura. Testes estatisticos comprovaram esta observacao. Com o objetivo de sequenciar o genoma deste virus, foi aperfeicoado o protocolo de obtencao de seu cDNA. Este foi obtido e nas proximas etapas desta pesquisa, devera ser sequenciado. Esta sequencia servira para completar a analise filogenetica de virus da familia Totiviridae realizada neste trabalho. Os respectivos fungos hospedeiros destes virus tambem foram enquadrados filogeneticamente por meio de sequencias da regiao ITS1-5,8S-ITS2. No entanto, a analise dessa regiao nao forneceu indicios de co-evolucao entre virus e hospedeiro.