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The plant Calotropis procera synthesizes a variety of secondary metabolites, such as cardenolides, a type of toxic metabolite of defense against herbivores. Thirty-five cardenolides have already been identified in C. procera and had their molecular structure resolved. Cardenolides are toxic by inhibiting the enzymatic activity of ATPases of Na+/K+, causing cell death. However, herbivorous insects Danaus plexippus (Lepidoptera), Oncopeltus fasciatus and Aphis nerii (Hemiptera) are capable of using C. procera as host. Why does the plant synthesize a variety of cardenolides? Which are the structural and chemical characteristics of these molecules? How do these herbivores prevent the action of these metabolites? In this work, the C. procera cardenolides were classified in three groups, one of them with three subgroups, according to their structural characteristics. The hydropaticity index was defined through the partition coefficient log (Log P). Three-dimensional (3D) models of the ATPα1 of Na+/K+ from D. plexippus, O. fasciatus and A. nerii were constructed through comparative modeling using the SWISS-MODEL and Phyre2 servers, and were subsequently validated and refined. After refinement, the 3D structures were validated again. The binding site of cardenolides in the 3D structures of these three enzymes was identified and analyzed. With the aid of structural data described in the literature about the binding of ouabain (the most commonly used cardenolides for toxicity studies) in ATPα1 of Na+/K+, it was proposed that the resistance of D. plexippus, O. fasciatus, and A. nerii to the toxic effects of C. procera cardenolides is also related to amino acid substitutions with different chemical properties in specific enzyme sites. Probably, substitutions in positions 104, 115 and 302 have the higher effect on the increased insensitivity of the ATPα1 of Na+/K+ of these herbivores to cardenolides. Through molecular docking of the 3D structures of these ATPα1 of Na+/K+ with the cardenolides from C. procera was possible to establish a relationship between the specificity of polarity of the cardenolides sequestered by these herbivores and the selectivity of these metabolites about their ATPα1 of Na+/K+. Therefore, it is presumable that cardenolides that are not sequestered by these herbivores can bind in active site of their ATPα1 of Na+/K+, thus the selectivity of these metabolites to these enzymes is directly related to their polarity. It is concluded that C. procera diversifies the cardenolides structure in an attempt to any of them can interact with ATPα1 of Na+/K+ of the herbivores and promote their chemical defense. Insects, in turn, achieve the resistance excluding potentially toxic cardenolides from their bodies and sequestering those that are not selective for them or modifying the structure of the cardenolides, although this latter strategy is not metabolically known. A planta Calotropis procera sintetiza uma variedade de metabólitos secundários, dentre os quais se destacam os cardenolídeos, um tipo de metabólito tóxico de defesa contra herbívoros. Trinta e cinco cardenolídeos já foram identificados em C. procera e tiveram sua estrutura molecular estabelecida. Cardenolídeos são tóxicos ao inibir a atividade enzimática de ATPases Na+/K+, provocando a morte celular. Entretanto, os insetos herbívoros Danaus plexippus (Lepidoptera), Oncopeltus fasciatus e Aphis nerii (Hemiptera) são capazes de utilizarem C. procera como hospedeira. Porque a planta sintetiza tamanha variedade de cardenolídeos? Quais as características estruturais e químicas destas moléculas? Como esses herbívoros driblam a ação destes metabólitos? Neste trabalho, os cardenolídeos de C. procera foram classificados em três grupos, um deles com três subgrupos, de acordo com as suas características estruturais. O índice de hidropaticidade foi definido por meio do log do coeficiente de partição (Log P). Modelos tridimensionais (3D) das ATPα1 de Na+/K+ de D. plexippus, O. fasciatus e A. nerii foram construídos através da modelagem comparativa utilizando os servidores SWISS-MODEL e Phyre2, e posteriormente foram validados e refinados. Após refinamento, as estruturas 3D foram novamente validadas. O sítio de ligação de cardenolídeos nas estruturas 3D dessas três enzimas foi identificado e analisado. Com auxílio de dados estruturais descritos na literatura, sobre a ligação de ouabaína (cardenolídeo mais utilizado para estudos de toxicidade) em ATPα de Na+/K+, foi proposto que a resistência de D. plexippus, O. fasciatus e A. nerii aos efeitos tóxicos dos cardenolídeos de C. procera também está relacionada às substituições de aminoácidos com propriedades químicas diferentes em locais específicos das enzimas. Provavelmente, substituições nas posições 104, 115 e 302 exerçam o maior efeito sobre o aumento da insensibilidade das ATPα de Na+/K+ desses herbívoros aos cardenolídeos. Por meio dos procedimentos de docking molecular das estruturas 3D dessas ATPα1 de Na+/K+ com os cardenolídeos de C. procera foi possível estabelecer uma relação entre a especificidade na polaridade dos cardenolídeos sequestros por esses herbívoros e a seletividade desses metabólitos sobre suas ATPα de Na+/K+. Logo, é presumível que os cardenolídeos que não são sequestrados por esses herbívoros sejam capazes de se ligarem no sítio ativo de suas ATPα de Na+/K+, de modo que a seletividade desses metabólitos sobre essas enzimas está diretamente relacionada à sua polaridade. Conclui-se que a C. procera diversifica as estruturas dos cardenolídeos na tentativa de que algum deles possa interagir com ATPases de Na+/K+ de herbívoros e promover sua defesa química. Os insetos, por sua vez, alcançam a resistência, excluindo de seu organismo os cardenolídeos potencialmente tóxicos e sequestrando aqueles que não são seletivos para eles ou ainda modificando a estrutura do cardenolídeo, embora esta última estratégia não seja metabolicamente conhecida.

