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Orientador: Everardo Magalhães Carneiro Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Sabe-se que a restrição proteica pós-desmame em camundongos leva a prejuízos no metabolismo da glicose em consequência da redução da secreção de insulina pelas células ? pancreáticas. Neste contexto, se faz essencial a busca por estratégias que revertam as condições frente a essa deficiência nutricional. O ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA) tem demonstrado ser um potencial candidato visto já ter normalizado a secreção e ação da insulina em humanos e roedores obesos, além aumentar o clearance de insulina, restaurar massa e aumento no número de células beta por ilhota em animais diabéticos. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar os mecanismos moleculares e funcionais dos efeitos do TUDCA na função e proliferação do pâncreas endócrino de camundongos submetidos à restrição proteica. Para isso, camundongos machos C57Bl/6J com 30 dias foram submetidos à dieta controle (14% de proteína - grupo C) e dieta com restrição proteica (6% de proteína - grupo R) por 16 semanas, sendo nas últimas 2 semanas subdivididos; em dois grupos, em que 50% dos animais receberam tratamento de 300mg/kilo de TUDCA (CT e RT) e o restante, recebeu PBS (C e R), ambos via intraperitoneal. Os camundongos R tiveram menor ganho de peso e eficiência alimentar, porém aumento no peso do tecido adiposo e cérebro. Além disso, apresentaram proteínas plasmáticas totais e concentração de albumina diminuídas. Apesar de não haver alterações na glicemia de jejum entre os grupos, camundongos CT, R e RT apresentaram maior tolerância à glicose. O grupo R apresentou maior sensibilidade à insulina, o que é normalizado com o tratamento com TUDCA. Ilhotas isoladas de camundongos R secretaram menos insulina em resposta à condição basal de 2,8 mM e estimulatória de 11,11 mM de glicose, obtendo secreção restaurada quando em animais tratados com o TUDCA. O pâncreas dos animais RT apresentaram maior área de célula ? em relação à área de ilhota observada nas seções histológicas de pâncreas imunocoradas para insulina e maior número de ilhotas. Observamos também que ilhotas de menor tamanho (0 a 2?m2) aparecem em maior número em pâncreas de animais RT. Quando analisadas as expressões de genes do complexo SNARE, temos que animais RT apresentaram maior expressão de Sintaxina 1A e SNAP25. Além disso, animais RT demonstram aumento na expressão de genes de função, transcrição e diferenciação de célula ? pancreática, 6 INS1, PDX1, e HNF4beta. Concluímos que o TUDCA, melhora a homeostase glicêmica, aumenta a secreção de insulina e a função das células beta pancreáticas em camundongos submetidos à restrição proteica. Estes efeitos possivelmente se dão pelo aumento dos parâmetros morfométricos da ilhota e célula beta pancreática e maior expressão de RNA mensageiros envolvidos na extrusão de grânulos de insulina, função, maturação e diferenciação de células beta pancreáticas Abstract: It is known that post-weaning protein restriction in mice leads to impaired glucose metabolism as a result of reduced insulin secretion by pancreatic beta cells. In this context, it is essential to search for strategies that reverse the conditions facing this nutritional deficiency. Tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) has been shown to be a potential candidate as it has normalized insulin secretion and action in humans and obese rodents, in addition to increasing insulin clearance, restoring mass, and increasing the number of beta cells per islet in diabetic animals. Therefore, the aim of this work was to evaluate the molecular and functional mechanisms of the effects of TUDCA on the function and proliferation of the endocrine pancreas of mice subjected to protein restriction. For this, 30-day-old male C57Bl/6J mice were submitted to a control diet (14% protein - group C) and a protein-restricted diet (6% protein - group R) for 16 weeks, being subdivided in the last 2 weeks; in two groups, in which 50% of the animals received treatment with 300mg/kilo of TUDCA (CT and RT) and the remainder received PBS (C and R), both via intraperitoneally. R mice had lower weight gain and feed efficiency, but increased weight of adipose tissue and brain. In addition, they showed decreased total plasma proteins and albumin concentration. Although there were no changes in fasting blood glucose between groups, CT, R, and RT mice showed greater glucose tolerance. The R group had greater insulin sensitivity, which is normalized with TUDCA treatment. Islets isolated from R mice secreted less insulin in response to basal conditions of 2.8 mM and stimulatory conditions of 11.11 mM glucose, obtaining restored secretion when in animals treated with TUDCA. The pancreas of the RT animals showed a larger beta-cell area in 7 relation to the islet area observed in the histological sections of the pancreas immunostained for insulin and a larger number of islets. We also observed that smaller islets (0 to 2?m2) appear in greater numbers in the pancreases of RT animals. When analyzing the expression of genes from the SNARE complex, we have that RT animals showed higher expression of Syntaxin 1A and SNAP25. Furthermore, RT animals demonstrate increased expression of pancreatic beta cell function, transcription, and differentiation genes, INS1, PDX1, and HNF4beta. We conclude that TUDCA improves glycemic homeostasis, increases insulin secretion and pancreatic beta cell function in mice subjected to protein restriction. These effects are possibly due to the increase in the morphometric parameters of the islet and pancreatic beta cell and increased expression of messenger RNA involved in the extrusion of insulin granules, function, maturation, and differentiation of pancreatic beta cells Mestrado Fisiologia Mestra em Biologia Funcional e Molecular CNPQ 134270/2019-3 FAPESP CAPES

Orientadores: José Antônio Rocha Gontijo, Patrícia Aline Boer Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Programação fetal é a resposta de um embrião e um feto, durante um período crucial na gestação, em resposta a insultos do ambiente. A restrição proteica na dieta materna durante toda a gestação é associada com baixo peso ao nascer e alterações da programação morfológica e fisiológica dos rins. Estudos anteriores demonstraram que o Fator Induzido por Hipóxia (HIF-1?) é reconhecidamente essencial para a organogênese, ao regular a expressão de inúmeros fatores envolvidos na angiogênese, proliferação celular e apoptose; no entanto, nenhuma ligação direta entre restrição de proteína na dieta materna, expressão do HIF e prejuízo na nefrogênese foi estabelecida até agora. Portanto, no presente estudo, consideramos a modulação de fatores pró e anti apoptóticos durante a nefrogênese, uma vez que a organogênese depende de um delicado equilíbrio entre proliferação, diferenciação e morte celular. Já foi demonstrado que ratas prenhas submetidas a dieta hipoproteica durante a gestação dão origem a ninhadas com elevação da pressão arterial sustentada durante toda a vida, e que essa alteração é relacionada à diminuição do número de néfrons. Um dos fatores associados à redução do número de néfrons é a ativação da via de sinalização do HIF durante a nefrogênese, o que compromete não só o número absoluto total de néfrons, mas também a maturação das células tubulares. Ratos Wistar foram acasalados utilizando o sistema de harém, e a gestação foi confirmada pela presença de esperma no lavado vaginal. Uma vez confirmada a gestação, as ratas foram divididas em grupos de dietas isocalóricas com quantidade normal de proteína (grupo NP, 17% de proteína) ou com quantidade reduzida de proteína (grupo LP, 6% de proteína) durante a gestação. No 17º dia gestacional, os embriões machos foram coletados, e os rins embrionários foram avaliados por coloração de imunohistoquímica e expressão gênica por rt-PCR. Foi observado aumento da imunorreatividade do HIF-1? durante a nefrogênese, concentrações elevadas de proteínas da via de sinalização - HSP90, NOS2, - e diminuição do fator transcripcional elF-4. Dessa forma, acreditamos que o aumento da ativação da via de sinalização do HIF-1? está associado com a diminuição do número de néfrons e a redução da ramificação do broto ureteral em ratos submetidos a dieta hipoproteica durante o desenvolvimento embrionário, e, consequentemente, ao desenvolvimento de doenças na vida adulta, como hipertensão arterial. Aqui, nós hipotetizamos que um dos mecanismos pelo qual dietas hipoproteicas levam ao desenvolvimento de menor número de néfrons está relacionado ao aumento na concentração de HIF-1? não degradado e nas proteínas da via de sinalização, e com a diminuição do fator transcripcional elF-4, o que inibiriam a resposta adaptativa ao ambiente adverso; inibindo, consequentemente, a maturação das células renais e a divisão de células progenitoras nefrogênicas. O estudo atual corrobora a premissa de que ninhadas de ratas expostas a baixa concentração de proteína na dieta durante a gestação expressam altos níveis de HIF-1? durante a organogênese, o que deixaria os fetos vulneráveis ao desenvolvimento renal comprometido Abstract: Fetal programming