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Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Leishmania é o agente etiológico das leishmanioses, uma doença infecciosa grave. Durante o ciclo de vida, o parasito passa por diferentes ambientes, se adaptando aos mesmos por alterações na regulação da expressão gênica, transcrição, tradução e metabolismo. A regulação da expressão gênica em tripanosomatídeos ocorre principalmente de maneira pós-transcricional, através de mecanismos de estabilização dos mRNAs e da regulação da tradução. Análises de proteômica realizadas pelo nosso grupo revelaram um perfil de acetilação diferencial de proteínas entre os três estágios principais de Leishmania mexicana (procíclico, metacíclico e amastigota) sugerindo um papel central dessa modificação na diferenciação do parasito. A acetilação de lisina é regulada por duas enzimas, lisinas acetiltransferases (KATs), que adicionam grupos acetil nos resíduos de lisina, e lisinas desacetilases (KDACs), que removem estes grupos. As KDACs são divididas em duas classes: dependentes de NAD+ (sirtuínas) e de zinco (DACs). Neste trabalho, as proteínas NAT10 do grupo das KATs e DACs (1, 3, 4 e 5) do grupo das KDACs foram selecionadas com objetivo central de investigar a importância dessas proteínas na biologia de L. mexicana. Para isso, o sistema de edição gênica CRISPR-Cas9 foi utilizado para obtenção de linhagens hemi-nocautes, nocautes e fluorescentes “tagged”. Utilizando as linhagens fluorescentes “tagged” evidenciamos que DAC1 e DAC5 são citoplasmáticas, enquanto DAC3, DAC4 e NAT10 têm localização nuclear, em todas as formas do parasito. Curiosamente, DAC3 é encontrada em regiões de eucromatina, enquanto o DAC4 ocupa predominantemente as regiões de heterocromatina. Além disso, descobrimos que DAC1, DAC3 e NAT10 são essenciais para a sobrevivência das formas procíclicas de L. mexicana. As análises fenotípicas dos parasitos mutantes revelaram que DAC1, DAC3, DAC5 e NAT10 afetam a multiplicação das formas procíclicas, enquanto DAC1 e DAC5 influenciam na diferenciação das formas procíclicas para metacíclicas. DAC3, DAC5 e NAT10 estão envolvidas diretamente na diferenciação das formas procíclicas para amastigotas. Durante a diferenciação das formas amastigotas em procíclicas observamos que todas as DACs estão envolvidas, assim como no processo de invasão e multiplicação em macrófagos derivados da medula óssea. Além disso, realizamos análises de ciclo celular e verificamos NAT10 altera a duração das fases G1 e S do parasito. Por fim, a depleção das DACs altera os níveis de proteínas acetiladas. Em conjunto, nossos resultados indicam que a regulação dos níveis de acetilação proteica e de RNA é importante na diferenciação de L. mexicana, abrindo a oportunidade para novos estudos sobre as DACs e NAT10 como potenciais alvos de drogas. 2019/13765-1

Orientador: Adriano Cappellazzo Coelho Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A leishmaniose é uma doença parasitária causada por protozoários flagelados do gênero Leishmania, que afeta milhões de indivíduos em todo o mundo em áreas tropicais e subtropicais. No Brasil, o número de casos da doença tem aumentado nos últimos anos, principalmente em áreas urbanas. O tratamento das leishmanioses no Brasil é limitado a fármacos que, além do alto custo e efeitos colaterais, são administrados por via parenteral. Recentemente, dois novos fármacos foram aprovados no tratamento da leishmaniose visceral na Ásia: a miltefosina e a paromomicina (PAR). Uma vez que estes fármacos não são utilizados no tratamento das leishmanioses no Brasil, faz-se necessário avaliar a eficácia destes fármacos como alternativa de tratamento no país. Neste trabalho foi avaliada a suscetibilidade à PAR in vitro em isolados clínicos de pacientes com leishmaniose tegumentar e cepas referência das espécies de Leishmania endêmicas no Brasil, bem como a sua eficácia in vivo em modelo experimental murino para uma das espécies que causa a leishmaniose tegumentar no país: L. (Leishmania) amazonensis. Pelo método de amplificação do gene hsp70 seguido de digestão com enzima de restrição HaeIII e do sequenciamento de DNA do espaçador interno transcrito (ITS), foi possível identificar