Search

Aktinoporini so skupina majhnih in bazičnih α-porotvornih toksinov, ki jih proizvajajo morske vetrnice. Kot vsi porotvorni proteini lahko tudi stiholizini obstajajo v dveh različnih konformacijah. Nastajajo kot topni monomeri, ki so v odsotnosti tarčnih membran stabilno zviti in vodotopni. Ko pridejo v bližino membrane tarčne celice, pride v njihovi strukturi do sprememb, ki vodijo v oligomerizacijo monomerov in do nastanka pore v membrani celice. To povzroči osmotski šok in neizogibno smrt tarčne celice. Stiholizina I in II (StnI in StnII) sta zelo podobna aktinoporina, ki ju proizvaja morska vetrnica Stichodactyla helianthus. Izkazujeta 93% homologijo zaporedja, a imata kljub temu različno hemolitično aktivnost. Ta razlika je posledica ionske interakcije, ki je prisotna v StnI, ne pa tudi v StnII, zaradi česar je odcepitev N-konca pri StnI otežena in hemolitična aktivnost nižja. Da bi to hipotezo podrobneje preučili, je skupina z Univerze Complutense v Madridu, Fakulteta za kemijske vede, Oddelek za biokemijo in molekularno biologijo pripravila dvojni cisteinski mutanti StnI (StnI I7C/K68C) in II (StnII I6C/K67C). Ti mutanti sta sposobni tvorbe disulfidnega mostička znotraj svoje strukture, kar posnema ionsko interakcijo pri stiholizinu I in oteži oddaljitev α-vijačnice in tvorbo pore. Ti štirje proteini (StnI, StnII, StnI I7C/K68C in StnII, StnII I6C/K67C) so bili funkcionalno okarakterizirani, pri čemer je bilo ugotovljeno, da so se mutanti res vežeta na membrane, ki vsebujejo sfingomielin, vendar ne napredujeta do oblikovanja pore. Naše delo je bilo razdeljeno na tri dele. Prvi in glavni del je bil kloniranje vseh štirih genov, ki kodirajo beljakovine (StnI in StnII divjega tipa ter StnI I7C/K68C in StnII I6C/K67C) v izbrani plazmid, ki omogoča izražanje izražanje rekombinantnih proteinov s peptidnimi dodatki NPS3 tako na N- kot na C- koncu, le-ti pa omogočajo specifično kovalentno vezavo v vezavni sistem s peptidoma NPS2 in NPS4, ki se uporabljata v enomolekulski tehniki mikroskopije na atomsko silo. Drugi del je predstavljalo izražanje in čiščenje rekombinantnega StnII. Tako pripravljen rekombinantni protein se lahko uporablja v enomolekularni tehniki mikroskopije na atomsko silo, pri kateri je preiskovani protein razpet med premičnim elementom in površino. Predpostavlja se, da bo ta tehnika z eno molekulo posnemala mehanske sile, katerim so stiholizini podvrženi med molekularno transformacijo ki je potrebna za njihovo sestavo v transmembransko poro. Tretji del je bil test hemolize z vsemi štirimi proteini v odsotnosti in prisotnosti DTT, sredstva, ki reducira disulfidne vezi. V prisotnosti DTT so vse štiri beljakovine pokazale primerljivo hemolitično aktivnost, medtem ko sta v odsotnosti DTT le proteina divjega tipa pokazala vidno hemolizo. Actinoporins constitute a group of small and basic α pore-forming toxins produced by sea anemones. In an aqueous solution, actinoporins remain stably folded but, upon interaction with lipid bilayers, become integral membrane structures. Sticholysins I and II (StnI and StnII) are two very similar actinoporins produced by the Caribbean Sea anemone Stichodactyla helianthus. They show 93% of sequence homology but, quite surprisingly, different pore-formation activity, when measured as their ability to produce hemolysis. This is due to a salt bridge, present in StnI but not in StnII, which makes the N-terminal detachment in StnI more difficult and thus impairs the hemolysis. To study this hypothesis in deeper detail, the group at Complutense University of Madrid, Faculty