is the response of an embryo and fetus during the crucial gestation period to environment insults, such as undernutrition that could promote permanent morphological and physiological changes in later life. Maternal dietary protein restriction during whole pregnancy is associated with low fetal birthweight and leads to programmed kidney morphological and physiological changes. Previous studies have demonstrated that HIF-1? (Hypoxia Induced Factor) is known to be essential for organogenesis by regulating the expression of numerous factors involved in angiogenesis, cellular proliferation, and apoptosis; however, no direct link between maternal protein-restriction, HIF expression and, impaired nephrogenesis has been established. Therefore, in the current study, we considered the modulation of pro-apoptotic and anti-apoptotic factors during nephrogenesis since organogenesis depends upon a tight balance between proliferation, differentiation, and cell death. Pregnant rats on a low protein diet during pregnancy are shown to produce offspring with high lifelong blood pressure related to a decreased number of nephrons. One of the factors associated with reduced nephron formation is the activation of the HIF signaling pathway during nephrogenesis, which compromises not only the absolute amount of nephrons but the maturation of tubular cells. Therefore, this study aimed to determine the HIF signaling pathway's evolution during the nephrogenesis of rats submitted to a protein-restricted diet during pregnancy. Wistar rats were matched using the harem system, and pregnancy was confirmed by the presence of sperm in the vaginal smear. Confirmed pregnancy, dams were submitted to isocaloric standard protein chow (NP group; 17% of protein) or low-protein chow (LP group; 6% of protein) throughout gestation. On the 17th gestational day, male embryos were collected, and embryonic kidneys were analyzed by immunostaining. Increased HIF-1? immunoreactivity was found during nephrogenesis and increased protein expression of HIF-1? signaling pathway - HSP90, NOS2, along with the decreased expression of the transcriptional factor elF-4. Thus, we believe that the increased activation of the HIF-1? signaling pathway is associated with a decrease in the number of nephrons and the reduction of ureteric bud branch in rats submitted to a low-protein diet and, consequently, the development of diseases in adulthood, such as hypertension. Here, we hypothesized that one of the mechanisms by which low-protein diets develop fewer nephrons is related to the increase of the non-degraded HIF-1? and the decrease of the transcriptional factor elF-4 along with decreased proteins expression of HIF-1? pathway. These would inhibit the adaptive response to the adverse environment: consequently, the renal cells' maturation and inhibition of the division of the nephrogenic progenitors cells. For the first time in the literature, we show an increased expression of HIF-1? level in offspring form dams exposed to low-protein diet, which induces fetus vulnerability to impaired renal development Mestrado Clínica Médica Mestra em Ciências

Orientadores: Patricia Aline Boer, José Antônio Rocha Gontijo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A manipulação da dieta em modelos animais durante a gestação, no caso, a dieta hipoproteica, tem sido eficiente em mimetizar as alterações relacionadas ao baixo peso ao nascer, proporcionando o estudo dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento de doenças crônicas na vida adulta. Nosso grupo de pesquisa identificou em ratos machos submetidos a restrição proteica gestacional, na vida adulta, aumento da ansiedade, elevação plasmática basal de corticosterona (CORT) e catecolaminas, além de diminuição de receptores de glicocorticoides hipocampais, alterações indicativas de disfunção da resposta ao estresse, principalmente relacionados ao sistema simpato-adrenomedular (SAS) e eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA). Não apenas insultos durante a gestação, bem como o cuidado materno durante o período de amamentação pode modular o eixo HPA da prole, influenciando na sua atividade na vida adulta. Desta forma, com objetivo de elucidar mecanismos que possam desencadear essas alterações, avaliamos o comportamento materno durante as primeiras semanas pós-natais, bem como parâmetros morfológicos e funcionais das glândulas adrenal e hipófise em machos submetidos a restrição proteica gestacional. Ratas wistar prenhas foram submetidas a dieta normoproteica (grupo NP; 17% de caseína) ou hipoproteica (grupo LP; 6% de caseína) durante toda a gestação. No dia do nascimento até ao desmame, os parâmetros de comportamento materno foram avaliados, e na 16ª semana de vida o plasma, a glândula adrenal e hipófise foram coletados para análises hormonais por LC-MS/MS, western blot e imunohistoquímica. Animais LP mostraram baixo peso ao nascer, diferença que não ocorreu no desmame, mostrando efeito do catch-up growth. Não observamos diferenças no comportamento materno, sugerindo que a diminuição de GR hipocampal da prole LP não teria influência do cuidado materno. A concentração plasmática de 11-dehidrocorticosterona (11-DHC) em animais LP com 21DPN e 16 semanas de vida diminuiu, enquanto houve aumento da concentração plasmática de CORT e 11-DHC em animais LP com 8 semanas de vida. Os receptores de glicocorticoides (GR) e mineralocorticoides (MR), que são fundamentais para a ação dos glicocorticoides, aumentaram na hipófise e adrenal em LP de 16 semanas, indicando possível feedback negativo. Contudo, o aumento de 98,8% do receptor de CRH e 63,3% de ACTH na hipófise da prole LP indicam falha desse feedback a nível hipofisário. A análise morfométrica da adrenal mostrou aumento medular e de 39,67% de NeuN, indicando aumento da celularidade medular em LP. Além disso houve aumento de 168,77% em PCNA, sugerindo proliferação celular sob demanda da hiperatividade da adrenal. Houve aumento também do receptor 5HT1A (48,69%) na adrenal, que está associado à secreção inibitória de catecolaminas; e aumento da imunomarcação de receptores 5HT1A e 5HT2A diferentemente nos lobos hipofisários, sugerindo modulação do eixo HPA a nível hipofisário através da inervação serotoninérgica dos neurônios CRF hipotalâmicos. A restrição proteica gestacional resulta em adultos da prole, alterações morfológicas e funcionais nas glândulas supra-renais, além de modulação hormonal associada a maior resposta ao estresse e hiperatividade adrenérgica, possivelmente participando na gênese e manutenção da hipertensão arterial neste modelo Abstract: Diet manipulations during gestation of animal models, in this case, the hypoprotein diet, mimic the alterations related to low birth weight, providing studies of the mechanisms involved in chronic disease development in later life. Our research group identified in adult male rats submitted to gestational protein restriction, increased anxiety-like behavior, basal plasmatic corticosterone (CORT) and catecholamines elevation, and decrease of hippocampal glucocorticoid receptors, indicating dysfunction of the stress response, which is related to the sympathetic-adrenomedullary system (SAS) and the hypothalamic-pituitary-adrenal axis (HPA) alterations. Not only insults during gestation, but maternal care behavior during breastfeeding can modulate the HPA axis of the offspring, influencing its activity in adulthood. Thus, to elucidate mechanisms that can trigger these possible alterations, we evaluated maternal care behavior and morphological and functional parameters of the adrenal and pituitary glands in gestational protein-restricted male rats. Mated wistar rats were submitted to normal-protein diet (NP group; 17% protein) or low-protein diet (LP group; 6% protein) throughout pregnancy. On the day of birth until weaning, the maternal care behavior parameters were evaluated, and at the 16th week of age, plasma, adrenal and pituitary gland were collected for hormonal analyzes by LC-MS/MS, western blot and immunohistochemistry. LP offspring animals showed low birth weight, which was recovered at weaning, indicating the effect of catch-up growth. No difference in maternal care behavior was found between the groups, suggesting that the decrease of hippocampal GR in LP offspring may not be influenced by maternal care. The plasma levels of 11-dehydrocorticosterone (11-DHC) in 21PND and 16 wk-old LP offspring decreased, whereas the plasma levels of CORT and 11-DHC of 8 wk-old LP offspring increase. Glucocorticoid (GR) and mineralocorticoid (MR) receptors, which are essential of glucocorticoid's effective actions, were increased in the pituitary and adrenal glands in LP 16 wk-old animals, indicating possible negative feedback. Although, the 98.8% increase in CRH receptor and 63.3% ACTH in the pituitary of the LP offspring indicate failure of this feedback at pituitary level. The morphometric analysis of the LP 16 wk-old animal’s adrenal gland showed an increase of medullary area, accompanied by an increase of 39.67% in NeuN, indicating increase of medullary cellularity, and an increase of 168.77% in PCNA, suggesting cell proliferation under demand of adrenal hyperactivity. In addition, was found an increase of 5HT1A receptor (48.69%) in the LP adrenal gland, which is associated with inhibitory catecholamine secretion; and an increase of immunostaining of 5HT1A and 5HT2A receptors differently within the pituitary lobes, suggesting modulation of the HPA axis at the pituitary level through the serotonergic innervation from hypothalamic CRH neurons. Gestation protein restriction results in the adult rat offspring, morphological and functional changes in the adrenal glands, hormonal modulations associated with stress responsivity and adrenergic hyperactivity, alterations that could participate in the genesis and maintenance of hypertension in this model Mestrado Fisiopatologia Médica Mestre em Ciências CNPQ 131084/2018-6

