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Com o aumento da população mundial existe cada vez mais uma procura por alimentos mais seguros microbiologicamente, com melhor qualidade e com um menor tempo de produção. Nesse âmbito a produção intensiva de gado tornou-se uma indústria em crescimento para suprimir esta lacuna. No entanto, por vezes, os microrganismos patogénicos infetam estas produções e condicionam a saúde do animal e o seu uso posterior como alimento. Neste aspeto o diagnóstico rápido de modo a identificar o agente patogénico que infeta o animal torna-se essencial para o seu tratamento. Assim, o objetivo desta dissertação foi a pesquisa e o diagnóstico de microrganismos patogénicos em amostras de animais (suínos e aves) de gado intensivo pelo método de PCR em tempo real. As análises foram realizadas no Laboratório Tomaz, Leiria, que presta entre outros serviços análises veterinárias. Deste modo, foram analisadas amostras de órgãos/tecidos de suínos para o despiste de Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV), de Leptospira spp. e de Porcine Circovirus Type 2 (PCV2), amostras de soros de suínos para despiste de PRRSV e PCV2, fezes de suínos para pesquisa de fatores de virulência de E. coli e amostras de fluidos orais de aves para pesquisa de Leptospira spp. e de Mycoplasma gallisepticum e Mycoplasma synoviae. Aquando da sua receção as amostras de órgãos/tecidos foram armazenadas a -20ºC e analisadas entre 48-72h após a colheita enquanto as amostras de soros, fluidos orais e fezes foram armazenadas a 4ºC e analisadas entre 24-72h após a colheita. Para a análise do PRRSV, extraiu-se o RNA das amostras enquanto que para a análise de PCV2, Leptospira, fatores de virulência da E. coli e de M. gallisepticum e M. synoviae foi extraído o DNA. Para a deteção destes patogénicos, kits específicos foram usados segundo as instruções do fabricante e os alvos de deteção pelo método de qPCR foram: a ORF7 para o PRRSV, a ORF2 para o PCV2, o gene lipL32 para a Leptospira patogénica e os genes mgc2 e vlhA para a deteção de Mycoplasma gallisepticum e Mycoplasma synoviae, respetivamente. Para a pesquisa de fatores de virulência de E. coli os genes associados às adesinas fimbriais F4 e F18 foram os pesquisados. Após a pesquisa, foi detetado a presença de PRRSV e PCV2 em amostras de soro, a presença de ambas as adesinas fimbriais F4 e F18 em amostras de fezes e a presença de M. gallisepctium e/ou M. synoviae em amostras de fluidos orais. Assim, verificou-se que as amostras de soro eram adequadas para detetar o PRRSV e o PCV2, que as amostras de órgãos/tecidos e de fluidos orais não eram as mais indicadas para detetar a Leptospira. As amostras de fluidos orais eram apropriadas para detetar o M. gallisepctium e M. synoviae e amostras de fezes mostrara-se eficazes para a deteção das adesinas F4 e F18. With the increase of the word population, there is a growing demand for microbiologically safer foods with better quality and shorter production time. Consequently, intensive livestock production has become a major growth industry to fulfill this gap. However, pathogenic microorganisms sometimes infect these productions and jeopardize animal health and its subsequent use as food. In this aspect, the rapid diagnosis to identify the pathogenic agent that infects the animal becomes essential for its treatment. Thus, the aim of this dissertation was the screening and diagnosis of pathogenic microorganisms in animal samples (swine and poultry) from intensive livestock using a real time PCR based method. The analyses were carried out at Tomaz Laboratory (Leiria) that provides, among other services, veterinary analysis. Thus, swine organ/tissue samples were screened for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV), Leptospira spp. and Porcine Circovirus Type 2 (PCV2), swine serum samples for PRRSV and PCV2 screening, swine feces for E. coli virulence factors and poultry oral fluids samples for the presence of pathogenic Leptospira, Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae. Upon arrival the organ/tissue samples were stored at -20ºC and analyzed within 48-72h after collection, while serum, oral fluid and feces samples were stored at 4ºC and analyzed within 24-72 after collection. For the analysis of PRRSV RNA was extracted from the samples, while for the analysis of PCV2, Leptospira, virulence factors of E. coli and M. gallisepticum and M. synoviae the DNA was extracted. For the detection of these factors, specific kits were used according to the manufacturer’s instructions and the detection target by the qPCR method were: ORF7 for PRRSV, ORF2 for PCV2, lipL32 gene for pathogenic Leptospira and mgc2 and vlhA genes for detection of M. gallisepticum and M. synoviae respectively. For the detection of E. coli virulence factors, genes associated with F4 and F18 fimbriae adhesins were investigated. After the screening it was detected the presence of PRRSV and PCV2 in serum samples, of the adhesins F4 and F18 in the feces samples and of M. gallisepctium and/or M. synoviae in the oral fluid samples. Thus, it was found that serum samples were adequate for the detection of PRRSV and PCV2, organ/tissue and oral fluid samples were not the most suitable for the detection of Leptospira. Oral fluid samples were appropriate to detect M. gallisepticum and M. synoviae and feces samples were effective for the detection of F4 and F18 adhesins. Mestrado em Biotecnologia