Extracts and secondary metabolites from plants can act as feeding deterrents, toxic agents or developmental disruptors in insects. In this study, the experimental milkweed bug Oncopeltus fasciatus (Dallas), (Hemiptera) was used to evaluate the activities of crude ethanol extract and fractions, obtained from flowers or stems of Eremanthus erythropappus (DC.) MacLeisch (Asteraceae), on its mortality and development. Butanol fraction from ethanol extract showed toxicity against nymphs of O. fasciatus as well as growth inhibition activity. The results imply that E. erythropappus butanol fraction has active substances on this insect growth development physiology. Atividade Antimuda de Eremanthus erythropappus (DC.) MacLeisch Resumo. Os extratos e metabólitos secundários de plantas podem agir como agentes tóxicos e inibidores do da alimentação e do desenvolvimento em insetos. Neste estudo foi utilizado Oncopeltus fasciatus (Dallas) (Hemiptera) como modelo experimental a fim de avaliar as atividades do extrato etanólico bruto e frações obtidos das flores ou caules de Eremanthus erythropappus (DC.) MacLeisch (Asteraceae), na mortalidade e sobre o desenvolvimento do inseto. A fração butanólica obtida do extrato etanólico mostrou toxidade sobre as ninfas de O. fasciatus, bem como atividade de inibição do crescimento. Os resultados sugerem que a fração butanólica de E. erythropappus possui substâncias ativas sobre a fisiologia, crescimento e desenvolvimento de insetos.

A Canavalia ensiformis é uma leguminosa altamente resistente ao ataque de insetos, e contribuindo para essa resistência, a planta possui isoformas de urease, que são proteínas que apresentam atividade entomotóxica. Essa toxicidade é dependente de uma ativação proteolítica da molécula por enzimas digestivas do inseto, do tipo catepsinas, e subseqüente liberação de peptídeos internos, os quais possuem a ação inseticida. A partir dessa informação foi construído um peptídeo recombinante com base na seqüência da urease, chamado Jaburetox-2Ec, o qual é tóxico para insetos resistentes e suscetíveis a urease intacta. O hemíptero Oncopeltus fasciatus é um dos nossos modelos de estudo. O objetivo deste trabalho foi identificar as principais peptidases digestivas de ninfas de O. fasciatus, auxiliando na elucidação do mecanismo de ação inseticida dessas toxinas, além de estudar os efeitos da urease intacta e do peptídeo derivado sobre órgãos isolados. Quando alimentadas com diferentes concentrações da urease majoritária de C. ensiformis (JBU), ninfas de O. fasciatus apresentam uma taxa de mortalidade superior a 80% após duas semanas, assim como quando injetadas com Jaburetox-2Ec apresentam uma taxa de mortalidade de 100% após 48 horas. Ninfas de quarto instar foram dissecadas para retirada dos intestinos e obtenção de um extrato protéico bruto, o qual foi utilizado para a realização dos ensaios enzimáticos. O extrato bruto foi capaz de hidrolisar in vitro a JBU e liberar peptídeos com massa semelhante a peptídeos entomotóxicos já conhecidos, reconhecíveis pelo anticorpo anti-Jaburetox-2Ec. A atividade proteolítica majoritária sobre substratos protéicos, em pH 4.0, foi bloqueada por inibidores específicos de aspártico e cisteíno peptidases, não sendo afetada EDTA, inibidor de metalopeptidases. Ao utilizar-se um substrato específico para cisteíno peptidases, o pico majoritário observado foi em pH 5.0, sendo a atividade completamente inibida por E-64 (inibidor de cisteíno peptidases) em todos os valores de pH testados. Ao utilizarse um substrato desenhado para aspártico peptidases, a atividade majoritária foi novamente em pH 5.0, sendo parcialmente inibida por Pepstatina A (inibidor de aspártico peptidases) é parcial em todos os valores de pH testados. Substratos sintéticos correspondentes às regiões N e C-terminal que flanqueiam o peptídeo inseticida na molécula de urease também foram testados. O primeiro não foi hidrolisado pelo extrato bruto, enquanto que o segundo apresentou um pico de atividade majoritário em pH 4.0-5.0, com inibição total por E-64. O extrato bruto foi submetido a um processo de purificação de duas etapas, uma troca iônica e uma cromatografia de gel filtração. A purificação foi monitorada utilizando-se um substrato específico para cisteíno peptidases, e a fração da gel filtração com maior atividade apresentou massa molecular de 22 kDa. A fração ativa foi submetida a um gel de poliacrilamida, a banda foi excisada e digerida com tripsina, e os peptídeos resultantes foram então analisados por espectrometria de massas. Uma catepsina L foi identificada, com massa molecular semelhante ao previsto pela gel filtração. Os resultados sugerem que a susceptibilidade