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Orientador: Carla Beatriz Collares Buzato Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Diabetes melito tipo 2 (DMT2) é uma das doenças endócrino-metabólicas de etiologia complexa mais prevalentes do mundo. Estudos em animais e humanos têm proposto um envolvimento intestinal na patogênese do DMT2 resultando em alteração da composição da microbiota intestinal e endotoxemia. Trabalho recente do nosso grupo de pesquisa demonstrou que camundongos pré-diabéticos alimentados com dieta hiperlipídica (DH), apresentaram alteração na estrutura da junção de oclusão (JO) no epitélio do íleo e cólon, indicativa de comprometimento da barreira paracelular. Em adição, exposição in vitro ao conteúdo intestinal obtido desses animais pré-diabéticos induziu ruptura da barreira epitelial mediada pela JO em linhagens celulares epiteliais, sendo que o conteúdo luminal do intestino delgado desses animais foi mais nocivo à JO do que o do intestino grosso. Diante desses resultados, esta Dissertação de Mestrado tem por objetivo avaliar o papel da barreira epitelial mediada pela JO no duodeno e jejuno durante o desenvolvimento do pré-diabetes. Entre os objetivos específicos estão: 1) verificar se a estrutura e função da JO estariam comprometidas no duodeno e jejuno durante a administração de DH por 15, 30 e 60 dias; 2) investigar se a permeabilidade paracelular estaria aumentada para moléculas com relativo baixo peso molecular como o Lucifer Yellow (LY); e 3) determinar a relação temporal entre a quebra de barreira epitelial e o surgimento de endotoxemia nos animais alimentados com DH. A avaliação metabólica demonstrou que a DH induziu alterações progressivas até o estabelecimento de um quadro típico de pré-diabetes aos 60d, com ganho significativo de peso e da massa das gorduras pélvica e retroperitoneal, hiperglicemia em jejum e pós-prandial. A avaliação da permeabilidade intestinal mostrou que a DH provocou maior passagem de LY pela barreira paracelular intestinal de animais pré-diabéticos. Nas análises histológicas, não foi observado comprometimento estrutural do epitélio intestinal, mas um aumento na altura das células absortivas, possivelmente devido a uma adaptação ao maior aporte calórico, sem que houvesse mudança marcante na superfície de absorção representada por vilos e glândulas. A avaliação das proteínas juncionais claudinas-1,-2,-3 e ZO-1 por meio de imunofluorescência e Western Blot demonstrou diminuição no conteúdo juncional dessas proteínas no epitélio de revestimento do duodeno e jejuno, já a partir dos 15d de tratamento, sem alteração significativa no conteúdo celular, indicando rearranjo na estrutura da JO, que pode ter contribuído para o aumento da permeabilidade intestinal ao LY. A dosagem de LPS não demonstrou o surgimento de endotoxemia nem de alteração da quantidade luminal desse componente. Em conclusão, esses resultados demonstram que a DH induz o desenvolvimento do pré-diabetes com comprometimento significativo da estrutura e função da barreira paracelular mediada pela JO no duodeno e jejuno, sendo que as alterações estruturais nesses segmentos precedem o estabelecimento do pré-diabetes. Porém, a ausência de endotoxemia e de mudança na quantidade do LPS luminal indicam que as alterações metabólicas que contribuem para o desenvolvimento do quadro de DMT2 podem ser influenciadas pela dieta e por outros fatores luminais intestinais a serem identificados Abstract: Diabetes mellitus type 2 (DMT2) is one of the most prevalent endocrine-metabolic diseases worldwide with a complex etiology. Animal and human studies have proposed an intestinal involvement in the pathogenesis of DMT2 with changes in the intestinal microbiota composition, resulting in endotoxemia. We have recently shown that prediabetic mice, fed a high-fat diet (HF), present an altered tight junction (TJ) structure in the ileum and colon epithelium, indicative of paracellular barrier disruption. In addition, in vitro exposure to the intestinal luminal contents obtained from these prediabetic animals induced impairment of the TJ-mediated epithelial barrier in epithelial cell lines, and the luminal content of small intestine was more harmful to TJ than that of the large intestine. In view of these findings, this Master's thesis aimed at investigating the TJ-mediated epithelial barrier in the duodenum and jejunum during prediabetes development in mice. The specific objectives were as follows: 1) to verify if the structure and function of TJ would be compromised in the duodenum and jejunum (proximal intestine) during HF administration for 15, 30 and 60 days; 2) to investigate whether paracellular permeability would be increased to relatively low molecular weight markers such as Lucifer Yellow (LY); and 3) to determine the temporal relationship between epithelial barrier disruption and endotoxemia in animals fed a HF. The metabolic evaluation demonstrated that HF induced progressive changes until the establishment of a typical prediabetes condition after 60d of treatment, characterized by significant weight gain, an increase in pelvic and retroperitoneal fat mass, and moderate fasting and postprandial hyperglycemia. Intestinal permeability assay showed that HF induced a significant rise in the passage of LY through the paracellular intestinal barrier in prediabetic mice as compared