Orientador: Ana Paula Couto Davel Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A disfunção das células endoteliais é uma característica comum a várias doenças cardiovasculares. Sabe-se que a desnutrição proteica predispõe à disfunção endotelial e à hipertensão, embora os mecanismos não estejam totalmente elucidados. Taurina, um aminoácido com ação vasodilatadora e antioxidante é um potencial adjuvante terapêutico para a prevenção das comorbidades associadas à desnutrição. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito da restrição proteica in vitro na migração, apoptose e sinalização do óxido nítrico (NO) em células endoteliais, assim como a possível modulação da taurina nesses efeitos. Para tal, células endoteliais da aorta bovina (BAEC) foram expostas a meio de cultura (DMEM) contendo 100% ou 25% de aminoácidos por 48h na presença ou ausência de taurina (3 e 30mM). Foram avaliados morte celular pelo ensaio de HO-Pi, migração pelo ensaio de cicatrização de ferida, produção de NO pela fluorescência ao DAF-2DA, produção de espécies reativas de oxigênio (EROS) pela fluorescência ao DHE, e a expressão proteica no lisado celular por Western-blotting. Como resultados foi observado que a exposição ao meio restrito de aminoácidos aumentou a taxa de apoptose das células endoteliais, o que foi prevenido pela taurina 30 mM, mas não taurina 3 mM. Com relação à migração, as células endoteliais expostas à restrição de aminoácidos apresentaram redução da área de cicatrização em comparação às células controle, efeito que não foi modificado pela taurina 3 ou 30 mM. As células endoteliais expostas ao meio com restrição de aminoácidos apresentaram redução de NO e aumento de EROS em comparação às células controle, o que foi revertido na presença de taurina 30 mM. A restrição de aminoácidos aumentou a expressão de caspase-3 total e da eNOS total, efeito que foi abolido pela taurina 30 mM. A restrição de aminoácidos e/ou a taurina não alteraram significativamente a expressão de Akt total ou fosforilada, de AMPK alfa total, Bcl-2, Bax e caspase-3 clivada. Porém observou-se aumento da fosforilação (p) em sítio de ativação da eNOS e da AMPK alfa no grupo restrito exposto à taurina 30 mM. Para verificar se os efeitos da restrição de aminoácidos in vitro são semelhantes aos efeitos da restrição proteica induzida in vivo, realizou-se a incubação de células endoteliais em meio contento soro (10%) de camundongos submetidos à restrição proteica in vivo. Os resultados preliminares não apresentaram significância estatística, mas indicam uma tendência de aumento de apoptose e redução da migração das células endoteliais expostas ao soro dos animais submetidos à restrição proteica in vivo. Em conclusão, os dados sugerem que a restrição de aminoácidos in vitro predispõe as células endoteliais à apoptose, redução da migração, menor produção de NO e maior produção de EROS. Esses efeitos, à exceção da migração, foram atenuados pela exposição à taurina, associado à maior expressão de p-eNOS e p-AMPK alfa. Assim, a restrição de aminoácidos é um potencial mecanismo indutor de disfunção endotelial em consequência da desnutrição proteica, que pode ser parcialmente prevenido pela suplementação com taurina Abstract: Endothelial dysfunction is a common feature of several cardiovascular diseases. It is known that protein malnutrition predisposes to endothelial dysfunction and hypertension, although the mechanisms are not fully understood. Taurine, an amino acid with vasodilating and antioxidant action has emerged as a potential therapeutic adjuvant for the prevention of malnutrition comorbidities. Thus, the aim of this study was to evaluate the effect of in vitro amino acid (Aa) restriction on endothelial cell migration, apoptosis and nitric oxide (NO) signaling, with a possible protective effect of taurine. For this, bovine aortic endothelial cells (BAEC) were exposed to a culture medium (DMEM) containing 100% or 25% Aa for 48 hours in the presence or absence of 3 or 30 mM taurine. Apoptosis was evaluated by the HO-Pi assay, migration by the wound healing assay, NO production by DAF-2DA fluorescence, reactive oxygen species (ROS) generation by DHE fluorescence, and protein expression in cell lysate by Western-blotting. As results, it was observed that the exposure to Aa restricted medium increased endothelial cells apoptosis, which was prevented by 30 mM taurine only. Endothelial cells exposed to Aa restriction showed a reduction in the healing area compared to control cells suggesting reduced migration, that was not modified either by 3 or 30mM taurine. In vitro Aa restriction reduced NO production while increased ROS generation, as compared to control cells, which was prevented by 30 mM taurine. Western blotting analysis revealed an increased expression of total caspase-3 and total eNOS in endothelial cells exposed to Aa restricted medium. 30 mM taurine reversed caspase-3 and total eNOS expression as well as increased phosphorylation (p) of eNOS and AMPK alfa in Aa restricted cells. Aa restriction or taurine did not significantly alter the expression of total or phosphorylated Akt, total AMPK alfa, Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3. Next, endothelial cells were incubated with medium containing serum (10%) of mice submitted to protein restriction in vivo. The preliminary results indicate a tendency towards an increase in apoptosis and a reduction in cell migration in BAEC exposed to the serum of protein restricted mice, although not statistically significant. In conclusion, our data suggest that in vitro Aa restriction predisposes endothelial cells to apoptosis, impaired cell migration, less NO production and greater ROS production. These effects except migration were mitigated by taurine. Taurine enhanced eNOS and AMPK? phosphorylation which may be related to the protective effect of taurine in endothelial cells. Thus, the restriction of amino acids is a potential mechanism that induces endothelial dysfunction as a result of protein malnutrition, which can be partially prevented by supplementation with taurine Mestrado Fisiologia Mestra em Biologia Funcional e Molecular CAPES 001

Submitted by LETICIA DE BARROS SENE null (lbarrosene@gmail.com) on 2017-01-11T22:30:57Z No. of bitstreams: 1 tese_repositorio.pdf: 7103521 bytes, checksum: da4c2134641a1e5c0563d9198c1bf9a7 (MD5) Rejected by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: Incluir o número do processo de financiamento nos agradecimentos da dissertação/tese. Corrija esta informação e realize uma nova submissão com o arquivo correto. 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No. of bitstreams: 1 sene_lb_dr_bot_parc.pdf: 400898 bytes, checksum: 4cec7dbe28984921ccbc8955e331cc93 (MD5) Previous issue date: 2016-12-20 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Tanto a desnutrição proteico-calórica quanto a hipertensão representam problemas globais de saúde pública. Estudos epidemiológicos em diversas populações, bem como resultados experimentais indicam que as condições nutricionais intrauterinas "programam" o desenvolvimento de hipertensão e doença cardíaca coronariana em adultos. A privação de proteína, durante o período ativo de nefrogênese, provoca redução do número de néfrons no momento do nascimento. Assim, a predisposição para hipertensão arterial pode ser determinada, pelo menos em parte, pelo desenvolvimento anormal dos rins. No entanto, não é conhecido os mecanismos que comprometem o processo de nefrogênese. Estudos recentes mostram que o número de células-tronco presentes no cap mesenquimal (CM), em torno da extremidade dos brotos do ureter, determina o número de néfrons que serão formados. Nosso grupo demonstrou anteriormente, redução significativa (27%) do número de néfrons, em prole masculina adulta, proveniente de ratas submetidas à restrição proteica gestacional. O objetivo deste trabalho foi verificar a área, o índice de morte e proliferação celular, a expressão gênica e de miRNAs, número de células positivas para proteínas controladoras do ciclo celular e marcadoras de células tronco progenitoras em metanefros de machos da prole de ratas submetidas à restrição proteica gestacional, comparativamente aos seus controles, em diferentes períodos da ontogênese renal. Ratas Wistar foram alimentadas durante a prenhez com dietas com conteúdo normal de proteína (NP 17% de caseína) ou baixo conteúdo de proteína (LP 6% de caseína). No 17º e 21º de dia de gestação (DG) e no 7º dia pós-natal (DPN) os rins foram processados