de ninfas de O. fasciatus a JBU é, como em outros modelos de insetos, relacionada à proteólise limitada da proteína ingerida e posterior liberação de peptídeos inseticidas por enzimas do tipo catepsinas. Diferentes tipos de catepsinas podem estar liberando os peptídeos inseticidas a partir da urease, sendo que um cisteíno peptidase, tipo Catepsina L, pode ter um papel importante na ativação da proteína em O. fasciatus. Adicionalmente fizemos localização in situ de Jaburetox-2Ec após injeção na hemolinfa e observamos imunoreatividade no sistema nervoso central de ninfas de O. fasciatus, indicando que o peptídeo pode estar agindo neste local. Além dos efeitos tóxicos causados pelos peptídeos derivados da urease, já foram relatados em outros modelos, efeitos causados pela molécula intacta. Testamos, então, o efeito da JBU sobre contrações de intestinos ex vivo de O. fasciatus. Observamos que a urease tem a capacidade de inibir, em algumas concentrações, o efeito excitatório da serotonina sobre as contrações musculares, atividade que não é compartilhada com Jaburetox- 2Ec. Concluímos com os dados gerados nesse estudo, e em estudos prévios, que a toxicidade das ureases não só é devida à ativação proteolítica e liberação de peptídeos, mas também à proteína intacta, que parece estar causando distúrbios em processos de sinalização celular. Jackbean (Canavalia ensiformis) is a legume highly resistant to insects. Contributing to this resistance, the plant contains urease isoforms that are entomotoxic upon the release of internal peptides by insect’s digestive cathepsin-like enzymes. A recombinant peptide, called Jaburetox-2Ec, was built based on urease’s sequence and this peptide is poisonous to all insects tested. The hemipteran bug Oncopeltus fasciatus is one of our models of study. In this work we aimed to identify the main digestive peptidases of O. fasciatus, helping to elucidate the insecticidal mechanism of action of these toxins, and to test the effects of urease and derived peptides upon isolated organs. When fed with different Jackbean major urease (JBU) concentrations, O. fasciatus nymphs showed a mortality rate higher than 80% after two weeks. When injected with Jaburetox-2Ec the mortality rate was 100% after 48 hours. Homogenates of midguts dissected from fourth instars were used to perform proteolytic activity assays. The homogenates hydrolyzed JBU in vitro, yielding a fragment similar in size to known entomotoxic peptides. The major proteolytic activity at pH 4.0 upon protein substrates was blocked by specific aspartic and cysteine peptidases inhibitors, but was not affected by a metalopeptidase inhibitor (EDTA). The optimal activity upon a fluorogenic substrate specific for cysteine peptidases was at pH 5.0, being completely inhibited by E-64 at all pH values tested. The optimal activity upon a fluorogenic substrate designed for aspartic peptidases was again at pH 5.0, being partially blocked by Pepstatin A in the pH range 2 to 10. Fluorogenic substrates corresponding to the Nand C-terminal regions flanking the entomotoxic peptide within urease sequence were also tested. While the N-terminal peptide was not hydrolyzed by the midguts homogenate, the C-terminal peptide was cleaved maximally at pH 4.0-5.0, with complete inhibition by E-64. The midguts homogenate was submitted to ion exchange chromatography followed by gel filtration yielding a 22 kDa protein peak. After SDSPAGE this band was excised from the gel, digested with trypsin and the peptides were analyzed by mass spectrometry. A Cathepsin L was identified. The results suggest that susceptibility of O. fasciatus nymphs to JBU is, like in other insect models, due to limited proteolysis of ingested protein and subsequent release of entomotoxic peptides by Cathepsin-like digestive enzymes. Moreover, we performed in situ localization of Jaburetox-2Ec after injection in the hemolymph, and we observed immunoreactive processes in O. fasciatus nymphs’ central nervous system, indicating that the peptide could be acting there. Besides the poisonous effects caused by urease derived peptides, effects caused by the intact molecule were already described. Hence we tested urease’s effect upon O. fasciatus isolated midguts contractions. We observed that urease is capable of inhibiting, at some concentrations, serotonin excitatory effect on muscular contractions, activity that was not shared with Jaburetox-2Ec. We concluded from the data of this study and previous studies, that urease’s toxicity is not only due to proteolytic activation and release of toxic peptides, but also to the intact molecule, which seems to be causing disturbances in cell signalling.