to controls. As revealed by the histological analysis, no structural rupture of the epithelium lining the proximal intestine was observed, but a marked increase in the height of absorptive cells, possibly a result of an adaptation to a higher caloric intake, without a marked change in the absorption surface represented by villi and glands were detected in prediabetic mice. Immunofluorescence and Western Blotting for some junctional proteins (namely claudins-1, -2, -3 and ZO-1) in the epithelium of duodenum and jejunum revealed a significant decrease in the junctional pool, starting at 15d of treatment, without significant change in their total cell content, suggesting a rearrangement of the TJ structure, which may have contributed to the increased intestinal permeability in HF-fed mice. The LPS levels in plasma and intestine fragments were similar in control and treated groups. In conclusion, our results demonstrate that HF intake, up to 60d, induces the development of prediabetes in mice associated with a significant impairment of TJ-mediated paracellular barrier structure and function in the duodenum and jejunum. The TJ structural changes in these intestine segments preceded the establishment of prediabetes and occurred in the absence of detectable endotoxemia Mestrado Biologia Tecidual Mestra em Biologia Celular e Estrutural CAPES 1735160; 88882.329635/2019-01 FAPESP 2018/02118-2

Introdução: A doença hepática alcóolica (DHA) e a doença hepática gordurosa não alcóolica (DHGNA) estão entre as principais causas de morte por doenças hepáticas no mundo. Apesar das etiologias distintas, sendo a DHA causada pelo consumo excessivo de álcool e a DHGNA por dieta inadequada e sedentarismo, apresentam curso de doença semelhante, que pode evoluir de esteatose, para esteato-hepatite, fibrose, cirrose e carcinoma hepatocelular. Tanto a DHA quanto a DHGNA estão relacionadas à disbiose, aumento de permeabilidade intestinal, inflamação e dano hepático. Entretanto, ainda não está claro se a doença hepática precede as alterações no epitélio intestinal ou se é o aumento da permeabilidade que promove o dano hepático. Objetivo: Avaliar a expressão gênica de Tight Junctions em modelo de DHA e DHGNA em zebrafish (Danio rerio). Métodos: No modelo de DHA, os peixes foram divididos em dois grupos: Etanol (n=30), expostos a 0,5% de etanol por 28 dias e controle (n=30). No modelo de DHGNA, os peixes foram divididos também em dois grupos: Frutose (n=24), expostos à frutose 6% durante 2 horas por 14 dias e controle (n=24). Ao término dos experimentos os animais foram eutanasiados e coletados fígados, para avaliação histológica por coloração hematoxilina-eosina (HE) e de esteatose por Oil Red, e intestinos para avaliação da expressão gênica dos marcadores de permeabilidade intestinal cldnC, cldn15a, cldn15b e f11r por Real Time qPcr. Resultados: Tanto os animais expostos ao álcool quanto à frutose apresentaram esteatose hepática por coloração HE e Oil Red quando comparados aos seus respectivos controles, sem sinais de infiltrados inflamatórios e de fibrose hepática à microscopia óptica. Não houve diferença significativa na expressão gênica das tight junctions intestinais, tanto para a DHA quanto DHGNA (p  0,05). Conclusão: Os resultados sugerem que em estágios iniciais de DHA e DHGNA não ocorre alteração da permeabilidade intestinal, e que possivelmente o dano hepático precede o dano intestinal. Introduction: Alcoholic liver disease (ALD) and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) are among the leading causes of death from liver disease worldwide. Despite the different etiologies, ALD is caused by excessive alcohol consumption and NAFLD is due to inadequate diet and sedentary lifestyle, they have a similar disease course, which can progress from steatosis to steatohepatitis, fibrosis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Both ALD and NAFLD are related to dysbiosis, increased gut permeability, inflammation, and liver damage. However, it is not yet clear whether liver disease precedes changes in the intestinal epithelium or whether it is the increased permeability that promotes liver damage. Objective: To evaluate the gene expression of tight junctions in ALD and NAFLD models in zebrafish (Danio rerio). Methods: In the ALD model, fish were divided into two groups: Ethanol (n=30), exposed to 0.5% ethanol for 28 days and control (n=30). In the NAFLD model, fish were also divided into two groups: Fructose (n=24), exposed to 6% fructose for 2 hours for 14 days and control (n=24). At the end of the experiments the animals were euthanized and livers were collected for histological evaluation by hematoxylin-eosin (HE) staining and steatosis by oil red staining and intestines for evaluation of the gene expression of gut permeability markers cldnC, cldn15a, cldn15b and f11r by Real Time qPcr. Results: Both animals exposed to alcohol and fructose presented hepatic steatosis by HE and Oil Red staining when compared to their respective controls, without signs of inflammatory infiltrates under optical microscopy. There was no significant difference in the gene expression of the tight junctions for both ALD and NAFLD (p0.05) Conclusion: The results suggest that in the early stages of ALD and NAFLD there are no changes in intestinal tight junctions, and that possibly liver damage precedes intestinal damage.