of Chemical Sciences, Department of Biochemistry and Molecular Biology has prepared mutants of StnI (StnI I7C/K68C) and II (StnII I6C/K67C) where two Cys residues have been strategically located to covalently bind, employing a disulfide bond, the Nterminal stretch to the β-sandwich core. The four proteins (StnI, StnII, StnI I7C/K68C, and StnII StnII I6C/K67C) have been characterized in functional terms, revealing that the mutants do bind to sphingomyelin-containing membranes but do not progress to form a pore. Our work was divided into three parts. The first and main part was the cloning of all four genes coding for proteins (StnI and StnII wild-type as well as StnI I7C/K68C and StnII I6C/K67C) in the selected plasmid, that enables expression of recombinant proteins within a specific peptides-construct facilitating further research of the proteins with atomic force microscopy. The second part was expression and purification of recombinant StnII. The peptides construct, called NPS3, would allow us to use the proteins in a single-molecule technique of AFM, in which a purified protein of interest is tethered between the tip of an AFM cantilever and a surface that can be retracted with sub-nanometer precision, thanks to piezoelectric actuators. The assumption is that this single-molecule technique will mimic the mechanical perturbations suffered by sticholysins during the molecular metamorphosis needed to assemble them into a transmembrane pore.The third part was a hemolysis assay with all four proteins in the absence and in the presence of DTT, an agent that reduces the disulfide bonds. In the presence of DTT, all four proteins showed comparable hemolytic activity, while in the absence of DTT, only wild-type proteins showed visible hemolysis.

Proteini, podobni Nep1 ali NLP (ang. (Nep-1)-like protein) so posebna družina proteinov, ki se pojavlja pri fitopatogenih bakterijah, glivah in oomicetah. Delujejo kot elicitorji rastlinskega imunskega sistema ter imajo citotoksično delovanje na rastlinske celice. Prvi koraki interakcije proteinov NLP s plazemsko membrano so znani, vemo pa tudi, da se NLP vežejo na sfingolipid glikozil inozitol fosforilceramid (GIPC), ki je gradnik rastlinske plazemske membrane. Nedavno je prišlo do razjasnitve mehanizma delovanja proteinov NLP: po vezavi proteina na sfingolipidni receptor pride do prerazporeditve receptorjev in nastanka majhnih por v membrani, kar posledično vodi v smrt celic in nekrozo tkiv. V nalogi smo želeli opredeliti nekatere lastnosti cisteinskih mutant proteina NLPPya iz oomicete Pythium aphanidermatum. Cisteinske mutante so locirane na C-terminalnem koncu proteina, in sicer na α-vijačnici, z namenom vezave fluorescenčne sonde na mutirano tiolno skupino. Fluorescenčna sonda IANBD amid omogoča razumevanje sprememb okolja, ki se zgodijo pri interakciji proteina z modelno membrano, ki vsebuje GIPC. S testom infiltracije mutant v liste tobaka, merjenjem sproščanja ionov iz infiltriranega območja in testom kosedimentacije z multilamelarnimi vezikli z GIPC, smo preverili ohranjenost citotoksične aktivnosti mutant glede na divji tip proteina. Uvedba dotičnih mutacij ne vpliva na zvitje proteina, saj imajo mutante podobno temperaturo tališča kot divji tip. Fluorimetrične meritve kažejo na stik fluorescenčnega označevalca s hidrofobnim območjem, kar pomeni da C-terminalni del proteina interagira z membrano. NLP proteins are a protein family that occurs in phytopathogenic bacteria, fungi and oomycetes. They act as elicitors of the plant immune system and have a cytotoxic