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Enterobacterales resistentes aos carbapenêmicos (ERC) são uma ameaça atual à saúde global. ERCs produtoras de Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) são mundialmente disseminadas e responsáveis por diversos surtos. Infecções por estas bactérias estão associadas a elevados índices de morbidade e mortalidade (podendo chegar a 80% nos casos de bacteremias), aumentando significativamente o tempo de hospitalização e os custos com cuidados médicos. Nesse contexto, a implementação da terapia adequada o mais breve possível contribui, sobremaneira, para um melhor desfecho do paciente. Sendo assim, métodos rápidos para detecção de ERCs são cada vez mais necessários. A espectrometria de massa de avaliação do “tempo de voo” de moléculas proteicas pós-dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS) tem sido uma ferramenta adequada para a microbiologia clínica. O objetivo deste trabalho foi avaliar a utilização do MALDI-TOF MS para a determinação de resistência aos carbapenêmicos, através da detecção da hidrólise de carbapenêmicos (a partir de frascos de hemoculturas positivas) e da detecção da KPC (a partir de colônias isoladas e diretamente de frascos de hemoculturas positivas). No ensaio de hidrólise foram avaliados 100 isolados (81 carreando genes de carbapenemases), obtendo sensibilidade de 84,6% e especificidade de 89,5%, com uma variação significativa de acordo com o tipo da enzima: 97,9% de sensibilidade em isolados blaKPC-positivos; 58,8%, para blaNDM-1 e 60,0%, para blaOXA-48-like. Para a detecção da KPC, foram avaliados 300 isolados (157 blaKPC-positivos) crescidos em meio de cultura sólido e foi estabelecido um ponto de corte para intensidade do pico da enzima (≥120 [u.a.]), com sensibilidade de 98,09% e especificidade de 97,90%. Para as hemoculturas, foram avaliados 102 isolados (59 blaKPC-positivos), com sensibilidade e especificidade de 94,9% e 95,3%, respectivamente, utilizando o mesmo valor de ponto de corte. Uma categoria intermediária (115 a 125 [u.a]) foi proposta para obter resultados mais confiáveis e reprodutíveis. Portanto, conclui-se que a detecção da hidrólise do carbapenêmico direto de frascos de hemoculturas positivas através do MALDI-TOF MS, e a detecção do pico de KPC, são metodologias viáveis e rápidas para otimização do tratamento antimicrobiano e de estratégias de stewardship. Carbapenem-resistant Enterobacterales (CRE) are an urgent threat to global health. Among them, CRE producing Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) are disseminated worldwide and responsible for several clinical outbreaks. Infections caused by these bacteria are associated with high morbidity and mortality (up to 80% in cases of bacteremia), increasing hospitalization time and costs. In this context, the implementation of an appropriate therapy as soon as possible contributes to a better patient outcome. Therefore, rapid methods to detect CREs are even more necessary. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) proved to be a suitable tool for clinical microbiology. The objective of this work was to evaluate the use of MALDI-TOF MS to detect carbapenem resistance, through the detection of carbapenem hydrolysis (from positive blood culture bottles) and the detection of KPC (from colonies grown in solid culture medium and directly from positive blood culture bottles). In the hydrolysis assay, 100 isolates were evaluated (81 carrying carbapenemase genes); sensitivity of 84.6% and specificity of 89.5% were observed, with a significant variation according to the enzyme type: 97.9% of sensitivity in blaKPC-positive isolates; 58.8% for blaNDM-1 and 60.0% for blaOXA-48-like. For the detection of the KPC, 300 isolates (157 blaKPC-positives) grown in solid culture medium were evaluated and a cut-off point was established for the peak intensity of the enzyme (≥120 a.u.), with a sensitivity of 98.09% and specificity of 97.90%. For blood cultures, 102 isolates (59 blaKPC-positives) were evaluated, with sensitivity and specificity of 94.9% and 95.3%, respectively, using the same cut-off value. An intermediate category was proposed to obtain more reliable and reproducible results. Therefore, in conclusion, the detection of carbapenem hydrolysis directly from positive blood culture bottles using MALDI-TOF MS, and the detection of KPC peak, are practicable and rapid methods for optimizing antimicrobial treatment and stewardship.

