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Estudos prévios sugerem que a Angiotensina-(1-7) [(Ang-(1-7)] é capaz de modular o controle simpático cardíaco e sensibilidade beta-adrenérgica. Entretanto, ainda não se sabe se a Ang-(1-7) consegue modular a atividade colinérgica no coração. O objetivo deste estudo foiavaliar a influência da Ang-(1-7) na sensibilidade colinérgica cardíaca de ratos normotensos e hipertensos. Wistar e Ratos Espontaneamente Hipertensos (SHR) foram anestesiados com uretano e submetidos à canulação de artéria femoral e ventrículo esquerdo cardíaco para registro de pressão arterial e intraventricular, respectivamente. Em seguida, foi realizada uma curva dose-resposta de acetilcolina (ACh, 10, 20, 40 e 80 ng/Kg, i.v.) por infusão pela veia femoral. A infusão ocorreu na presença e ausência de Ang-(1-7) (7 x 10-12 mol/min), do antagonista do receptor Mas, A-779 (7 x 10-11 mol/min) ou de Ang-(1-7)+A-779. Os corações isolados foram perfundidos de acordo com a técnica de Langendorff e concentrações crescentes de ACh (10-7 a 10-5 mol/L) foram adicionadas aos corações na presença ou ausência de Ang-(1-7), (2 x 10-11 mol/L), A-779, (2 x 10-10 mol/L), Ang-(1-7)+A-779, antagonista do receptor MrgD, D-PRO (2 x 10-10 mol/L) ou D-PRO+Ang-(1-7). O vasorrelaxamento induzido pela ACh foi mensurado na presença ou ausência da Ang-(1-7) (2 x 10-11 mol/L ou 2 x 10-10 mol/L). Em Wistar e SHR anestesiados, a Ang-(1-7) atenuou o efeito da ACh na queda da pressão intraventricular sistólica, dP/dt máx, e dP/dt mín. Estes efeitos foram bloqueados pelo A-779. A Ang-(1-7) não alterou a resposta hipotensora da ACh em Wistar ou SHR. Nos corações isolados, a Ang-(1-7) também atenuou a redução na pressão intraventricular sistólica, dP/dt máx e dP/dt mín evocados pela ACh. O A-779 bloqueou os efeitos da Ang-(1-7) em corações de Wistar. O A-779 ou D-PRO, per se, não modificaram os efeitos da Ang-(1-7) em corações de SHR, mas na presença do D-PRO, a Ang-(1-7) apresentou efeitos similares. O vasorrelaxamento da aorta induzido pela ACh foi atenuado pela Ang-(1-7) apenas nos SHR. Estes dados sugerem que a Ang-¬(1-¬7) modula o sistema colinérgico cardíaco de forma diferente no modelo de hipertensão primária experimental e de maneira independente de ajustes na pressão arterial. Previous studies suggested that the Angiotensin-(1-7) [(Ang-(1-7)] is able to modulate the cardiac sympathetic control and beta-adrenergic sensitivity. However, whether or not Ang-(1- 7) modulates the cholinergic activity in the heart remains unknown. The aim of this study was to evaluate the influence of Ang-(1-7) upon cholinergic sensitivity of hearts from normotensive and hypertensive rats. Wistar and Spontaneously Hypertensive Rats (SHR) were anesthetized with urethane and underwent catheterization of femoral artery and left ventricle to record the arterial and intraventricular pressure, respectively. Following, a dose-response curve of acetylcholine (ACh, 10, 20, 40 and 80 ng/Kg, i.v. into femoral vein) was performed in the absence or presence of Ang-(1-7) (7 x 10-12 mol/min), Mas receptor antagonist A-779 (7 x 10-11 mol/min) or Ang-(1-7)+A-779. Isolated hearts were perfused according to the Langendorff technique. Increasing concentrations of ACh (10-7 to 10-5 mol/L) were added to the hearts in absence or presence of Ang-(1-7), (2 x 10-11 mol/L), A-779, (2 x 10-10 mol/L), Ang-(1-7)+A-779, MrgD receptor antagonist, D-PRO (2 x 10-10 mol/L) or D-PRO+Ang-(1-7). ACh-induced vasorelaxation was assessed in absence or presence of Ang-(1-7) (2 x 10-11 mol/L or 2 x 10-10 mol/L). Ang-(1-7) attenuated the effect of ACh in decreasing the intraventricular systolic, dP/dt max and dP/dt min in anesthetized Wistar and SHR. These effects were blocked by A-779. Ang-(1-7) did not change the amplitude of the hypotensive effect evoked by ACh in Wistar or SHRs. In isolated hearts, Ang-(1-7) also attenuated the reduction of the intraventricular systolic pressure, dP/dt max and dP/dt min evoked by ACh. A-779 blocked the Ang-(1-7) effects in hearts from Wistar. A-779 or D-PRO did not modify the effects of Ang-(1-7) in hearts from SHR, but in presence of D-PRO, Ang-(1-7) effects were equipotent. Ang-(1-7) attenuated the vasorelaxation induced by ACh in aorta from SHR by only in SHR group. These data suggest that Ang-(1-7) exerts differential modulation of cardiac cholinergic sensitivity during experimental primary hypertension, which is independent on blood pressure. