Search

Tese de Doutoramento em Ciências Ramo Biologia Celular, O potencial terapêutico de fitoquímicos em doenças neurodegenerativas é ainda matéria de debate, mas uma grande quantidade de evidências sugerem um papel relevante destes produtos naturais em neuroprotecção. No cômputo geral, tanto os mecanismos subjacentes à morte neuronal em doenças neurodegenerativas, como os mecanismos neuroprotectores potencialmente afectados por extractos de plantas, são ainda pouco compreendidos. Tendo isto em mente, tentou-se primeiro estabelecer uma correlação entre as propriedades antioxidantes de extractos de Hypericum perforatum e as suas potenciais propriedades neuroprotectoras. Na primeira parte deste trabalho, avaliouse o potencial antioxidante de um extracto etanólico total de H. perforatum (TE) e de várias fracções isoladas a partir do mesmo. Observou-se que as propriedades antioxidantes estão associadas ao conteúdo em flavonóides. O passo seguinte consistiu em avaliar qual dos compostos presentes nestas fracções poderia estar a contribuir de forma mais efectiva para as propriedades antioxidantes do TE. Isolando-se compostos fenólicos a partir do TE, observou-se que a quercetina, caempferol e hiperósido foram os antioxidantes mais eficazes. Revelou-se importante estudar as propriedades neuroprotectoras destes extractos e compostos isolados, usando um modelo de neurotoxicidade in vitro que consiste na exposição de neurónios de hipocampo em cultura ao péptido β- amilóide. O TE e fracções contendo hipericinas (V2), glicósidos de flavonóides (V4), aglíconas de flavonóis e, especialmente, biflavonas (V5) reduziram significativamente a morte celular induzida pelo péptido β-amilóide. A quercetina, caempferol e biapigenina, presentes na fracção V5, reduziram significativamente a morte neuronal induzida após exposição ao péptido β-amilóide. Os resultados desta parte do trabalho sugerem que os extractos de H. perforatum possuem compostos neuroprotectores e que estas propriedades estão, pelo menos em parte, relacionadas com as suas propriedades antioxidantes. Uma vez que a exposição ao péptido β-amilóide aumenta a sensibilidade neuronal a agressões excitotóxicas, utilizou-se um modelo de excitotoxicidade in vitro de forma a avaliar se as propriedades neuroprotectoras pudessem afectar mecanismos excitotóxicos. Quando testados individualmente, a quercetina, caempferol e biapigenina (concentração final 10 μM) reduziram significativamente a morte neuronal causada por exposição a 100 μM de cainato e 100 μM de NMDA. Adicionalmente, observouse que a biapigenina preveniu significativamente a ocorrência de delayed calcium deregulation e perda de potencial transmembranar de mitocôndria – ΔΨm. Concluiuse que os efeitos exercidos pela quercetina e pelo caempferol são mediados, principalmente, por mecanismos antioxidantes; enquanto que a biapigenina tem como alvos diferentes vias neuroprotectoras, envolvendo a bioenergética mitocondrial e a homeostasia mitocondrial de cálcio. Estes resultados sugeriram que a homeostasia de cálcio e a função mitocondrial pudessem ser alvos da biapigenina. Observou-se que a biapigenina (10 μM) modula o sistema fosforilativo mitocondrial e que os seus efeitos foram diminuídos pelo atractilosídeo (40 μM) e o ácido bongkréquico (15 μM) (inibidores do ANT), enquanto que a oligomicina (1 mg.mL-1) não teve efeito. Adicionalmente, a biapigenin (10 μM) reduziu a capacidade mitocôndrial de retenção de cálcio, através do aumento do efluxo de cálcio. A ciclosporina A (0,5 μM) e ADP (125 μM) / oligomicina (1mg.mL-1), inibidores de abertura de mPTP, inibiram os efeitos da biapigenina. Estes resultados sugerem que a biapigenina possa modular a homeostasia mitocondrial de cálcio, possivelmente induzindo a abertura transiente do mPTP pela modulação da função do ANT; e que estes efeitos estejam relacionados com as propriedades neuroprotectoras da biapigenina, através da redução da “carga” de cálcio de mitocôndrias sujeitas a condições stressantes. Os nossos estudos suportam a crescente ideia de que H. perforatum possui propriedades neuroprotectoras contra processos neurodegenerativos relacionados com o péptido β-amilóide, excitotoxicidade, stresse oxidativo e apoptose, mas também protegendo a função mitocondrial e indicando um futuro promissor para a pesquisa