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La especie Paspalum notatum Flüggé (P. notatum) es utilizada como modelo en genética reproductiva vegetal debido a que presenta citotipos diploides de reproducción sexual y citotipos poliploides apomícticos y pseudógamos. Esta característica permitió evaluar: 1- El efecto directo del genotipo del polen en el desarrollo y características de la semilla y fruto (efecto xenia) y 2- Las diferencias durante la formación de semillas entre citotipos apomícticos y sexuales.En el capítulo I, se exploró el efecto xenia, el cual se define como el efecto directo del genotipo del polen en el desarrollo de la semilla o fruto. Tiene gran importancia agronómica, utilizándose en el mejoramiento genético vegetal, por ejemplo, en la búsqueda del incremento del rendimiento de granos. Aunque se reportan numerosos estudios sobre xenia, su efecto a nivel molecular ha sido poco estudiado. Por ello, se realizó un estudio molecular utilizando la especie P. notatum. Los objetivos del presente trabajo fueron: 1- Analizar el efecto de xenia en el desarrollo del endospermo a nivel molecular. 2- Evaluar si los genes expresados diferencialmente ejercen funciones durante el desarrollo de la semilla. 3- Explorar los procesos metabólicos y la(s) molécula(s) señal(es) que median el efecto xenia en el endospermo. Para ello, luego de tres horas de ocurrida la polinización, momento en el que ya ha ocurrido la fecundación de los núcleos polares, se realizó la comparación mediante cDNA-AFLP de una planta madre testigo sin polinizar, de genotipo Q4117 (4x apomíctico pseudógamo), con respecto a dos cruzamientos de esta madre con distintos dadores de polen: Q4117xH398 (2x sexual) y Q4117xQ3775 (4x apomíctico pseudógamo). Del análisis de la expresión génica diferencial se obtuvieron bandas únicas, tanto para el cruzamiento Q4117xH398 como para el cruzamiento Q4117xQ3775. A partir del análisis del patrón de bandas obtenidas, se encontraron 33 bandas de expresión diferencial únicas para los cruzamientos analizados, de las cuales 24 fueron secuenciadas, y se les asignó una posible función biológica mediante búsquedas blastn, blastx y blastp. Del análisis funcional de secuencias se obtuvo que siete de ellas (CG5, GA4, GA6, GG5, CG3, TG2 y CC1) presentaron homología con loci de Arabidopsis thaliana (A. thaliana) con funciones asociadas al desarrollo del saco embrionario, desarrollo del tubo polínico, doble fertilización, formación del cigoto y el endospermo. En artículos previos se puso en evidencia que al generarse fenotipos mutantes de A. thaliana para estos loci el tamaño de la silicua, el número, tamaño y el set de semillas (porcentaje de semillas llenas con respecto al número total de semillas) disminuye. Estos resultados mostraron evidencias del efecto xenia en las funciones asociadas a la reproducción y de que el genotipo del polen es uno de los factores que determinan la expresión de diferentes transcriptos que podrían estar asociados con el rendimiento de granos. Además, las secuencias CC3, GA4, GA6 y GA2 estuvieron asociadas a loci de A. thaliana que codifican para ARNm móviles, lo cual sería evidencia de que el mecanismo para xenia estaría relacionado con ARNm móviles que difundirían desde el tubo polínico por la micrópila del óvulo.En el capítulo II se trabajó en base a la teoría del número de balance endospérmico (NBE), la cual establece que la relación de las contribuciones genómicas debe ser 2materna:1paterna para el normal desarrollo del endospermo. Sin embargo, las plantas apomícticas de P. notatum son NBE insensibles. Los objetivos del presente trabajo fueron: 1) Realizar cruzamientos entre diferentes genotipos, a fin de generar semillas con distintos niveles de ploidía por las vías sexual y apomíctica. 