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Made available in DSpace on 2016-08-17T17:11:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_CELSO HENRIQUE SOUZA COSTA BARROS.pdf: 1419210 bytes, checksum: a1822ff5960d1998e001de7cc8bb7379 (MD5) Previous issue date: 2015-02-26 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The objective was to evaluate the effect of inhibition of Angiotensin Converting Enzyme (ACE) with enalapril maleate in follicular development, gene expression of granulosa cells and in vivo production of embryos in cattle. In Experiment 1, we used four Girolando (Bos taurus x Bos indicus) cows to evaluate the potential suppression of cardiocirculatory system and validation of the effective dose of Enalapril Maleate. Was administered 0.2, 0.3, 0.4 and 0.5 mg / kg of enalapril maleate and measured mean arterial pressure (MAP). The best effective dose was 0.4 mg / kg and was used in the experiments 2 and 3. In Experiment 2, we used 20 Nelore (Bos indicus) cows to measure the MAP and ovarian vascular density at 0, 2, 4 7, 10 and 24 hours after Enalapril administration. In Experiment 3, twelve Nelore (Bos indicus) cows were used. These were distributed homogeneously in two treatments: a) Enalapril Group; females subjected to superovulation protocol receiving enalapril maleate (20 mg / 5 ml) from D3 to D7 of protocol and b) Control Group; females subjected to superovulation protocol received placebo (saline 0.9 %) on the same dates and volume. In Experiment 4, follicular fluid and granulosa cells were collected in vivo by ultrasound guided follicular aspiration. Then was performed mRNA extraction and RT-PCR for the expression of enzymes P450 aromatase, angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) and MAS receptor. No effect of enalapril on MAP in animals treated with up to 0.3 mg / kg. Doses of 0.4 and 0.5 significantly decreased MAP in a dose-dependent level (P 0.05). The ovulation rate was significantly higher in the Enalapril group (P 0,05). A taxa de ovulação foi significativamente maior no grupo tratado (P

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Ovulation is controlled by a complex and dynamic interaction of factors, including endocrine and vasoactive mechanisms, cellular messengers and activating enzymes. It is well established that locally produced factors exert pivotal roles during ovulation. Some peptides such as angiotensin II (Ang II) and Natriuretic Peptides (NPs) have been prominent in local regulation of reproductive functions of mammals, beyond its systemic activities. Unlike angiotensin II (AngII), the role of angiotensin-(1-7) [Ang-(1-7)] has not been characterized in the ovary of mono-ovulatory species. In the first study, was evaluated the effect of Ang-(1-7) and its receptor (MAS) in the regulation of the ovulatory cascade. For this we used an in vitro model of supplementation with Ang- (1-7) or blocking its receptor on EREG mRNA expression in granulosa cells. Using an in vivo model, the intrafollicular injection of Ang-(1-7) antagonist (A-779 - MAS receptor inhibitor) was performed to evaluate the ovulation rate. Results showed that the Ang- (1-7) and A-779 inhibitor when in vitro culture, were not able to regulate to EREG mRNA expression. Likewise, the intrafollicular injection of A-779 did not block ovulation before the expected time of LH peak, suggesting that Ang-(1-7) has no role in the early ovulatory cascade in cattle. In the second experiment, the aim was to evaluate the pattern of mRNA expression in bovine granulosa cells for the Natriuretic Peptides Precursors (NPPs), receptors (NPRs) and key enzymes of this system after GnRH-induced ovulation in vivo. Using in vivo model main results have been