effect on plant cells. The first steps of the interaction of NLPs with the plasma membrane are known, they bind to the sphingolipid glycosyl inositol phosphorylceramide, a common plant membrane lipid. Recently, the mechanism of action of NLPs has been elucidated: they act on the redistribution of the sphingolipid receptor, leading to small pores in the membrane which cause leakage and necrosis. In the present thesis we wanted to define some properties of NLPPya cysteine mutants from oomycete Pythium aphanidermatum. Cysteine mutants are located at the C-terminal end on the α-helix, for the purpose of binding the fluorescent probe to the mutated thiol group. The fluorescent probe IANBD amide helps us to understand the environmental changes of the protein when an interaction with a model membrane containing GIPC occur. By testing the mutant infiltration into tobacco leaves, measuring the release of ions from the infiltrated area, and the GIPC multilamellar vesicle cosedimentation test, we examined the conservation of mutant cytotoxicity in comparison with the wild-type. The introduction of these mutations do not affect protein folding, as mutants have a similar melting point as the wild-type. Fluorimetric measurements indicate the incorporation of the fluorescent probe into the hydrophobic range, which means that the C-terminal part interacts with the membrane

Aktinoporini sodijo v skupino porotvornih proteinov, ki jih proizvajajo morske vetrnice iz rodu Cnidaria. Kot večina ožigalkarjev tudi one uporabljajo ožigalne celice oz. nematociste pri plenjenju, in sicer vbodne strukture, ki vsebujejo mešanico toksinov: citolizine (med katerimi so tudi aktinoporini), fosfolipaze in nevrotoksine. Ti remodelirajo celično membrano plena s tvorbo por, kar povzroči osmotsko neravnovesje in posledično celično smrt. Pri manjših rakih in ribah toksini povzročajo tudi bolečino in paralizo, ki je posledica spremenjenega izločanja nevrotransmiterjev v plenu. Velikost aktinoporinov je okoli 20 kDa/175 aminokislin. Ti proteini ne vsebujejo cisteina, zaradi česar niso sposobni tvorbe disulfidnih mostov, in imajo bazični pI, ki je običajno višji od 9. So predstavniki amfitropičnih proteinov in so lahko stabilno zviti v vodnih raztopinah, prav tako pa se lahko vgradijo v membrano, kjer tvorijo pore, specifične za katione, s premerom 1–2 nm. Zaradi te lastnosti predstavljajo optimalen model za proučevanje prehoda iz monomernih vodotopnih proteinov v oligomerne transmembranske skupke. Podrobneje so ovrednotili štiri aktinoporine: stiholizin I in II (iz rodu Stichodactyla helianthus), ekvinatoksin II (EqtII, iz rodu Actinia equina) in fragaceatoksin C (FraC, iz rodu Actinia fragacea). Splošna struktura aktinoporinov vsebuje motiv β–sendviča, sestavljenega iz 10–12 β–verig. Ob straneh se nahajata dve α–vijačnici, izmed katerih se je α1–vijačnica sposobna oddaljiti od preostalega dela proteina, prebosti membrano in tvoriti steno nastale pore. Tako je odgovorna za funkcijo proteina in aktinoporine uvršča med α–porotvorne toksine. β–sendvič in druga α–vijačnica pa sodelujeta v prepoznavanju in vezavi na celično membrano, pri čemer ostane njuna struktura nespremenjena. Mehanizem, po katerem nastanejo pore, je sestavljen iz več korakov: prepoznave sfingomielina, vezave na membrano, prenosa N–končnega dela proteina do mejne površine med vodno fazo in lipidi, oligomerizacije in tvorbe pore. Pri vezavi na membrano imajo ključno vlogo hidrofobne interakcije. Zmožnost nastanka por je pri aktinoporinih odvisna od številnih dejavnikov, izmed katerih