Infecções causadas por microrganismos multirresistentes tem se tornado cada vez mais comuns em ambientes hospitalares de todo o mundo. Os bacilos gram-negativos se destacam entre as bactérias multirresistentes pela produção de enzimas carbapenemases capazes de degradar os antibióticos de última geração. Como último recurso, as polimixinas foram reintroduzidas na clínica médica para o tratamento destas bactérias. No entanto, os métodos de determinação da suscetibilidade in vitro às polimixinas são limitados, tendo apenas a microdiluição em caldo (método trabalhoso e demorado) como padrão-ouro. Entre as infecções causadas por bactérias multirresistentes, as infecções de corrente sanguínea são as mais preocupantes pois podem levar à sepse e ao choque séptico, as quais têm alta taxa de mortalidade. Este trabalho objetivou desenvolver um método rápido de determinação da suscetibilidade às polimixinas, tanto de colônias crescidas em ágar como diretamente dos frascos positivos de hemoculturas, utilizando a tecnologia de MALDI-TOF. Para isso, foi utilizada a técnica de “microgotas direto na placa” (DOT-MGA) com algumas modificações (DOT-MGA Adaptado) para adaptar às características deste fármaco e com a utilização da placa reutilizável de MALDI-TOF. Para a padronização da técnica foram utilizados 122 isolados bacterianos recuperados de pacientes atendidos no Hospital de Clínicas de Porto Alegre para o teste direto da colônia e 117 isolados para a avaliação direto de hemoculturas, incluindo Enterobacterales e Bacilos gram-negativos não-fermentadores (Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter spp). O DOT-MGA Adaptado apresentou 95% e 100% de concordância categórica entre isolados de colônias crescidas em placas de ágar e direto de hemoculturas, respectivamente. Com isso, o teste DOT-MGA Adaptado demonstrou ser uma ótima alternativa para a determinação da suscetibilidade às polimixinas em laboratórios de microbiologia que possuem o equipamento de MALDI-TOF. O método DOT-MGA Adaptado é uma técnica simples, de baixo custo de materiais de consumo e, principalmente, rápida (resultados em até 4 horas após as hemoculturas sinalizarem positivas) a qual pode fornecer resultados precoces podendo auxiliar mais efetivamente o clínico na escolha da melhor antibioticoterapia para bacilos gram-negativos multirresistentes. Infections caused by multidrug-resistant microorganisms have become increasingly common in hospital environments around the world. Gram-negative bacilli stands out among multidrug-resistant bacterias for the production of carbapenemase enzymes capable of degrading the latest generation of antibiotics. As a last resort, polymyxins were reintroduced in the clinic to try to combat the advance of these bacteria, but the methods for determining the in vitro susceptibility to polymyxins still remain limited, with only broth microdilution (a laborious and time-consuming method) as the gold standard. Among infections caused by multidrug-resistant bacteria, bloodstream infections are the most worrisome: they can lead to sepsis and septic shock, which have a high mortality rate. This work aimed to develop a faster method for determining the susceptibility to polymyxins, both in colonies grown on agar and directly from positive blood culture flasks, using the technology of MALDI-TOF. For this, the technique of “direct on target microdroplet growth assay” (DOT-MGA) was used with some modifications (Adapted DOT-MGA) to adapt the technique to the characteristics of this drug and with the use of the reusable MALDI-TOF target. For the standardization of the technique, 122 bacterial isolates recovered from patients attempted at Clinical Hospital of Porto Alegre were used for the evaluation from colonies grown on agar plates and 117 isolates for the evaluation directly from blood cultures, including Enterobacterales and non-fermenting gram-negative bacilli (Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp). The Adapted DOT-MGA achieved 95% and 100% of categorical agreement between isolates from colonies grown on agar plates and directly from blood cultures, respectively. Thus, the Adapted DOT-MGA demonstrated to be a great alternative option for the determination of susceptibility to polymyxins in microbiology laboratories that have the MALDI-TOF equipment. The Adapted DOT-MGA is a simple technique, with low cost of consumables and, mainly, fast (results within 4 hours after blood cultures flags positive) which can provide early results and can more effectively assist the clinician in choosing the best antibiotic therapy for multidrug-resistant gram-negative bacilli.