shown the presence of several components of NPs system during ovulation in cattle, as well as increased mRNA expression for NPPC (natriuretic peptide precursor C) in granulosa cells after induction of ovulation with GnRH / LH. These results provide the first evidence that the C-type natriuretic peptide (NPC) is upregulated by LH and may be involved in ovulation and bovine luteinizing. Third study was conducted to answer like LH controls the mRNA expression for NPPC if this is up-regulated through EGF receptor (EGF-R). Moreover, we evaluated if the NPC regulates genes in ovulatory cascade and blockade EGF-R is capable of altering ovulation rate. For this we used an in vitro model of granulosa cell culture from large follicles (> 12 mm) and in vivo models to study ovulation, combined with intrafollicular injection and follicular dynamics and / or ovariectomy at strategic times. Our main results were: NPC does not regulate mRNA expression for amphiregulin (AREG) and EREG in vitro; NPPC mRNA coding is regulated by EGF-R but block EGF-R was not able to change the ovulation rate in bovines. These results suggest that the regulation and function of NPs during ovulation may differ between monovular and polyovular species. A ovulação é controlada por uma complexa e dinâmica interação de fatores, incluindo mecanismos endócrinos e vasoativos, mensageiros celulares e enzimas ativadoras. Fatores produzidos localmente exercem papel essencial durante o período ovulatório. Alguns peptídeos como Angiotensina II (AngII) e os Peptídeos Natriuréticos (NPs) têm se destacado na regulação local das funções reprodutivas, além de suas atividades sistêmicas. Ao contrário da AngII, a função da Angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)] ainda não está caracterizada no ovário de espécies monovulatórias, como o bovino. No primeiro estudo foi avaliado o efeito da Ang-(1-7) e de seu receptor (MAS) na regulação da ovulação. Para isso foi realizada a suplementação com Ang-(1-7) ou bloqueio de seu receptor, em células da granulosa cultivadas in vitro, sobre a expressão de RNAm para epirregulina (EREG marcador inicial do processo de ovulação). Utilizando um modelo in vivo, foi realizada a injeção intrafolicular do inibidor do receptor MAS (A-779) para avaliar a taxa de ovulação. Os resultados demonstraram que a Ang-(1-7) e o inibidor A-779 quando em cultivo in vitro, não foram capazes de regular a expressão de RNAm para EREG. Da mesma forma que injeção intrafolicular de A-779 não inibiu o processo ovulatório, indicando que a Ang-(1-7) não possui papel relevante no início da cascata ovulatória em bovinos. No segundo estudo o objetivo foi caracterizar a expressão dos NPs, seus receptores e enzimas convertases durante a ovulação induzida a partir de GnRH/LH em bovinos. Utilizando modelo in vivo foram demonstrados como principais resultados a presença de vários componentes do sistema NPs durante a ovulação em bovinos, bem como um aumento na expressão de RNAm para NPPC (precursor do peptídeo natriurético tipo C) após indução da ovulação GnRH / LH em células da granulosa. Esses resultados fornecem a primeira evidência que o peptídeo natriurético tipo C (NPC) é regulado positivamente pelo LH e pode estar envolvido na ovulação e luteinização de bovinos. O terceiro estudo foi realizado para responder como ocorre a regulação do RNAm para NPPC pelo LH, se essa regulação é via receptor de EGF (EGF-R). Além disso, avaliamos se o NPC regula genes da cascata ovulatória e se o bloqueio EGF-R é capaz de alterar a taxa de ovulação. Para isso foram utilizados modelos in vitro de cultivo de células da granulosa de folículos grandes (> 12 mm) e modelos in vivo para estudo da ovulação aliados à injeção intrafolicular com ovariectomia em momentos estratégicos e/ou dinâmica folicular. Nossos principais resultados foram: NPC não regula a expressão de RNAm para anfirregulina (AREG) e EREG in vitro; RNAm para NPPC é regulado via EGF-R porém o bloqueio de EGF-R não foi capaz de alterar a taxa de ovulação em bovinos. Estes resultados sugerem que a regulação e função dos NPs durante a ovulação pode diferir entre espécies mono e multiovulatórias.