para coloração de HE, imunolocalização, sequenciamento (NGS) e RT-qPCR. Foi obtido um grande número de miRNAs diferencialmente expressos, entre eles, o miR-127-3p, let-7a-5p, miR-199a-5p, miR-298-5p, miR-144-3p, miR-181a-5p e o miR-181c-5p, que foram validados por RT-qPCR. Os animais LP, com 17 DG, apresentaram redução da área renal total, da área nefrogênica e redução de células em proliferação. Os animais LP, com 21DG, também apresentaram redução da área nefrogênica, além de menor peso do rim. O miR-127-3p, o miR-144-3p e o miR-199a-5p está menos expresso nos animais LP de 17 DG, enquanto que o miR-181a-5p, miR-181c-3p e o let-7a-5p estão mais expressos. O Six2, está diminuído nos animais LP de 17 DG, assim como o c-Myc, Vegf e Notch1. Já Bax, Tgfb1, Bcl6, c-Ret, Map2k2, Mki67, mTOR, β-Catenina, Zeb1, Zeb2 e Igf1 estão mais expressos nesses animais. Já nos animais LP de 21 DG o miR-127-3p, miR-298-5p, let-7a-5p, miR-181a-5p e o miR-181c-3p estão com sua expressão aumentada. Six2, Bax, Casp3, Col1, Gdnf, Tgfb1, Bcl2, Bcl6, c-Ret, Prdm1, Vegf, Mki67, β-Catenina, Zeb1, Zeb2, Notch1 e Igf1 estão mais expressos nos animais LP de 21 DG. Enquanto que Pcna, c-Myc estão com sua expressão reduzida. A expressão do miR-181a-5p está maior nos animais LP com 7 DPN e a expressão de let-7a-5p está reduzida. mTOR está regulada negativamente nos animais LP de 7 DPN, e Bax, Bim, Casp3, Col1, Gdnf, Tgfb1, Bcl2, Bcl6, Ciclina A, Map2k2, Prdm1, Vegf, β-Catenina, Zeb1, Zeb2, Notch1 e Igf1 estão regulados positivamente. Em conclusão, este estudo indicou que a redução do número de néfrons (28%) induzida por restrição proteica gestacional é determinada, pelo menos em parte, pela redução na população de células tronco progenitoras (28%) e de mitose no 17º dia gestacional. A restrição proteica gestacional altera a expressão de miRNAs e genes-alvos que estão associados com processos de apoptose, proliferação e diferenciação celular que são essenciais durante o desenvolvimento renal. Both the protein-calorie malnutrition and hypertension represent global problems of public health. Epidemiologic studies in diverse populations, as well as experimental results indicate that intrauterine nutritional conditions "program" the development of hypertension and coronary heart disease in adults. The protein deprivation, during the active period of nephrogenesis, causes a reduction in the number of nephrons at birth. Thus, the predisposition to hypertension can be determined, at least in part, by abnormal kidney development. However, it is not known the mechanism that lead to undertakes the nephrogenesis process. Recent studies show that the number of stem cells present in the mesenchymal cap (CM), around the tip of the bud of the ureter, determines the number of nephrons to be formed. We have demonstrated, in adult male offspring, from rats submitted to gestational protein restriction, a significant reduction (27%) of the nephron number. The aim of present study was investigated to verify the area, cell death and proliferation index, gene and miRNA expression, number of cells positive for cell cycle control proteins and markers of progenitor stem cells in metanephro male offspring of rats submitted to gestational protein restriction, compared to their controls, in different periods of renal ontogenesis. Wistar rats were fed during pregnancy with normal-protein (NP 17% casein) or low-protein (LP 6% casein) diet. In the 17th and 21th gestational day (DG) and 7th day of life (DPN) the kidneys were processed to immunolocalization, Next Sequencing Generation (NGS), and RT-qPCR. A big number of differentially expressed miRNAs was obtained among them, miR-127-3p, let-7a-5p, miR-199a-5p, miR-298-5p, miR-144-3p, miR-181a-5p and miR-181c-5p, these were validated by RT-qPCR. LP animals, with 17 DG, presented reduction of the total renal area, the nephrogenic area and cells proliferating were reduced. LP animals, with 21DG, also presented a reduction of the nephrogenic area, as well as a lower weight of the kidney. miR-127-3p, miR-144-3p and miR-199a-5p were downregulated in the 17DG-LP animals, while miR-181a-5p, miR-181c-3p and let-7a- 5p were upregulated. Six2, was decreased in 17 DG-LP animals, as well as c-Myc, Vegf and Notch1. Bax, Tgfb1, Bcl6, c-Ret, Map2k2, Mki67, mTOR, β-Catenin, Zeb1, Zeb2 and Igf1 were upregulated in these animals. In the 21 DG-LP animals, miR-127-3p, miR-298-5p, let-7a-5p, miR-181a-5p and miR-181c-3p were increased expression. Six2, Bax, Casp3, Col1, Gdnf, Tgfb1, Bcl2, Bcl6, c-Ret, Prdm1, Vegf, Mki67, β-Catenina, Zeb1, Zeb2, Notch1 e Igf1 were more expressed in 21DG-LP animals. Whereas Pcna, c-Myc are reduced in expression. Expression of miR-181a-5p was higher in LP animals with 7 DPN and let-7a-5p expression was reduced. mTOR was downregulated in the LP animals of 7 DPN, and Bax, Bim, Casp3, Col1, Gdnf, Tgfb1, Bcl2, Bcl6, Cyclin A, Map2k2, Prdm1, Vegf, β-Catenin, Zeb1, Zeb2, Notch1 and Igf1 are regulated positively. In conclusion, this study indicated that the nephron number reduction (28%) induced by gestational protein restriction is determined, at least in part, by reduction in mitosis and kidney mesenchymal stem/progenitor cell population (28%) at 17th gestational day. Gestational protein restriction alters the expression of miRNAs and target genes that are associated with proliferation, cell differentiation and apoptosis processes that are essential during renal development. FAPESP: 2012/18492-4 FAPESP: 2015/15148-9

Introdução: A principal manipulação dietética utilizada para reduzir a progressão da doença renal crônica (DRC) é a restrição de proteínas, sendo importante o controle eficaz do consumo proteico de pacientes com perda progressiva da função renal. Objetivo: analisar a utilização do registro alimentar (RA) para avaliação da ingestão proteica de pacientes com DRC em tratamento conservador, considerando o Equivalente Proteico do Aparecimento de Nitrogênio Ureico (PNA) como método de referência. Metodologia: avaliaram-se os prontuários de pacientes adultos submetidos ao acompanhamento nutricional no Serviço de Nefrologia e Nutrição do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais, no período de janeiro de 2009 a dezembro de 2011. Foram coletados dados clínicos, epidemiológicos, antropométricos, bioquímicos e registros alimentares no prontuário e na ficha de anamnese do serviço. A ingestão proteica estimada por meio do RA foi comparada aos valores de PNA em dois momentos distintos, ambos referentes ao mesmo dia de avaliação. Resultados: foram incluídos no estudo 45 pacientes, sendo 23 (51,1%) do sexo masculino. A idade foi superior a 60 anos em 25 pacientes (55,6%) e a escolaridade média foi de 5,62 ± 3,73 anos de estudo. Vinte e sete pacientes (60%) apresentaram índice de massa corporal aumentado. Não houve diferença significante da massa muscular e adiposa nos dois momentos em que foram avaliados em relação à faixa etária e sexo. Não houve correlação entre a avaliação da ingestão proteica pelo RA e o PNA nos dois momentos de avaliação (teste de correlação de Pearson; r=0,06 e p=0,69 e r=0,15 e p=0,32, respectivamente). A ingestão calórica média nos dois momentos de avaliação por meio do RA foi abaixo da recomendação. Conclusão: na amostra estudada não houve correlação do RA com o método de referência PNA para avaliação da ingestão proteica em pacientes com DRC em tratamento conservador. Introduction: The main dietary manipulation used to slow the progression of chronic kidney disease (CKD) is the restriction of proteins. Therefore, it is important to effectively control the protein intake of patients with progressive loss of renal function. Objective: To analyze the use of dietary records (DR) to evaluate the protein intake of patients with CKD on conservative treatment, considering the protein equivalent of urea nitrogen appearance (PNA) as the reference method. Methodology: the medical records of adult patients undergoing nutritional counseling at Nephrology and Nutrition Healthcare Service of Hospital das Clínicas, Federal University of Minas Gerais were evaluated from January 2009 to December 2011. Clinical, epidemiological, anthropometric and biochemical as well as dietary data were collected from the medical records and the anamnesis chart of the service. Protein intake estimated by the DR was compared to values of PNA at two different times, both referring to the same day of evaluation. Results: out of 45 patients included in the study, 23 (51.1%) were male and 25 patients (55.6%) were older than 60 years. The average education was 5.62 ± 3.73 years of study. Twenty-seven patients (60%) had increased body mass index. There was no significant difference in muscle and fat mass in the two times of evaluation in relation to age and sex. There was no correlation between the assessment of protein intake by DR and PNA in the two times of evaluation (Pearson correlation test, r = 0.06 and p = 0.69 and r = 0.15 and p = 0.32, respectively). The average caloric intake estimated by DR was lower than recommended in the two times of evaluation. Conclusion: in our sample there was no correlation between DR and the reference method PNA to assess protein intake in CKD patients on conservative treatment.