velja izpostaviti sestavo in fizikalno–kemijske lastnosti lipidnega dvosloja. Prisotnost holesterola v membrani olajšuje tvorbo por, saj ta sterol fluidizira metilenske stranske verige sfingomielina in skupaj s sfingomielinom tvori mikrodomene. Stiholizin I in stiholizin II imata 93 % identično aminokislinsko zaporedje, kljub temu pa je stiholizin II bolj hemolitično aktiven, še posebej pri uporabi lipidnih modelov s holesterolom, ki pomembno vpliva na njegovo sposobnost tvorbe por. Delo, ki smo ga opravili v okviru magistrske naloge, je sestavljeno iz dveh sklopov. V prvem sklopu smo pripravili štiri cisteinske mutante proteinov stiholizina I (z mutacijo I7C oz. K68C) in stiholizina II (z mutacijo I6C oz. K67C). Določili smo njihovo aminokislinsko zaporedje, izvedli pomnoževanja PCR, izolacijo, restrikcijo ter ligacijo majhnega in velikega dela plazmida, pripravili in uporabili kompetentne bakterije Escherichia coli za izražanje ciljnih proteinov, izolirali posamezne kolonije ter izvedli izolacijo in čiščenje plazmidov. V nadaljevanju raziskav načrtujejo pridobivanje in čiščenje večje količine mutant stiholizina I in stiholizina II. Temu bodo sledili eksperimenti, ki bodo vodili k boljšemu razumevanju posameznih korakov tvorbe por, predvsem pri razločevanju procesa vezave proteina na membrano med procesom vstavitve vijačnice in oligomerizacije. Vsi štirje mutanti vključujejo cistein, ki v nativnih proteinih ni prisoten, kar jim omogoča tvorbo disulfidnih vezi med N–končnim delom proteina in njegovim jedrom. Nastanek takšne vezi bi lahko preprečil njihovo zmožnost ločitve N–konca oz. α–proteinske vijačnice od preostalega proteina in nadaljnje vključitve v membrano, ki je ključen korak pri tvorbi por. Takšen postopek so predhodno uporabili pri dvojnem cisteinskem mutantu aktinoporina ekvinatoksina II, ki je bil sicer še vedno sposoben vezave na membrano in oligomerizacije, sposobnost vstavitve vijačnice v membrano in nastanek por pa sta bila drastično zmanjšana. V primeru potrjene hipoteze bi z nadaljnjimi meritvami lahko podrobneje določili vpliv posameznih korakov pri tvorbi por tudi za stiholizin I in stiholizin II ter tako pridobili dodatne informacije glede procesa nastanka por. V drugem sklopu smo preučevali lastnosti porotvornega proteina stiholizina II z mutacijo D76S (StnII D76S) in jih primerjali z lastnostmi nativnih proteinov stiholizina I in II. Pri vrednotenju lastnosti izoliranega proteina smo uporabili različne spektroskopske tehnike, ki so jih predhodno uporabili na nativnem proteinu in ostalih porotvornih proteinih. Za preučevanje termostabilnosti smo uporabili cirkularni dikroizem, s katerim smo potrdili splošno ohranjenost sekundarne in terciarne strukture StnII D76S. Z izvedbo fluorescenčnega emisijskega spektra smo predvideli delokalizacijo vsaj enega Trp aminokislinskega ostanka, najverjetneje Trp110. Skupina aromatskih aminokislinskih ostankov pri stiholizinu II vključuje Trp110, ki ima pomembno vlogo pri vezavi proteina na membrano, prav tako pa pri prepoznavanju vezavnega mesta, kar je predvsem posledica hidrofobnega učinka. Pri preučevanju interakcij proteina z membrano je mutant izkazal povsem enako hemolizno aktivnost kot stiholizin II. Membrana eritrocita je bolj zapletena od lipidnih veziklov, uporabljenih pri meritvi sproščenega kalceina in izotermalni titracijski kalorimetriji. To otežuje nadzor posameznih komponent pri eksperimentih z eritrociti, zato se pri interpretaciji rezultatov aktivnosti preferenčno osredotočajo na rezultate, pridobljene na lipidnih sistemih. Pri uporabi