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico The Renin-Angiotensin System (RAS) has been associated with various reproductive functions, including the ovulatory cascade. Unlike angiotensin II (AngII), the role of angiotensin-(1-7) [Ang-(1-7)] has not been characterized in the ovary of mono-ovulatory species. The objective of this study was to determine the Ang-(1-7) concentration in follicular fluid and Ang-(1-7)-related enzymes and MAS receptor mRNA expression during the ovulatory process in cattle. Forty cows were synchronized and those with follicular diameter ≥ 12 mm received GnRH analog (i.m.) to induce a LH peak and were ovariectomized at different periods (0, 3, 6, 12 and 24 h). Follicular fluid was stored to measure Ang-(1-7). Theca and granulosa cells were collected to evaluate gene expression by RT-qPCR assay. In a second experiment, the effect of Ang-(1-7) and A-779 (MAS receptor inhibitor) on the epiregulin mRNA expression by granulosa cells was evaluated in vitro. In the third experiment, the hypothesis that Ang-(1-7) is essential for ovulation was tested using an in vivo model by injecting A-779 intrafollicularly. Twenty synchronized cows were intrafollicularly injected with A-779 or saline 0.9% (control group) when the follicles reached a diameter of at least 12 mm and were challenged with an IM application of GnRH analogs. The levels of Ang-(1-7) increased in the follicular fluid at 24 h post-treatment (p < 0.05). Messenger RNA expression of MAS, ECA2, NEP and PEP was detected in theca and granulosa cells at all periods after GnRH injection. In granulosa cells, ACE2, NEP and PEP mRNA expression was regulated in different moments after GnRH treatment (p < 0.05). The addition of Ang-(1-7) or A-779 was not able to change the pattern of Ereg mRNA expression in our granulosa cell culture system. The intrafollicular application of A-779 (10-5M) did not block ovulation when performed before the expected peak of LH (100% of cows ovulated in treated and control groups). Differential expression of ACE2, NEP and PEP in granulosa cells and increased concentrations Ang-(1-7) next ovulation may indicate a role of this peptide in ovulation in cattle. O Sistema Renina-Angiotensina (RAS) tem sido relacionado com diversas funções reprodutivas, incluindo a cascata ovulatória. Ao contrário da Angiotensina II (AngII), a função da Angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)] ainda não está caracterizada no ovário de espécies mono-ovulares como a bovina. Este estudo teve por objetivo determinar se os diferentes tipos celulares de folículos pré ovulatórios expressam o receptor MAS para Ang-(1-7) e a enzima conversora de angiotensina 2 (ECA2). Além disso, foi investigado se esses genes são induzidos por LH durante o processo ovulatório. Quarenta vacas foram sincronizadas e aquelas que alcançaram diâmetro folicular ≥ 12 mm receberam uma aplicação IM de GnRH e foram ovariectomizadas via colpotomia em diferentes momentos (0, 3, 6, 12 e 24 h) após o GnRH. O líquido folicular foi recuperado para dosagem de Ang-(1-7). As células da teca e da granulosa foram isoladas e submetidas à extração de RNA e transcrição reversa. A expressão relativa dos genes foi realizada por PCR em tempo real. Em um segundo experimento, utilizando um modelo in vitro de cultivo de células de folículos ≥ 12mm, buscou-se avaliar o efeito da Ang-(1-7) ou do bloqueio de seu receptor (MAS) na expressão de RNAm para epirregulina (Ereg). No terceiro experimento, utilizando o modelo de injeção intrafolicular in vivo, foi testada a hipótese de que Ang-(1-7) é essencial para a ovulação em bovinos. Vinte vacas foram sincronizadas e quando os folículos atingiram um diâmetro mínimo de 12 mm, receberam os tratamentos com A-779 (inibidor do receptor MAS) ou solução salina 0,9% (grupo controle) e foram no momento da injeção intrafolicular desafiados com uma aplicação IM de análogo de GnRH. Foi detectada a presença de Ang-(1-7) no líquido folicular, sendo que seus níveis foram constantes até 12 h após o GnRH e aumentando (P