Submitted by Boris INFORMAT (boris@uerj.br) on 2021-04-26T01:16:17Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_FINAL_PUBLICADA_Graziele_Freitas_de_Bem.pdf: 1175801 bytes, checksum: 22319e120edafe066f60cd9384505aed (MD5) Made available in DSpace on 2021-04-26T01:16:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_FINAL_PUBLICADA_Graziele_Freitas_de_Bem.pdf: 1175801 bytes, checksum: 22319e120edafe066f60cd9384505aed (MD5) Previous issue date: 2012-02-13 Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro Some studies show that the plant Euterpe oleracea Mart., açaí, (ASE) is rich in polyphenols and other evidence suggests that a diet rich in polyphenols may be involved in protection against cardiovascular. Thus, the aim of this study was to evaluate the effect of treatment with extract ASE (200mg/Kg/day), on the renal, cardiovascular, metabolic, morphological and oxidative stress in adult offspring with sixteen weeks, whose mothers were fed a low protein diet (LP) during pregnancy. Four groups of rats were fed experimental diets: control (20% protein); control + ASE (20% protein + ASE); LP (6% protein); LP + ASE (6% protein + ASE) during pregnancy. After weaning, all pups have become fed a control diet and were sacrificed at four months of age. Systolic blood pressure (SBP) was measured by plethysmography and vasodilator effect of acetylcholine (Ach) and nitroglycerin (NG) were studied in perfused mesenteric arterial bed (LAM). We determined the body weight, serum levels total cholesterol, triglycerides, high-density lipoprotein (HDL), albumin, urea, creatinine, glucose, insulin, insulin resistance was calculed by HOMA IR, sodium, potassium, creatinine clearance, urine volume, fractional excretion of sodium, plasma renin levels and renal glomeruli number. Oxidative damage, nitrite levels and antioxidant enzyme activity: superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase were measured in plasma and homogenate of kidney. The body weight was decreased in LP group and recovered with ASE. The SBP was higher in LP animals than other groups and reversed by treatment with ASE. The plasma renin levels were increased in the LP group with ASE decreased these levels. The vasodilator response to Ach was reduced in LP group with ASE increased this response. The vasodilator effect of NG was not different between groups. The LP group was also observed increased levels of total cholesterol, triglycerides, urea, creatinine, potassium, glucose, insulin, fractional excretion of sodium; the same were reduced with ASE. There was no difference in HDL, sodium, creatinine clearance, urine volume levels in both groups. The levels of malondialdehyde and protein carbonyls were increased and nitrite levels were decreased in the LP group were reversed by ASE. The activities of antioxidant enzymes in plasma and kidney were lower in LP animal than other gruop and increased by the treatment with ASE, except for catalase which showed no significant difference between groups. Animals LP showed an reduction in the number of renal glomeruli and treatment with ASE prevent renal changes found in this model. In conclusion, ASE appers to protect the offsprings whose mother exposed to a low protein diet during pregnancy, through the anti-hypertensive, vasodilator and antioxidant activity observed in this study. Alguns trabalhos demonstraram que a planta, Euterpe oleracea Mart. (açaí) é rica em polifenóis e que uma dieta rica em polifenóis pode estar envolvida na proteção contra o risco cardiovascular. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do tratamento com o extrato hidroalcoólico do caroço do açaí (ASE) (200mg/Kg/dia), sobre as alterações renais, cardiovasculares, metabólicas, morfológicas e o estresse oxidativo na prole adulta com dezesseis semanas, cujas mães foram submetidas a uma dieta hipoprotéica durante a gestação. Quatro grupos de ratas foram alimentados com dietas experimentais: controle (20% de proteínas); controle + ASE (20% de proteína + ASE); hipoprotéica (6% de proteína); hipoprotéica + ASE (6% de proteína + ASE) durante a gestação. Após o desmame, todos os filhotes passaram a ser alimentados com uma dieta controle e foram sacrificados com 4 meses de idade. A pressão arterial sistólica (PAS) foi medida por pletismografia de cauda e o efeito vasodilatador da acetilcolina (ACh) e nitroglicerina (NG) foi avaliado em leito arterial mesentérico (LAM) perfundido. Foram determinados o peso corporal, níveis séricos de colesterol total, triglicerídeos, lipoproteína de alta densidade (HDL), albumina, uréia, creatinina, glicose, insulina, resistência à insulina (índice de Homa IR), sódio, potássio e a renina plasmática. Foi avaliada a depuração de creatinina, volume de urina, excreção fracionada de sódio (EFNa) e o número de glomérulos renais. O dano oxidativo, níveis de nitrito e a atividade das enzimas antioxidantes: superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase foram dosados no plasma e homogenato de rim. O peso corporal foi menor no grupo hipoprotéico e recuperado com ASE. A PAS foi aumentada no grupo hipoprotéico e revertida pelo tratamento com ASE. Os níveis de renina plasmática foram aumentados no grupo hipoprotéico e reduzidos com ASE. A resposta vasodilatadora à ACh em LAM estava reduzida no grupo hipoprotéico com ASE houve uma melhora dessa resposta.O efeito vasodilatador da NG não foi diferente entre os grupos. No grupo hipoprotéico também foi observado o aumento dos níveis de triglicerídeos, colesterol total, uréia, creatinina, glicose e insulina, os mesmos foram reduzidos pelo ASE. Não houve diferença nos níveis de HDL, sódio, potássio, depuração de creatinina e volume urinário nos grupos estudados. Os níveis de malondialdeído e carbonilação de proteínas estavam aumentados e os níveis de nitrito reduzidos no grupo hipoprotéico e foram revertidos pelo ASE. As atividades das enzimas antioxidantes no plasma e no rim foram reduzidas no grupo hipoprotéico e aumentadas pelo ASE, com exceção da catalase que não apresentou diferença entre os grupos. Os animais hipoprotéicos apresentaram redução no número de glomérulos renais e aumento da EFNa e o tratamento com ASE preveniu as alterações renais encontradas neste modelo. Em conclusão, o ASE parece proteger a prole, cujas mães foram expostas a uma dieta com pouca proteína durante a gestação, através do efeito anti-hipertensivo, vasodilatador e antioxidante observado neste trabalho.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-05T18:07:45Z No. of bitstreams: 1 Geraldo de Oliveira Silva Junior Tese completa.pdf: 6479479 bytes, checksum: a1946b21845635a9821327ff2ba50b05 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-05T18:07:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Geraldo de Oliveira Silva Junior Tese completa.pdf: 6479479 bytes, checksum: a1946b21845635a9821327ff2ba50b05 (MD5) Previous issue date: 2011-10-14 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro Programming of fetal development is considered to be an important risk factor for non-communicable diseases of adulthood, including coronary heart disease (CHD). Aiming to investigate the association between maternal nutrition and the development of the coronary arteries (CA) in staged mice embryos, C57BL/6 mice embryos from stages 16 to 23 were taken from mothers fed a normal protein (NP) or low protein (LP) diet, and the CA were studied. Although the LP embryos had lower masses, they had faster heart growth rates when compared to the NP embryos. The subepicardial plexuses were observed earlier in the NP embryos (stage 20) than in the LP ones (stage 22) (P

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-05T16:42:38Z No. of bitstreams: 1 Dissert_Juliana Giglio.pdf: 1281128 bytes, checksum: 1624fc33e1f7769df58cfc4e53d4ea91 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-05T16:42:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_Juliana Giglio.pdf: 1281128 bytes, checksum: 1624fc33e1f7769df58cfc4e53d4ea91 (MD5) Previous issue date: 2011-07-04 Nondialyzed chronic kidney disease (CKD) patients are normally counseled to follow a low protein and sodium diet. Nationals and internationals surveys have shown a low adherence to such diet. In addition, it has been also demonstrated that maintaining a low protein and sodium intake is difficult, because it requires important changes in eating habits. The objective of the present study was to evaluate the impact of a nutritional education program on the adherence to the low protein diet in CKD patients being followed in a conservative outpatient clinic. Study design: clinical, randomized, controlled and prospective essay (follow-up of 5 ±1.5 months (mean ± SD)). Eighty five nondialyzed CKD patients, under treatment in two CKD outpatient clinics from Pedro Ernesto University Hospital, were included in this study. These patients were randomized in two groups: Intervention (n=39) and Control (n=46). The patients of the Intervention Group were submitted to a nutritional education program, besides the low protein diet prescription (0.6 to 0.75 g/kg/day). The patients from the Control Group were submitted only to the low protein diet prescription (0.6 to 0.75 g/kg/day). The evaluation of the adherence was done by estimating the protein intake from the 24 hour food recall. The adherence criterion adopted was to present, at the end of the study, a reduction of at least 20% of the initial protein intake. The nutritional and laboratorial assessments were made at the beginning and at the end of the follow-up period. The anthropometric parameters assessed were body weight, height, triceps , biceps , subscapulars and suprailiac s skinfolds thicknesses and waist s and arm s circumferences. The laboratorial parameters included plasma creatinine, urea, potassium, phosphate, glucose and albumin and 24 hour urine s sodium and urea. In the total studied sample, 51.8% of the patients were male, with an mean age of 63.4 ± 11.0 years, mean BMI indicating overweight (28.8 ±5.4 kg/m²) and a mean glomerular filtration rate (GFR) of 32.6 ±12.2 mL/mim/1,73m². The main characteristics at the beginning of the follow-up were not different between Intervention and Control Groups. Both groups presented an improvement on the laboratorial and anthropometrical parameters, with significant reduction of plasma urea and glucose in the Control Group (P < 0.05 vs baseline) and BMI in both groups (P < 0.05 vs baseline). After the follow-up period, the Intervention and Control Groups showed a significant decrease in the protein intake (0.62 ±0.2 vs 0.77 ±0.26 g/kg/day, respectively). The sodium intake did not significantly change in both groups at the beginning and end of the study. A