A total of twelve lactating Jersey cows were used in a 5-week experiment to determine the effects of severe feed restriction on the permeability of mammary gland cell tight junctions (TJs) and its effects on milk stability to the alcohol test. During the first 2 weeks, cows were managed and fed together and received the same diet according to their nutritional requirements (full diet: 15 kg of sugar cane silage; 5.8 kg of alfalfa hay; 0.16 kg of mineral salt and 6.2 kg of concentrate). In the 3rd week, animals were distributed into two groups of six cows each. One group received the full diet and the other a restricted diet (50% of the full diet). In the 4th and 5th weeks, all animals received the full diet again. Milk composition and other attributes, such as titratable acidity, ethanol stability, pH, density and somatic cell count (SCC) were evaluated. Cortisol levels indicated the stress condition of the cows. Plasma lactose and milk sodium were measured to assess mammary TJ leakiness. Principal factor analysis (PFA) showed that the first two principal factors (PFs) contributed with 44.47% and 20.57% of the total variance in the experiment and, as feeding levels increased, milk stability to the ethanol test became higher and plasma lactose levels decreased, which indicates lower permeability of the mammary gland cell TJ. Correspondence analyses were consistent with PFA and also showed that lower feeding levels were related to reduced milk stability, high plasma lactose, high sodium in milk, low milk lactose (another parameter used to assess TJ permeability) and higher cortisol levels, indicating the stress to which animals were submitted. All observations were grouped in three clusters, with some of the above-mentioned patterns. Feeding restriction was associated with higher permeability of TJ, decreasing milk stability to the ethanol test.

Durante o período de 2010 e 2011 dois experimentos foram conduzidos na Embrapa Clima Temperado, em Capão do Leão/RS. O primeiro envolveu a adição de citrato de sódio e bicarbonato de sódio na dieta de vacas Jersey, com o intuito de verificar influência destes aditivos no controle da incidência de LINA, como alegado por parte da(s) indústria(s) comercializadora (s) dos produtos. Dezessete vacas foram divididas em três tratamentos, em dois períodos experimentais com diferentes dietas. Grupo controle: 5 vacas sem receber aditivos na dieta; grupo Citrato: 6 vacas recebendo 100 g diárias de citrato de sódio; grupo Bicarbonato: 6 vacas com 40 g diárias de bicarbonato de sódio na dieta. Foram medidos os teores plasmáticos de glicose e ureia e o pH urinário, para monitoramento da fisiologia dos animais, assim como se determinou a composição físico-química do leite e a contagem de células somáticas. Não foi detectado efeito da adição de bicarbonato de sódio e citrato de sódio em nenhum dos parâmetros avaliados, demonstrando a ineficácia do uso destes aditivos no controle da incidência de LINA. Um segundo experimento, com duração de cinco semanas, também envolvendo vacas da raça Jersey, foi elaborado com o objetivo de determinar alterações na permeabilidade das tigh tjunctions das células epiteliais da glândula mamária provocadas por restrição alimentar severa. Doze vacas foram divididas em dois tratamentos contendo seis vacas cada: grupo Controle: animais recebendo dieta atendendo suas exigências nutricionais durante todo o experimento; grupo Restrição: animais recebendo dieta restrita em 50% somente durante a terceira semana. Determinou-se a permeabilidade das tight junctions através da mensuração dos níveis plasmáticos de lactose e dos teores lácteos de lactose e sódio. Foi determinada também a composição físico-química do leite e a contagem de células somáticas das amostras, assim como os teores de cortisol plasmático, para identificação da condição de estresse às quais os animais em restrição alimentar estavam submetidos. A restrição alimentar promoveu estresse aos animais do grupo Restrição, resultando em maior permeabilidade das tight junctions das células da glândula mamária, com efeitos sobre a redução da estabilidade do leite no teste do álcool. In the period between 2010 and 2011 two experiments were conducted at Embrapa Clima Temperado, in Capão do Leão/RS. The first study involved the inclusion of sodium citrate and sodium bicarbonate in Jersey cow diet to determine the influence of this inclusion on the incidence of unstable non-acid milk (LINA). Seventeen animals were divided into three groups, in two experimental periods with different diets: Control group: 5 animals without the inclusion of additives in the diet; Citrate group: 6 animals receiving each 100 g of sodium citrate per day in the diet; Bicarbonate group: 6 animals receiving 40 g of sodium bicarbonate per day. Plasma concentration of glucose, urea as well as urine pH was measured to assess the animals’ physiologic status. Milk’s physical-chemical composition and somatic cell count were also determined. The inclusion of sodium citrate and sodium bicarbonate had no influence on any of the parameters evaluated, demonstrating the inefficiency of this technique in controlling the incidence of LINA. A second experiment, with five weeks duration also using Jersey cows, was carried out to define alterations in the permeability of mammary gland cells tight junctions due severe feeding restriction. Twelve animals were divided into two treatments with 6 cows each: Control group: animals receiving full diet during the entire study; Restriction group: animals receiving a 50% restricted diet only during the third week. Tight junction permeability was determined through plasma and milk levels of lactose and milk levels of sodium. Milk physical-chemical composition and somatic cell count were also determined. Cortisol concentration was measured to assess the animals stress condition. Feeding restriction induced stress in animals in the Restriction group, which promoted higher permeability of mammary gland cell tight junctions, with influences on the reduction of milk stability to the ethanol test.