A indústria suína mudou drasticamente nos últimos anos, trazendo novos desafios sanitários à produção animal. Devido a essas transformações, os protocolos e práticas de biosseguridade se tornaram necessários para a prevenção, controle e erradicação dos patógenos nas propriedades. A certificação sanitária de áreas livres de doenças de interesse também se tornou possível através do isolamento das propriedades pelo gerenciamento e realização de práticas de biosseguridade comuns, promovendo reconhecimento de áreas livres de doenças de ordem regional e nacional. O presente estudo teve como objetivo obter uma visão macro e representativa das práticas de biosseguridade realizadas nas principais agroindústrias do Estado do Rio Grande do Sul e, para tanto, dois métodos foram selecionados para avaliar os programas de biosseguridade em duas situações distintas. Na primeira, a Teoria da Resposta ao Item (TRI) foi utilizada para criar um escore para avaliar o nível de biosseguridade nas granjas amostradas nas integradoras do RS. Esse método leva em consideração a importância e o nível de discriminação das práticas de biosseguridade avaliadas e depois foi testada a associação entre o escore e algumas características das propriedades e dos produtores. O segundo método, a Análise de Decisão por Múltiplos Critérios (MCDA), foi utilizada para avaliar a vulnerabilidade de granjas suínas nos Estados Unidos da América (EUA) frente a introdução de um patógeno especifico, o vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRSV), levando em consideração a importância relativa de todas as formas de transmissão da doença. Em seguida, o escore de vulnerabilidade criado foi validado em dois bancos de dados onde a relação entre o escore criado e a frequência histórica de surtos da doença foi investigada. Como resultado, verificou-se que nas granjas amostradas no Rio Grande do Sul existe um favorecimento na realização das práticas relacionadas aos procedimentos de manejo em comparação com as demais categorias avaliadas e entre as finalidades de produção avaliadas, as Granjas Reprodutoras de Suínos Certificadas possuem maior frequência de adoção das práticas avaliadas. O emprego da TRI possibilitou a criação de um escore com uma quantidade reduzida de variáveis e identificou as práticas com maior capacidade de discriminar as propriedades em relação ao seu nível de biosseguridade. Além disso, foi possível concluir que o nível de biosseguridade sofre influência da finalidade de produção da propriedade, da empresa ou agroindústria a qual possui relação comercial, do tamanho do rebanho e do nível educacional do proprietário. O uso do método MCDA demonstrou ser útil para avaliar de forma sistemática as práticas de biosseguridade e os eventos de risco associados à introdução do vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína. Os cinco eventos mais importantes associados à introdução do PRRSV, que foram elencados pelos especialistas foram: a introdução de animais de reposição; a entrega de sêmen; a transmissão do agente via ar; o transporte de animais desmamados e a remoção de animais mortos. Uma associação entre o escore de vulnerabilidade e a frequência de surtos da doença foi constatada, sugerindo que quanto maior o escore de vulnerabilidade maior a frequência de surtos da doença. Enfim, conclui-se que através da avaliação das práticas de biosseguridade é possível identificar os pontos falhos do sistema de produção e garantir a efetividade dos protocolos que devem ser realizados nas granjas. The swine industry has changed dramatically in recent years, which has led to increased awareness of biosecurity protocols. Due to these transformations, biosecurity protocols and practices have become of paramount importance for the prevention, control and eradication of pathogens in farms. Sanitary certification of disease-free areas has also become possible through the isolation of properties by the management and implementation of common biosecurity practices, promoting recognition of disease-free areas at regional and national levels. The present study aimed to obtain a macro