enostavnejših lipidnih dvoslojev, kot so vezikli fosfolipida (1,2‐dioleoil‐sn‐glicero‐3‐fosfoholina) in sfingomielina v prisotnosti oz. odsotnosti holesterola, so bili rezultati afinitete vezave StnII D76S na membrano višji v primerjavi s stiholizinom II. Prisotnost holesterola v veziklih je razliko med merjenima proteinoma pomembno povišala, kar kaže na sterolov vpliv na vezavno afiniteto stiholizina II. Meritve sproščenega kalceina so nam omogočile meritev nadaljnjih korakov tvorbe por, kot so: difuzija, oligomerizacija in vstavitev v hidrofobno jedro membrane. Mutant StnII D76S je povzročil večjo sprostitev kalceina, čeprav ugotovljene razlike niso bile tako drastične kot pri izotermalni titracijski kalorimetriji. Hipoteza, ki smo jo postavili na začetku, predvideva, da mutacija, izvedena na mestu 76, okrepi vpliv holesterola na lastnosti stiholizina II. Funkcijski eksperimenti so presenetljivo prikazali, da mutacija ni imela vpliva na hemolizo kljub mnogo večji afiniteti za uporabljene lipidne vezikle in povečani sprostitvi kalceina. Čeprav smo našo delovno hipotezo ovrgli, lahko z gotovostjo zaključimo, da ima aminokislinski ostanek stiholizina II na mestu 76 ključno vlogo pri vezavi aktinoporina na membrano. Za podrobnejšo razlago učinka te mutacije na porotvorno sposobnost proteina pa bodo potrebni še dodatni, podrobnejši eksperimenti. Sticholysins belong to the family of pore–forming proteins. They can exist either as soluble monomeric proteins or form an oligomeric transmembrane pore, which makes them an optimal model for studying their undergoing change, i.e. from being monomeric and water–soluble proteins to becoming oligomeric transmembrane assemblies. Detailed study has provided a better understanding of separate steps of pore formation mechanism and of the role of specific protein residues. However, further research is needed in order to be able to use these proteins as potential biotechnological and therapeutic tools. Our work was divided into two parts. In the first part, the cysteine mutants of the proteins sticholysin I (I7C, K68C) and sticholysin II (I6C, K67C) were prepared. A standard procedure was followed and the four plasmids with the desired sequence were formed. As all the mutants contain cysteine, not present in the native proteins, they can form disulfide bridges, which could theoretically influence the ability of protein helix stretch insertion into the membrane and prevent it. This would enable to study proteins’ binding to the membrane separately from oligomerization and membrane insertion step. To confirm the hypothesis, further experiments are needed. In the second part, we performed a series of experiments using different mutant: sticholysin II D76S with the aim of comparing its properties with the wild type proteins sticholysin I and sticholysin II. The isolated protein was functionally and spectroscopically characterized using standard methods. The initial hypothesis was that the mutated residue would be responsible for the larger influence of cholesterol on sticholysin II behavior. Surprisingly, the functional experiments revealed that hemolysis remained unaltered, in spite of a much higher affinity for the lipid vesicles assayed. Consequently, greater affinity caused improved leakage. The initial hypothesis was rejected and we concluded that the residue in the sticholysin II 76 position plays a key role in binding of actinoporins to the membrane, probably by dislocating Trp110 residue. Explanation of this behavior in greater detail will require some additional experiments.