as espécies dos 16 isolados clínicos utilizados neste estudo. Destes isolados, 8 deles foram identificados como sendo L. (Viannia) braziliensis, 5 deles L. (L.) amazonensis, dois deles L. (V.) guyanensis e um deles L. (V.) shawi. Os valores de EC50 de PAR em promastigotas de isolados clínicos e cepas referência do parasito variaram de 4,95 a 205,03 µM, enquanto que os valores de EC50 na forma amastigota variaram de 0,19 a 111,2 µM. Os ensaios in vivo foram realizados utilizando camundongos BALB/c infectados com L. (L.) amazonensis e tratados com 75, 150, 300 e 600 mg/kg/dia de PAR durante 14 dias por via intraperitoneal. Os animais tratados com as dosagens de 300 e 600 mg/kg/dia apresentaram redução significativa no tamanho da lesão. Além disso, o grupo tratado com 600 mg/kg/dia teve uma diminuição na carga parasitária em cerca de 90%. Um segundo ensaio in vivo realizado com animais infectados com a cepa referência de L. (L.) amazonensis e um isolado clínico da mesma espécie tratados com dosagens de 150 e 600 mg/kg/dia de PAR, demonstrou que o isolado clínico, mais sensível à PAR na forma amastigota in vitro, apresentou redução significativamente maior da carga parasitária quando comparado com a cepa referência, sugerindo uma possível correlação entre a atividade do fármaco in vitro e a eficácia do tratamento in vivo. Os resultados deste trabalho podem contribuir na avaliação do potencial de uso da PAR na quimioterapia da leishmaniose tegumentar no Brasil Abstract: Leishmaniasis is a parasitic disease caused by flagellated protozoa of the genus Leishmania that affects millions of people worldwide in tropical and subtropical areas. In Brazil, the number of cases of disease has increased in recent years, especially in urban areas. The treatment of leishmaniasis in Brazil is limited to drugs that are administered parenterally, are expensive and cause several side effects. Recently, two drugs were approved as alternatives to the treatment of visceral leishmaniasis in Asia: miltefosine and paromomycin (PAR). Although these drugs have not yet been approved for the treatment of leishmaniasis in Brazil, it is necessary to evaluate the efficacy of these drugs as alternative for the treatment of leishmaniasis in Brazil. In this study, the susceptibility to PAR in vitro of clinical isolates of patients with tegumentary leishmaniasis and reference strains of endemic Leishmania species in Brazil was evaluated, as well as its in vivo efficacy in a murine experimental model for one of the species that causes cutaneous leishmaniasis in Brazil: L. (Leishmania) amazonensis. Typing of 16 clinical isolates by PCR of hsp70 gene followed by digestion with the restriction enzyme HaeIII and DNA sequencing of ITS (internal transcribed spacer) allowed the identification of the species among these isolates: 8 isolates were L. (Viannia) braziliensis, 5 isolates L. (L.) amazonensis, two isolates L. (V.) guyanensis and one isolate L. (V.) shawi. The EC50 values of PAR in promastigotes of clinical isolates and reference strains ranged from 4.95 to 205.03 µM, while the EC50 values in intracellular amastigotes ranged 0.19 to 111.2 µM. In vivo studies were performed using BALB/c mice infected with L. (L.) amazonensis and treated with doses of 75, 150, 300 and 600 mg/kg/day of PAR for 14 days administered intraperitoneally. Animals treated with dosages of 300 and 600 mg/kg/day presented a significant reduction in lesion size. In addition, animals treated with 600 mg/kg/day had a reduction in parasite burden of 90%. A second in vivo trial of animals infected with the reference strain of L. (L.) amazonensis and a clinical isolate of the same species treated with dosages of 150 and 600 mg/kg/day of PAR showed that the clinical isolate, more sensitive to PAR in amastigote form in vitro, showed significantly greater reduction in parasite load when compared to the reference strain, suggesting a possible correlation between drug activity in vitro and in vivo treatment efficacy. The results of this study will contribute to evaluate the potential use of PAR in chemotherapy of cutaneous leishmaniasis in Brazil Mestrado Relações Antrópicas, Meio Ambiente e Parasitologia Mestra em Biologia Animal FAPESP 2018/03299-0