and representative view of the biosecurity practices carried out in the main swine industries of the state of Rio Grande do Sul. Two methods were later selected to evaluate the biosecurity protocols in two different situations. In the first, the Item Response Theory was used to create a score to evaluate the biosecurity level in the farms sampled in the RS swine industries. The method considers the relative importance and level of discrimination of the biosecurity practices evaluated and then the association between the score and some farm and owner characteristics was tested. The second method, the Multi-criteria decision analysis, was used to assess the vulnerability of swine farms in the United States to the introduction of a specific pathogen, the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), considering the relative importance of all transmission routes of the disease. Then, the vulnerability score was validated in two databases where the relationship between the score and the frequency of PRRSV outbreaks was tested. As a result, it was verified that in the farms sampled in the RS state there was a trend to perform practices related to the management procedures in comparison with the other categories evaluated. Among the herd types evaluated, the genetic Nucleus herds had a higher frequency of adoption of the evaluated practices. Using the item response theory, the method allowed the development of a score with a reduced number of variables and identified the variables with the greatest capacity to discriminate properties in relation to their biosecurity level. In addition, it was possible to conclude that the biosecurity level was influenced by the herd type, the company or swine industry which has a commercial relationship, the size of the herd and the educational level of the owner. The use of the MCDA method has been shown to be useful for systematically evaluating biosecurity practices and risk events associated with the introduction of the PRRSV. The five most important events associated with the virus introduction listed by the specialists were breeding replacement animals, semen delivery, air transmission, weaned pigs hauled from premises and dead animal’s removal. An association between the vulnerability score and the frequency of disease outbreaks was found, suggesting that the higher the vulnerability score the greater the frequency PRRSV outbreaks. Thus, it is concluded through the evaluation of biosecurity practices it is possible to identify the gaps of the production system and ensure the effectiveness of the protocols that must be carried out in the farms.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) was isolated for the first time in 1991 and since then it has been associated with significant economic losses to the pig industry worldwide. Although vaccination against PRRSV is widely used, an important advance would be the development of marker vaccines allowing serologic discrimination between vaccinated and naturally infected animals. The present study aimed to identify immunogenic and conserved regions dispensable to viral replication in different PRRSV proteins, which could be used as negative serologic markers in a new generation of liveattenuated vaccines. A fine mapping of B-cell linear epitopes in different PRRSV proteins by Pepscan is presented in the first part of this thesis. The results indicated the presence of several B-cell linear epitopes in the non-structural protein 2 (Nsp2) and in all structural proteins encoded by PRRSV, which were consistently recognized by antibodies raised in pigs experimentally infected with a North American strain of the virus (NVSL97-7895). The Nsp2 was found to harbor the highest frequency of immunodominant epitopes (n=18) when compared to structural proteins. In the structural proteins, epitopes consistently recognized by immune sera were located in all studied proteins. Overall, the highest degree of immunogenicity and conservation was exhibited by two epitopes identified in the C-terminal end of the M protein (ORF6). The antibodies recognizing the immunodominant epitopes of each protein were detected as early as days 7 to 15 post-infection (p.i.) and remained detectable until the end of the experiment (day 90 p.i). Based on their immunodominance and level of amino acid (aa) conservation, two target epitopes were selected to serve as serological marker candidates in each of the following PRRSV proteins: Nsp2, GP3 and M. These epitopes were deleted in the wild-type cDNA infectious clone (FL-12) by site-directed mutagenesis. The results of this study are presented in the second part of this thesis. A Nsp2 mutant virus (FLdNsp2/44) was successfully rescued following RNA transfection in MARC 145 cells. This epitope deletion