de terapias baseadas na mitocôndria em perturbações neuronais subjacentes a isquémia e hipóxia., The therapeutic potential of phytochemicals in neurodegenerative diseases is still under debate, but a great deal of evidence suggests a relevant role of these natural products towards neuroprotection under processes of neuronal death. Altogether, both the events underlying neuronal death in neurodegenerative diseases and the potential neuroprotective mechanisms affected by plant extracts are still poorly understood. Concerning this, we first sought out to establish a correlation between the antioxidant properties of extracts of Hypericum perforatum and the possible neuroprotective properties of these extracts. In the first part of this work we evaluated the antioxidant potential of a total ethanolic extract of H. perforatum (TE) and several fractions isolated from the TE. We observed that the antioxidant properties are closely associated with the content in flavonoids. The next step was to assess which of the compounds present in the flavonoid fractions could be contributing more effectively to the observed antioxidant properties of the TE. By isolating phenolic compounds from the TE, we observed quercetin, kaempferol and hyperoside to be the most effective antioxidants It was important to assess the neuroprotective properties of these extracts and isolated compounds using an in vitro model of neurotoxicity, which consisted in the exposure of cultured hippocampal neurons to the peptide β-amyloid. The TE and fractions containing hypericins (V2), flavonol glycosides (V4), flavonol and, namely, biflavone aglycones (V5) significantly reduced peptide β-amyloid-induced neuronal death. Quercetin, kaempferol and biapigenin, present in V5, significantly reduced neuronal death induced by exposure to peptide β-amyloid (25 μM). The results of this part of the work suggest that H. perforatum extracts are endowed with neuroprotective compounds and that these properties are, at least in part, related with their antioxidant properties. Since exposure to peptide β-amyloid increases neuronal susceptibility to excitotoxicity, we used an in vitro model of excitotoxicity as a way to assess if the neuroprotective properties could affect excitotoxic mechanisms. When tested separately, quercetin, kaempferol and biapigenin (10 μM for all compounds) significantly reduced neuronal death caused by 100 μM kainate plus 100 μM NMDA. Additionally, we found that biapigenin was able to significantly prevent the occurrence of delayed calcium deregulation and loss of mitochondrial transmembrane potential – ΔΨm. We concluded that the neuroprotective effects exerted by quercetin and kaempferol are mainly mediated by antioxidant mechanism, whereas biapigenin triggers different neuroprotective pathways involving, mainly, mitochondrial bioenergetics and mitochondrial calcium homeostasis. These results suggested that calcium homeostasis and mitochondrial function could be a target for biapigenin. We observed that biapigenin (10 μM) modulates the mitochondrial phosphorylative system, and that these effects were decreased by atractyloside (40 μM) and bongkrekic acid (15 μM) (inhibitors of the ANT), whereas oligomycin (1 mg.mL-1) had no significant effect. Additionally, biapigenin (10 μM) reduced mitochondrial calcium accumulation capacity, by increasing calcium efflux. Cyclosporin A (0.5 μM), a desensitizer of the mPTP, and ADP (125 μM) plus oligomycin (1mg.mL-1), a more efficient mPTP inhibitor in brain mitochondria, prevented the effects of biapigenin. Taken together, the results suggest that biapigenin might modulate mitochondrial function leading to increased calcium efflux, possibly through transient mPTP opening by modulating ANT function and this could be related with the neuroprotective properties of biapigenin, by reducing the “calcium” burden to mitochondria exposed to stressful conditions. Our studies further support the rising idea that H. perforatum is endowed with neuroprotective properties in major neurodegenerative processes related with peptide β-amyloid, excitotoxicity, oxidative stress and apoptosis, but also by protecting mitochondrial function, indicating a promising future for the research in mitochondria-based therapy of neuronal disorders, underlying ischemia and hypoxia.