higher degree of adherence to the low protein diet was observed in Intervention Group (74.4%) than in Control Group (47.8%) (P < 0.05). The multivariate logistic regression analysis revealed that belonging to the Intervention Group and male gender were significantly associated with Adherence (P < 0.05), even after controlling to others tested variables. Based on these findings, it can be concluded that the nutritional education program was an effective tool to reduce the protein intake of nondialyzed CKD patients, as it has leaded to an improvement in the adherence to the low protein diet, and promoted an amelioration of anthropometric and laboratorial parameters. Pacientes com doença renal crônica (DRC) na fase não dialítica são normalmente orientados a seguir uma dieta hipoproteica e hipossódica. Estudos nacionais e internacionais mostram que a adesão a essa dieta tem sido baixa e difícil de ser mantida, pois requer mudanças importantes no hábito alimentar. O objetivo do presente estudo foi avaliar o impacto de um programa de educação nutricional sobre a adesão à dieta hipoproteica em pacientes com DRC em tratamento conservador. Trata-se de um ensaio clínico randomizado, prospectivo com duração de 5 ±1,5 meses. Foram acompanhados 85 pacientes com DRC na fase não dialítica, atendidos em dois Ambulatórios de Nutrição e Doenças Renais do Hospital Universitário Pedro Ernesto. Os pacientes foram divididos de forma aleatória em 2 grupos: Intervenção (n=39) e Controle (n=46). Os pacientes do Grupo Intervenção foram submetidos a um programa de educação nutricional, além da orientação de dieta hipoproteica (0,6 a 0,75 g/kg/dia). Os pacientes do Grupo Controle foram submetidos apenas à orientação de dieta hipoproteica (0,6 a 0,75 g/kg/dia). A avaliação da adesão foi feita a partir da estimativa do consumo de proteína por recordatório alimentar de 24 horas. Adotou-se como critério de adesão apresentar ao final do estudo redução de ao menos 20% da ingestão proteica inicial. A avaliação nutricional e laboratorial foi realizada no início e no término do estudo. Os parâmetros antropométricos avaliados foram peso, estatura, dobras cutâneas do tríceps, bíceps, subescapular e supra-ilíaca e perímetro da cintura e do braço. As laboratoriais foram creatinina, uréia, potássio, fósforo, glicose e albumina no plasma e sódio e uréia na urina de 24 horas. Ao avaliar o amostra total, 51,8% dos pacientes eram do sexo masculino, com média de idade de 63,4 ±11,0 anos, IMC indicativo de sobrepeso (28,8 ±5,4 kg/m2) e filtração glomerular estimada (FGe) de 32,6 ±12,2 mL/mim/1,73m2. As características iniciais não diferiram entre os Grupos Intervenção e Controle. Ambos os grupos apresentaram melhora dos parâmetros laboratoriais e antropometricos, com redução significante da uréia plasmática e da glicemia no Grupo Controle (P < 0,05 vs início do estudo) e do IMC em ambos os grupos (P < 0,05 vs início do estudo). Após o período de acompanhamento, o Grupo Intervenção e o Grupo Controle apresentaram ingestão proteica significantemente diferente (0,62 ±0,2 vs 0,77 ±0,26 g/kg/dia, respectivamente). A ingestão de sódio não mudou de forma significante em ambos os grupos no inicio e término do acompanhamento. A Adesão à ingestão proteica foi observada em 74,4% do Grupo Intervenção e em 47,8% do Grupo Controle (P < 0,05). A análise de regressão logística multivariada revelou que pertencer ao Grupo Intervenção e sexo masculino se associaram com a Adesão (P

Orientador: Everardo Magalhães Carneiro Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A glutamato desidrogenase (GDH) é uma enzima mitochondrial que cataliza a reação reversível de glutamato a ?-cetoglutarato. Nas ilhotas pancreáticas, está associada com a secreção de insulina por aumentar a concentração de ATP. Ratos alimentados com dieta hipoprotéica apresentam secreção de insulina diminuída. A suplementação com leucina (LEU) aumenta a secreção de insulina em resposta a agentes insulinotrópicos. O presente estudo investigou a influência da suplementação com LEU na expressão da GDH e seu envolvimento com a secreção de insulina em ratos desnutridos e suplementados com LEU. Ratos machos foram alimentados com dietas normo- (17%, NP) ou hipoprotéicas (6%, LP) por oito semanas. Após, foram divididos e suplementados com LEU (1,5%) na água de beber (NPL e LPL) pelas quatro semanas seguintes. O conteúdo protéico de GDH no cérebro, fígado, rim e músculo esquelético não diferiu entre os grupos. Nas ilhotas LP, a expressão da GDH estava diminuída e a suplementação com LEU aumentou a expressão de RNAm restaurando o conteúdo protéico a valores similares a NP. A secreção de insulina estimulada por agentes insulinotrópicos ou inibidores, combinados ou não, estava diminuída em ilhotas LP comparada com NP. A suplementação com LEU aumentou a secreção de insulina a valores similares a NP, exceto quando as ilhotas LPL foram incubadas com EGCG. Ilhotas LP tiveram diminuição na [Ca2+]i quando expostas a GLN+BCH. A suplementação com LEU restaurou esses parâmetros aos valores de NP. Frente a esses resultados, podemos concluir que a diminuição na expressão da GDH induzida pela dieta LP foi central ao pâncreas endócrino e está associada à redução da secreção de insulina observada nas ilhotas LP. A suplementação com LEU foi capaz de restaurar a expressão da GDH, contribuindo para o aumento da secreção de insulina observado nas ilhotas LPL. Além disso, a GDH pode, ainda, estar associada com a secreção de insulina pelo acoplamento estímulo/secreção via regulação da [Ca2+]i Abstract: Glutamate dehydrogenase (GDH) is a mitochondrial matrix enzyme that catalyzes the reversible reaction of glutamate to ?-ketoglutarate. In the pancreatic islets, this enzyme is associated with insulin secretion by augmenting ATP levels. Protein malnourished rats displayed reduced insulin secretion. Leucine (LEU) supplementation augments the insulin secretion response to insulinotropic agents. The present study investigated the influence of LEU supplementation on GDH expression and its involvement with insulin secretion in malnourished rats supplemented with LEU. Male rats were fed normal- (17%, NP) or low-protein diet (6%, LP) for eight weeks. Half of rats of each group were supplemented with LEU (1.5%) in drinking water for the following four weeks (NPL and LPL groups). GDH protein content in brain, liver, kidney and skeletal muscles was not different in any group. GDH RNAm and protein content was reduced in LP islets and LEU supplementation augmented RNAm expression restoring protein content similar to NP. Insulin secretion was reduced in LP islets compared with NP when stimulated by insulinotropics agents or inhybitors, combinaned or not. LEU supplementation augmented insulin secretion to similar values as NP, an effect that was blunted when LPL islets were incubated with EGCG. LP islets showed lower [Ca2+]i when exposed to GLN+BCH. LEU supplementation augmented these patterns similar to NP. Taken together, we may conclude that diminution in GDH expression induced by LP diet was central to endocrine pancreas and was associated with reduced insulin secretion observed in LP rats. LEU supplementation was able to restore GDH expression and it was capable to restore insulin secretion via GDH restoration. Yet, GDH may contribute to insulin secretion via Ca2+ regulation stimulus/secretion coupling Doutorado Fisiologia Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Everardo Magalhães Carneiro Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A desnutrição ainda é um problema de saúde pública que afeta principalmente países em desenvolvimento e sua prevalência chega a ser crescente em algumas áreas. Vários estudos obtiveram êxito em correlacionar a má nutrição em estágios iniciais de vida com o desenvolvimento de doenças cardiovasculares e diabetes tipo 2 na vida adulta. No modelo de desnutrição pós desmame verifica-se menor secreção de insulina estimulada por glicose e outros agentes insulinotrópicos bem como menor expressão de várias proteínas envolvidas com a funcionalidade da célula b. Estudos realizados por nosso grupo e outros laboratórios mostram que a suplementação de camundongos com taurina aumenta a secreção de insulina além de regular o influxo de íons Ca2+ para as células b, etapa crucial para o processo secretório. Para avaliar os efeitos da taurina sobre animais desnutridos, utilizamos ratos wistar, machos com 21 dias de vida. Os animais receberam dieta contendo 17% de proteína (normoprotéica) (C) ou 6% de proteína (hipoprotéica) (D). Animais C e D receberam suplementação com taurina a 2,5% na água de beber por 30 dias (CT30 e DT30) ou 90 dias (CT90 e DT90). Em seguida avaliamos parâmetros biométricos e bioquímicos, tolerância à glicose, secreção de insulina estimulada por glicose e pelo agonista colinérgico carbacol, expressão de proteínas envolvidas no controle da secreção de insulina e, finalmente, registramos os movimentos citoplasmáticos de íons Ca2+ após estímulo com glicose e carbacol. Verificamos que a restrição protéica retardou o crescimento dos animais além de reduzir a concentração plasmática de proteínas totais (C = 6,81±0,04; CT30 = 7,15±0,54; CT90 = 6,87±0,19; D = 5,35±0,24; DT30 = 5,37±0,28; DT90 = 5,70±0,09 g/dl; n = 3-5) e albumina (C = 3,20±0,11; CT30 = 3,41±0,02; CT90 = 3,18±0,05; D = 2,74±0,07; DT30 = 2,49±0,09; DT90 = 2,67±0,04 g/dl; n = 5-9) sem efeito da suplementação com taurina. Os animais D se mostraram mais tolerantes à glicose e a suplementação com taurina por 90 dias restaurou parcialmente a tolerância desses animais (C = 30249±2682; CT30 = 37255±6691; CT90 = 29365±2257; D = 16916±1609; DT30 = 18791±2859; DT90 = 23425±3856 AAC; n = 5-9). Nesse trabalho mostramos que a suplementação com taurina corrige a hipoinsulinemia verificada em animais desnutridos alimentados (C = 4,97±0,34; CT90 = 3,56±0,52; D = 1,39±0,10; DT90 = 3,31±0,70 ng/ml; n = 5-8) bem como a responsividade de ilhotas isoladas a concentrações crescentes de glicose. Verificamos também que a taurina normaliza a secreção de insulina potencializada pelo carbacol (C = 9,4+0,8; CT90 = 12,4+0,7; D = 6,4+0,5; DT90 = 9+0,7 ng/ml; n = 12). As respostas secretórias foram observadas em conjunto com a regulação da expressão das proteínas SERCA3 (C = 100+21; CT90 = 174+17; D =96+90; DT90 = 149+11 % do C; n = 6), receptor muscarínico M3 (C = 100+24; CT90 = 155+80; D = 51+10; DT90 = 108+14 % do C; n = 5) e sintaxina 1 (C = 100+30; CT90 = 92+40; D = 50+12; DT90 = 77+11 % do C; n = 5) que participam do controle de diferentes etapas do processo de secreção de insulina. Por fim, verificamos que a suplementação com taurina melhorou o padrão de oscilação de íons Ca2+ após estímulo com