Submitted by Biblioteca Escola Superior de Saúde (biblioteca@ess.ipp.pt) on 2022-01-28T13:48:01Z No. of bitstreams: 1 Declaracao_292_Bianca Braz.pdf: 213838 bytes, checksum: 6f30ae93d60d7d0cb6c2bb783d677ccf (MD5) Made available in DSpace on 2022-01-28T13:48:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Declaracao_292_Bianca Braz.pdf: 213838 bytes, checksum: 6f30ae93d60d7d0cb6c2bb783d677ccf (MD5) Previous issue date: 2021-11-26

Tese de mestrado, Análises Clínicas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019 Relatório de estágio de mestrado, Análises Clínicas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019 Submitted by Biblioteca FFULisboa (biblioteca@ff.ulisboa.pt) on 2020-04-08T18:09:23Z No. of bitstreams: 1 TM_Rita_Emanuela_Fernandes_Ralha.pdf: 2154792 bytes, checksum: 5e628ca1db9215929d94f7586ad63eaa (MD5) Made available in DSpace on 2020-04-27T14:26:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TM_Rita_Emanuela_Fernandes_Ralha.pdf: 2154792 bytes, checksum: 5e628ca1db9215929d94f7586ad63eaa (MD5) Previous issue date: 2019-12-03 Serviço de Patologia Clínica do Hospital Sousa Martins da Unidade Local de Saúde da Guarda

Enterobacterales resistentes aos carbapenêmicos (ERC) foram reconhecidas como uma ameaça urgente à saúde global que causam a maioria das infecções de difícil tratamento em estabelecimentos de saúde e estão associadas a elevada mortalidade. ERCs produtoras de Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC), principalmente Klebsiella pneumoniae, são mundialmente disseminadas e responsáveis por um grande número de surtos. Métodos rápidos de diagnóstico proporcionam grandes benefícios clínicos e epidemiológicos. Recentemente, um método de detecção direta de KPC baseado em cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS/MS) foi desenvolvido. O objetivo deste trabalho foi padronizar e validar este método, com adaptações adequadas às nossas especificações e disponibilidade de equipamentos. Testamos o nosso método contra uma ampla variedade de isolados, incluindo produtores de outras carbapenemases. Para fase de validação foram selecionados 111 isolados (49 KPC-positivos e 62 KPC-negativos) provenientes de um estudo de vigilância para o monitoramento de Enterobacterales com susceptibilidade reduzida aos carbapenêmicos. Os resultados foram avaliados por um operador experiente que desconhecia a caracterização prévia dos isolados. O operador classificou corretamente 47 dos 49 isolados KPC-positivos. Todos os isolados KPC-negativos (n=62) foram corretamente classificados. O método apresentou uma sensibilidade de 96,07% e uma especificidade de 100%. A presença de outras carbapenemases não interferiu nos resultados. O peptídeo APIVLAVYTR se apresentou negativo em 19 dos 49 isolados KPC-positivos, enquanto GFLAAAVLAR apresentou apenas um resultado negativo. LTLGSALAAPQR e LALEGLGVNGQ foram detectados em todos extratos proteicos. Em conclusão, nossos resultados demonstram que os peptídeos marcadores de KPC foram robustamente detectados pelo método em LC-MS/MS, que apresentou elevada sensibilidade e especificidade e pode ser utilizado como um método confirmatório para detecção deste mecanismo de resistência em Enterobacterales. Carbapenem-resistant Enterobacterales (CRE) have been recognized as an urgent threat to global health that cause of the majority of the difficult-to-treat infections in health-care settings and are associated with high mortality. Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) producing CREs, specially Klebsiella pneumoniae, are globally disseminated and responsible for a large number of outbreaks. Rapid methods for KPC detection provide great clinical and epidemiological benefits. Recently, a method based in liquid chromatography-tandem MS (LC-MS/MS) was developed. The aim of this study was to standardize and validate this method, with adaptations to suit our equipment availability and specifications. We tested our method against a broad variety of isolates, including other carbapenemases producers. For validation phase 111 isolates (49 KPC-positives and 62 KPC-negatives) from a surveillance study monitoring Enterobacterales with reduced susceptibility to carbapenems were selected. The results were evaluated by an expert operator blinded to the isolates previous characterization. The operator correctly classified 47 of 49 KPC-positive isolates. All KPC-negative isolates (n=62) were correctly classified. The method yields 96.07% sensitivity and 100% specificity. The presence of other carbapenemases did not interfere in the results. The APIVLAVYTR peptide was called negative in 19 from 49 KPC-positive isolates while GFLAAAVLAR presented just one negative result. LTLGSALAAPQR and LALEGLGVNGQ were detected in all protein extracts. In conclusion, our results demonstrate that the KPC peptide markers were robustly detected by the method which presented high sensitivity and specificity and therefore can be used as a confirmatory method to identify this resistance mechanism among Enterobacterales.