mutant fulfilled the requirements for a differential vaccine virus such as efficient growth in vitro and in vivo and induction of active seroconversion as measured by a commercial ELISA kit associated with the absence of a marker-specific peptide-ELISA response in 100% (n=15) of the vaccinated animals. In vitro and in vivo characterization of the mutant virus clearly showed that removal of a 15-mer Nsp2 epitope had no effect on the immunogenicity, growth properties or virulence when compared to the wild type virus. On the other hand, deletions of previously identified peptide marker candidates within GP3 and M genes were shown to be lethal for virus viability in vitro. Alternatively, by substitution of 5aa at a time within a M peptide marker candidate, a viable mutant virus could be recovered although it still resulted in a positive marker virus. In summary, our results provide proof of concept that PRRSV marker vaccines can be developed using such methodology. Taken together, these data indicate that the combination of a mutant virus carrying a deletion of an immunodominant epitope and the corresponding peptide ELISA represents an attractive approach for the development of PRRSV differential modified-live vaccines. O vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos (PRRSV) foi isolado pela primeira vez em 1991 e, desde então, tem sido associado a perdas significativas para a suinocultura mundial. Apesar da vacinação contra o PRRSV ser amplamente utilizada, um grande avanço seria alcançado com a elaboração de vacinas diferenciais que permitam a discriminação sorológica entre animais vacinados e naturalmente infectados. O presente estudo teve como objetivo a identificação de regiões imunogênicas, conservadas e dispensáveis a replicação viral, em diferentes proteínas do PRRSV, que pudessem ser utilizadas como marcadores sorológicos negativos em uma nova geração de vacinas atenuadas. Na primeira parte desta tese estão apresentados os resultados de um mapeamento de epítopos lineares de linfócitos B em diferentes proteínas do PRRSV, pelo uso da tecnologia de Pepscan. Os resultados indicam a presença de diversas regiões imunodominantes na proteína não estrutural 2 (Nsp2) e em todas as proteínas estruturais do vírus. Essas regiões foram consistentemente reconhecidas pelo soro de suínos experimentalmente infectados com uma cepa norte-americana do PRRSV (NVSL97-7895). A maior freqüência de epítopos imunodominantes foi identificada na Nsp2 (n=18) e o mais alto grau de imunogenicidade e nível de conservação de aminoácidos foi observado em dois epítopos identificados na extremidade carboxi-terminal da proteína M (ORF6). Anticorpos reagentes com epítopos imunodominantes de cada proteína foram detectados inicialmente entre os dias 7-15 pós-infecção (pi), permanecendo em altos títulos até o final do experimento (dia 90 pi). Com base na imunodominância e nível de conservação de amino ácidos (aa) das seqüências mapeadas, dois epítopos alvos foram selecionados como candidatos a marcadores sorológicos negativos em cada uma das proteínas Nsp2, Gp3 e M. Esses epítopos foram então deletados em um clone infeccioso de cDNA (FL12) por mutagênese sítio-direcionada. Os resultados desses experimentos encontram-se descritos na segunda parte da tese. Um vírus mutante carreando a deleção de um epítopo imunodominante da Nsp2 (FLdNsp2/44) foi obtido após transfeccção de RNA viral em células MARC145. A caracterização in vitro e in vivo do vírus mutante demonstrou que a remoção dos 15 aa da Nsp2 não produziu efeito sobre a imunogenicidade, replicação ou virulência quando comparado ao vírus parental. Além disso, observou-se indução de soroconversão contra o PRRSV em animais infectados, detectada pelo uso de um teste ELISA comercial. Por outro lado, não foi detectada resposta humoral específica contra a região deletada nos animais imunizados com o FLdNsp2/44, conforme resultados de um teste ELISA contendo como antígeno um peptídeo sintético correspondente a seqüência removida. Por outro lado, deleções dos epítopos previamente identificados na Gp3 e proteína M foram letais à viabilidade viral in vitro. Alternativamente, um outro vírus mutante foi gerado pela substituição de 5 aa do epítopo identificado na proteína M, embora a alteração de resíduos não tenha sido suficiente para eliminar a imunogenicidade da região. Em resumo, os resultados do presente estudo se constituem em uma prova de conceito no sentido do desenvolvimento de vacinas diferenciais contra o PRRSV. A utilização de um vírus mutante carreando a deleção de um epítopo imunodominante, associado com um teste de ELISA baseado no peptídeo sintético correspondente a região deletada, representam uma alternativa para o desenvolvimento de vacinas diferenciais atenuadas contra o PRRSV.