glicose. Concluímos então que a suplementação com taurina por 90 dias restaura a sensibilidade das ilhotas à glicose e ao carbacol possivelmente pela regulação do fluxo de cálcio para as células b bem como pela modulação da expressão de proteínas que controlam o processo de secreção de insulina. Abstract: Malnutrition still is a public health issue, especially in developing countries. Many studies correlate malnourishment during early life and the development of cardiovascular disease and type 2 Diabetes Mellitus on latter stages. Animal models of malnutrition reveal impaired insulin secretion stimulated by glucose and other insulinotropic agents as well as lower expression of key proteins for b cell function. The literature shows that taurine supplementation increases insulin secretion and regulates calcium dynamics on b cells. Male, 21 days old, wistar rats received diet containing 17% (C) or 6% (D) of protein. Both groups received taurine supplementation on the drinking water for 30 (CT 30 and DT 30) and 90 (CT90 and DT 30) days. Next we assessed biometric and biochemical parameters, glucose tolerance, glucose and carbacholstimulated insulin secretion, protein expression of muscarinic M3 receptor, Phospholipase C b2, SERCA3, Syntaxin 1 and, finally, we registered cytoplasmic Ca2+ after stimulus with glucose and carbachol. Protein restricted rats showed lower body weight, plasma proteins (C = 6,81±0,04; CT30 = 7,15±0,54; CT90 = 6,87±0,19; D = 5,35±0,24; DT30 = 5,37±0,28; DT90 = 5,70±0,09 g/dl; n = 3-5), albumin (C = 3,20±0,11; CT30 = 3,41±0,02; CT90 = 3,18±0,05; D = 2,74±0,07; DT30 = 2,49±0,09; DT90 = 2,67±0,04 g/dl; n = 5-9) and increased glucose tolerance (C = 30249±2682; CT30 = 37255±6691; CT90 = 29365±2257; D = 16916±1609; DT30 = 18791±2859; DT90 = 23425±3856 AUC; n = 5-9). Taurine supplementation had no effect upon nutritional status parameters and partially restored glucose tolerance and insulinemia to C levels. Taurine increased secretory response to glucose and carbachol (C = 9,4+0,8; CT90 = 12,4+0,7; D = 6,4+0,5; DT90 = 9+0,7 ng/ml; n = 12). It also increased protein expression of M3 receptor (C = 100+24; CT90 = 155+80; D = 51+10; DT90 = 108+14 % of C; n = 5), SERCA 3 (C = 100+21; CT90 = 174+17; D =96+90; DT90 = 149+11 % of C; n = 6) and syntaxin 1 (C = 100+30; CT90 = 92+40; D = 50+12; DT90 = 77+11 % of C; n = 5). Finally, taurine supplementation for 90 days improved Ca2+ dynamics when the islets were stimulated with glucose. In conclusion, these data show that taurine supplementation restores secretory responsiveness to glucose and carbachol possibly through Ca2+ dynamics modulation and increased expression of key proteins for insulin secretion. Mestrado Fisiologia Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico ciático e sobre o crescimento corporal de ratos adultos que receberam dieta hipoprotéica durante a gestação e lactação. Ratos machos Wistar (n=35) foram mantidos em condições padronizadas de biotério. Os animais foram obtidos acasalando-se ratas primíparas (Wistar, n=17, peso corporal = 241,2±23,1g) com machos da mesma linhagem, numa proporção de duas fêmeas para cada macho, segundo o ciclo estral. Detectada a prenhez através da presença de espermatozóides na secreção vaginal, as ratas foram distribuídas em grupo Nutrido (N, n= 9, caseína 17%) e grupo Desnutrido (D, n = 8, caseína 8%) e receberam dieta conforme seu grupo nutricional durante a gestação e lactação. A recuperação nutricional iniciou no 21º dia pós-parto. O peso corpóreo dos filhotes foi registrado diariamente e o ganho de peso dos animais foi calculado em percentual através da fórmula: (peso de um dia x 100/ peso do dia 1) -100. Aos 60 dias de idade, os grupos nutrido e desnutrido foram subdivididos em grupos: não-treinado nutrido (NT, n=10), treinado nutrido (T, n=8), não-treinado desnutrido (NT-D, n=8), e treinado desnutrido (T-D=9). O programa de treino físico aeróbio moderado utilizou esteira ergométrica durante 8 semanas, 5 dias/semana, 60 minutos/dia. A seguir ao protocolo de treinamento (24 horas), os animais foram anestesiados via intramuscular utilizando solução de xilazina e cloridrato de ketamina para coleta do nervo ciático. Seguiu-se processamento histológico de rotina para obtenção de cortes semifinos (0,38 μm de espessura) corados com azul de toluidina e montados entre lâmina e lamínula utilizando resina sintética. Os estudos histomorfométricos foram realizados em 6 nervos ciáticos pertencentes a cada grupo experimental. Foram avaliados o perímetro do nervo ciático, o número de fibras nervosas mielinizadas de acordo com o tamanho e a densidade do nervo utilizando os programas Scion Image for Windows e Mesurim pro 06. Para análise estatística considerou-se nível de significância de 5%. A partir do 4º dia de desmame, o ganho de peso corporal (%) dos animais do grupo desnutrido (50,71±2,94) foi maior que o do grupo nutrido (43,54±1,94, p=0,033), embora o peso corpóreo (g) tenha permanecido menor (19,41±0,79) que o nutrido (36,02±1,77, p

Introdução: A maioria dos distúrbios metabólicos presentes na doença renal crônica (DRC) resulta, principalmente, do acúmulo de produtos do metabolismo do nitrogênio presentes nos alimentos ricos em proteínas. Dietas hiperprotéicas estão associadas à hiperperfusão, hipertensão e hiperfiltração glomerular e, conseqüentemente, à progressão da DRC. A dietoterapia tem um papel importante no tratamento da DRC, consistindo, principalmente, na redução da oferta diária de proteínas. Objetivo: Verificar o efeito da intervenção dietoterápica no estado nutricional, na progressão da doença renal e nos parâmetros inflamatórios, lipídicos, estado oxidativo e níveis séricos de potássio, de pacientes com insuficiência renal crônica em fase pré-dialítica. Pacientes e Métodos: Foi realizado um estudo prospectivo randomizado controlado cruzado em pacientes com DRC Estágio IV, em atendimento ambulatorial. O estudo constou de dois grupos de pacientes com DRC em fase pré-dialítica, que seguiram dois esquemas dietoterápicos diferentes, durante seis semanas: 21 pacientes iniciaram com prescrição de dieta normoprotéica (1 g/kg/dia) e 20 com prescrição de dieta hipoprotéica (0,6 g/kg/dia). Após esse período, os grupos inverteram as dietas. Foram avaliados parâmetros dietéticos, bioquímicos e antropométricos no momento basal e após seis e doze semanas. Os dados foram analisados segundo a intenção de tratamento na análise de crossover e por adesão à dieta hipoprotéica. Utilizaramse testes ANOVA para medidas repetidas e correlação de Spearman. O nível de significância adotado foi o de P < 0,05. Resultados: Foram avaliados 41 pacientes. Apenas um paciente (2,4%) foi considerado desnutrido e 28 (68%) apresentaram sobrepeso ou obesidade. Dezessete pacientes (41,5%) foram considerados inflamados, de acordo com o nível de PCR. Houve baixa adesão à dieta hipoprotéica.Não se observou prejuízo no estado nutricional dos pacientes durante o seguimento de prescrição de dieta hipoprotéica. Nos pacientes não inflamados observou-se melhora nos parâmetros de função renal, ao passo que, nos inflamados, estes parâmetros apresentaram deterioração. Observaram-se correlações negativas significativas entre os níveis séricos de HDL-colesterol e creatinina; HDL-colesterol e IMC; e correlações positivas significativas entre colesterol-total e uréia; LDL-colesterol e uréia; PNA/kg e HDL, triglicerídios e tirosina; triglicerídios e fibrinogênio; triglicerídios e creatinina; uréia e albumina. Conclusões: A adesão à dieta hipoprotéica foi muito pequena. A dieta hipoprotéica não interferiu no estado nutricional. A presença de inflamação influenciou, negativamente, a evolução da função renal. O perfil lipídico esteve relacionado ao estado nutricional, aos fatores de progressão da DRC e à inflamação; a lipoperoxidação esteve associada aos níveis séricos de albumina. Background: Most metabolic disorders presented by patients with chronic renal disease (CRD) are mainly a result of accumulation of products of nitrogen metabolism, present in protein rich foods. High protein diets are associated with hyperperfusion, hypertension and hyperfiltration of the glomeruli and, as a consequence, may accelerate the progression of CRF. Nutritional therapy plays an important role in CRF treatment, consisting mainly in reduction of daily protein intake. Objective: To verify the effect of nutrition therapy intervention on nutritional status, on renal disease progression and on inflammatory and lipid parameters, oxidative status and potassium serum levels in patients with chronic renal insufficiency in the pre dialysis period. Patients and Methods: A crossover controlled prospective, randomized study in outpatients with stage IV CRD was carried out. The study consisted in the follow up of two groups of patients with CRD in the pre dialysis period. By randomization 21 patients were started on a 1g protein/kg/day diet prescription and 20 patients on low protein diet (0.6g/kg/day). After six weeks diets were reversed between the two groups and followed for another six week period. Dietetic, biochemical and anthropometric parameters were assessed at baseline and after 6 and 12 weeks. Data were analyzed according to the intention to treat approach in the crossover analysis and by adherence to the low protein diet. ANOVA for repeated measures and Spearman´s correlation tests were used for statistical analysis. The significance level adopted was P < 0.05. Results: 41 patients were evaluated. Only one patient (2.4%) was considered undernourished and 28 patients (68%) presented either over weighted or obese. Seventeen patients (41.5%) were considered inflamed according to the level of C reactive protein (CRP). Low adherence to the low protein diet was observed. Damage on nutritional status was not observed on low protein diet. In non-inflamed patients an improvement on renal function parameters was observed, whereas in the inflamed ones these parameters presented deterioration. Significant negative correlations between HDL-cholesterol serum levels and creatinine, HDL-cholesterol and body mass index (BMI) were observed. Significant positive correlations were observed between total cholesterol and urea, LDL-cholesterol and urea, PNA/kg and HDL, triglycerides and tyrosine, triglycerides and fibrinogen, triglycerides and creatinine, urea and albumin. Conclusions: Patients adhered poorly to low protein diets. Low protein diet did not influence the nutritional status. Presence of inflammation influenced negatively the evolution of renal function. The lipid profile was related to the nutritional status, to the progression factors of CRF and to inflammation. Lipoperoxidation was associated to serum levels of albumin.