Naravne lipidne sisteme je zaradi njihove kompleksnosti, težavnosti izolacije ter morebitne neobstojnosti večinoma precej težko raziskovati in zato imajo natančno definirani modelni sistemi ključno vlogo pri razumevanju le-teh. Do sedaj so se za študije naravnih lipidnih kapljic (LK) večinoma uporabljale neobstojne in slabo okarakterizirane umetne lipidne strukture, kjer so dodatno težavo povzročale še slabo opisane tehnike za njihovo pripravo. Tako se je porodila ideja, da bi lahko lipidne nanoemulzije zaradi svoje zgradbe in lastnosti služile kot modelni lipidni sistem ne zgolj za študije naravnih LK, ampak tudi za namene raziskovanja bioloških membran ter njihovih interakcij s proteini. V naši študiji smo se osredotočili na pripravo in karakterizacijo umetnih LK oziroma lipidnih nanoemulzij LK, sestavljenih iz sfingomielina (SM), holesterola (Chol) in trioleoil glicerola (TOG), kjer se SM in Chol na površini urejata v lipidni monosloj, notranjost pa zapolnjuje TOG. O lastnostih umetnih lipidnih veziklov oziroma Langmuirjevega monosloja iz SM/Chol je veliko znanega, nanoemulzije LK v tej sestavi pa v literaturi še niso bile opisane, zato je naša raziskava pripomogla k boljšemu poznavanju lastnosti le-teh. Poleg karakterizacije LK predstavljajo pomemben del naše raziskovalne študije tudi njihove interakcije z izbranimi beljakovinskimi tvorci por, ki v membranah tvorijo transmembranske pore. Čeprav mehanizem nastanka le-teh še ni čisto pojasnjen, velja, da lahko poteka preko nastanka t.i. pre-por. Za namene naše študije smo tako izbrali od sfingomielina-odvisni citolizin ekvinatoksin II (EqTx II), od holesterola odvisna toksina perfringolizin O (PFO) in listeriolizin O ter bikomponentna tvorca por pleurotolizin B in ostreolizin A. S primerjalno študijo njihovih interakcij z nanoemulzijami LK in velikimi unilamelarnimi vezikli smo pokazali, da transmembranske pore v lipidnih monoslojih LK ne morejo nastati. Še več, kot prvi smo tudi uspešno vizualizirali različne stopnje nastanka pre-pore za primer PFO ter strukture (pre)por EqTx II. Dokazali smo, da dobro definirane umetne LK z natančno izdelanim protokolom priprave predstavljajo pomembo orodje na področju bioloških in bio(medicinskih) raziskav. Naša študija prav tako potrjuje, da je moč z interdisciplinarnim raziskovalnim pristopom in uporabo zgolj temeljnih znanj uspešno povezati različna znanstvena področja. Researching natural lipid systems is often challenging due to their complexity, possible instability and isolation difficulty. Well-defined model lipid systems, therefore, play a key role in their understanding. So far, unstable and not well-characterized artificial lipid structures prepared by poorly designed techniques have been used for studying natural lipid droplets (LDs). As nanoemulsions share many physico-chemical characteristics in common with natural LDs, our study was therefore stimulated by the idea that nanoemulsions of LDs might serve as a model lipid system for studying not only natural LDs, but also biological membranes and their interaction with lipid specific proteins. Our study focused on the preparation and characterization of artificial LDs named nanoemulsions of LDs, composed of a trioleoylglycerol (TOG) core coated with a sphingomyelin (SM) and cholesterol (Chol) monolayer. This lipid combination was chosen as nanoemulsions covered by combined SM and Chol have been poorly characterized in contrast to respective SM/Chol vesicles or Langmuir monolayers. As such, our study contributed to a better understanding of their properties. Besides LDs’ characterization, an important part of our research was also dedicated to studying their interaction with selected pore forming proteins that form transmembrane pores in membranes. Although the exact mechanism of transmembrane pore formation has not been precisely explained yet, it is assumed that pore formation is a multi-step process, involving the formation of structures called pre-pores. For the purpose of our study, sphingomyelin-dependent cytolysin Equinatoxin II (EqTx II), cholesterol-dependent toxins Perfringolysin O (PFO) and Listeriolysin O, and a binary pore-forming protein complex Ostreolysin A (OlyA)/Pleurotolysin B (PlyB) were selected. Herein, we confirmed that transmembrane pores on the LDs monolayers could not be formed. Furthermore, different stages of PFO pre-pore formation were successfully visualized as well as the (pre)pore structures formed by EqTx II. Our study confirmed that well-defined artificial LD with a precisely designed preparation procedure might play an important role in the field of biological and bio(medical) research. Herein, a great advantage of interdisciplinary research approach using the fundamental knowledge was successfully demonstrated.