O tecido adiposo marrom, onde se localiza a proteína desacopladora 1 (UCP1 - uncoupling protein 1), é um tecido termogênico presente somente nos pequenos mamíferos e neonatos, com função de manter temperatura e peso corporal estáveis quando da exposição ao frio ou consumo de dietas hipercalóricas. Como a UCP1 está localizada exclusivamente no tecido adiposo marrom, tecido pouco expressado em adultos, os estudos dão ênfase às proteínas desacopladoras 2 e 3 (UCP2 e UCP3), proteínas homólogas à UCP1, expressas em múltiplos tecidos e nos músculos esqueléticos, respectivamente. A atividade física provoca aumento do RNAm da UCP2 e UCP3, questiona-se, porém, se este aumento é devido a mudanças no metabolismo de gordura ou a mudanças no metabolismo energético. Durante a restrição energética ou jejum, há depleção de gordura corporal e aumento da concentração plasmática de ácidos graxos livres, com regulação positiva da UCP2 e da UCP3 no músculo e aumento da oxidação lipídica. A concentração elevada de ácidos graxos representa sinal intracelular importante na indução da expressão das UCP no músculo, o que pode estar ligado à sua utilização como combustível até que ocorra aumento da demanda do organismo para dissipação da energia. No entanto, discute-se se a UCP2 e a UCP3 no músculo esquelético têm como função mediar a termogênese ou regular a oxidação de lipídios. The brown adipose tissue, where the uncoupling protein 1 (UCP1) is located, is a thermogenetic tissue only present in small mammals and neonates, with the function of keeping the temperature and body weight stable when exposed to either cold or a hypercaloric diet. Since the UCP1 is located exclusively in brown adipose tissue, and this tissue has little expression in human adults, the studies have emphasized the UCP2 and UCP3, homologous proteins to the UCP1, expressed in multiple tissues and skeletal muscle, respectively. Physical activity increases UCP2 and UCP3 mRNA but it is now being questioned if this is due to changes in lipid metabolism or energy metabolism. During food restriction and fasting, there is a decrease in the amount of body adipose tissue and increase in the plasmatic free fatty acid concentration, with up-regulation of the UCP2 and UCP3 in the muscle, and an increase in lipid oxidation. The increase in free fatty acids represents an important intracellular indication of the induction of the UCP expression in the muscle, which can be connected to its use as fuel until there is an increased demand by the organism to dissipate energy. However the discussion continues about whether the UCP2 and UCP3 in the skeletal muscle function to mediate thermogenesis or in the regulation of lipid oxidation.

A nefropatia diabética (ND) acomete até 40% dos pacientes com diabetes melito (DM) tipo 1 e tipo 2, sendo a principal causa de insuficiênca renal crônica naqueles pacientes que ingressam em programa de tratamento de substituição renal. A dieta parece ter um papel importante no desenvolvimento da doença. Existem evidências de que não apenas a quantidade mas o tipo de proteína ingerida também está associado à ND. Poucos estudos analisaram o papel dos lipídeos da dieta na ND. Dietas hipoprotéicas têm sido úteis em modificar de forma favorável a evolução da ND, desacelerando a perda de função renal em pacientes DM tipo 1 e ND. Existem poucos estudos em pacientes com DM tipo 2, porém estudos a curto prazo sugerem que esta dieta reduz a albuminúria. Entretanto, o seu uso a longo prazo é comprometido pela dificuldade de aderência à restrição protéica e pela sua segurança nutricional não estar ainda estabelecida. Resultados promissores são observados quando comparadas diferentes fontes de ingestão de proteína animal sobre a função renal e perfil lipídico sérico de pacientes com ND, podendo estas intervenções representar uma alternativa à dieta hipoprotéica no manejo dietoterápico nestes pacientes, ao atuar sobre os fatores de risco cardiovasculares e na função endotelial. Diabetic nephropathy (DN) is the leading cause of kidney disease in patients starting renal replacement therapy, and affects up to 40% of type 1 and type 2 diabetic patients. Diet seems to play an important role in the development of the disease. There are evidences supporting the concept that not only the amount but also the origin of dietary protein are associated with DN. Few studies analyzed the role of dietary lipids. A low-protein diet slows down the decline of renal function and ameliorates the DN prognosis and death in patients with type 1 diabetes with micro- and macroalbuminuria. Studies in type 2 diabetic patients are scanty but shortterm studies suggest that this approach decreases albuminuria. However, the use of low-protein diet for long periods is compromised by poor compliance and its long-term safety is not firmly established. Enthusiastic results come up when comparing the effect of different sources of animal protein on renal function and lipid profile in patients with DN, which may represent an alternative strategy for low-protein diet on medical nutritional therapy in patients with DN and in cardiovascular risk factors and endothelial function.

A insuficiência renal crônica é um diagnóstico sindrômico, causado por inúmeras doenças. Independente da causa básica, a perda de um certo número de néfrons funcionantes desencadeia processos comuns, envolvendo fatores hemodinâmicos glomerulares, fatores de crescimento, mediadores inflamatórios e outros, que levam à esclerose glomerular e à fibrose intersticial, num ciclo progressivo de deterioração da filtração glomerular. Os médicos freqüentemente subestimam as conseqüências e as implicações terapêuticas deste processo que inicia quando a bioquímica e a clínica ainda são aparentemente normais. Quase metade dos pacientes que chega à insuficiência renal terminal não teve acompanhamento médico ou mesmo conhecimento prévio da sua situação. O encaminhamento tardio ao nefrologista tem sido muito discutido como um problema que aumenta a morbi-mortalidade dos pacientes urêmicos antes e depois do início do tratamento dialítico e eleva custos. O objetivo desta revisão é dar orientações gerais sobre o manejo conservador da insuficiência renal crônica, sugerindo atitudes que devam ser tomadas em conjunto com o nefrologista ou a este referenciadas. O manejo destes pacientes inclui abordagem da doença renal básica e de danos renais agudos adicionais; prevenção da progressão da insuficiência renal; manejo de co-morbidades; tratamento de complicações da uremia; monitorização da função renal e do estado nutricional; educação do paciente e preparo para diálise e transplante. A terapia nutricional e o controle da hipertensão são medidas importantes para prevenir perda de função renal, mas outros fatores devem ser reconhecidos. Chronic renal failure is a syndromic diagnosis caused by various diseases. Regardless of the etiology, the loss of a certain number of functioning nephrons triggers common processes involving glomerular hemodynamics and growth factors, inflammatory mediators, and others that lead to glomerular sclerosis and interstitial fibrosis in a rogressive cycle of deterioration of the glomerular filtration. Physicians often underestimate the prognostic and therapeutic consequences of this process, which begins when biochemical and clinical findings are still apparently normal. Almost half of the patients who reach end-stage renal disease did not have proper medical assistance or even previous knowledge of the situation. Late referral to a nephrologist has been widely discussed as it increases the morbi-mortality of uremic patients, before andafter the beginning of dialysis, and as it increases treatment costs. Our objective is to provide general guidelines regarding the conservative treatment of chronic renal failure, suggesting measures that should be understood and carried out by, or together with, those indicated by a nephrologist. The treatment of end-stage renal disease patients includes: an approach to the primary renal disease and to additional acute renal damages; preventing the progression of renal failure; treatment of comorbidities; treatment of uremia complications; monitoring of renal function and nutritional status; patient education and preparation for dialysis and transplantation. Nutritional therapy and control of arterial hypertension are important measures in order to prevent loss of renal function; however, other factors should also be considered.