2) Realizar un análisis de la expresión génica diferencial 48h luego de ocurrida la polinización (LOP). Para ello, a partir del ARNm de 20 ovarios de cada cruzamiento 48h LOP, se llevó a cabo el análisis de la expresión génica diferencial mediante la técnica cDNA-AFLP. Se obtuvieron numerosas secuencias candidatas: AC1, AC2, AC3, AC4, AC5, GG1 y GG3 para ser utilizadas en futuros análisis funcionales en A. thaliana, las cuales se expresarían en distintos estadíos de desarrollo de la semilla y estarían relacionadas con el desarrollo del endospermo y con la viabilidad o no de la semilla en P. notatum.En el capítulo III se trabajó sobre el silenciamiento génico post-transcripcional en A. thaliana a patir de secuencias candidatas de P. notatum. Para ello, se evaluó en primer lugar la eficiencia del método de transformación por Floral dip mediante la expresión transitoria del gen gus. Posteriormente, se seleccionó la secuencia candidata GG13 (gen GG13) de P. notatum con el objetivo de ser silenciada en A. thaliana y se generó un hpRNA, el cual contenía las secuencias del gen GG13 en sentido y anti-sentido separadas por un intrón. Se validó el silenciamiento mediante una RT-qPCR y el subsiguiente cálculo de expresiones relativas. Además, se evaluaron caracteres fenotípicos en silicuas de plantas silenciadas y control. Los resultados obtenidos a partir del análisis fenotípico permitieron concluir que el gen GG13 afecta tempranamente el número y la forma de las semillas y el largo de silicua. Por lo tanto, se evidenció la correspondencia entre los resultados obtenidos por el análisis funcional con lo predicho por el análisis bioinformático. Fil: Pozzi, Florencia Ileana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario; Argentina

Argentina es el octavo productor mundial de cítricos y primer productor de limón (Citrus limon), por lo que la industria citrícola es una de las más importantes para la economía del país. La producción y comercialización se ve fuertemente afectada por las enfermedades cuarentenarias y/o emergentes. Entre ellas la cancrosis asiática de los cítricos, producida por la bacteria Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc), y el Huanglongbing, producida por especies del género Candidatus Liberibacter spp., son dos de las enfermedades de mayor incidencia en la citricultura de nuestro país y del mundo. El objetivo principal de este trabajo de tesis fue estudiar, desarrollar y optimizar estrategias biotecnológicas que permitan el manejo sustentable, la prevención o la detección temprana de enfermedades fitosanitarias de gran importancia en la citricultura argentina. Se realizó la caracterización de la interacción entre Citrus limon y el aislado AT de Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc AT) el cual presenta una virulencia disminuida (?avirulencia?) en limonero. Mediante estudios de transcriptoma se identificaron genes putativos de la planta que estarían involucrados en una respuesta de defensa inducida por Xcc AT, algunos de los cuales podrían ser utilizados para el mejoramiento genético contra la enfermedad. Considerando que Citrus limon es una especie recalcitrante para la regeneración in vitro de brotes, se optimizó un protocolo a partir de tejido juvenil de la variedad Eureka de C. limon, con el cual se aumentó la eficiencia de regeneración de 23 al 66 %. El porcentaje alcanzado permitirá iniciar experimentos de transformación genética de esta especie. Además, se realizó la transformación estable de Citrus sinensis cv. Pineapple con Agrobacetrium tumefaciens usando tejido juvenil. Se utilizó una construcción que contiene el gen de resistencia a X. vesicatoria Bs2 (de Capsicum annun), bajo el control del promotor del gen gst1 (de Solanun tuberosum) inducible por Xcc. Se obtuvieron 9 líneas transgénicas las cuales fueron desafiadas con la bacteria virulenta Xcc para evaluar la funcionalidad del transgen. En 2 de las 11 líneas portadoras del gen Bs2 se observó una disminución del área afectada con síntomas de la enfermedad. Estos resultados fueron validados a través de PCR en tiempo real evaluando los niveles de expresión del gen Bs2. Por la técnica "Southern blot" se observó que las líneas transgénicas resistentes presentan dos copias del gen Bs2 y que ambos son eventos diferentes. Paralelamente se realizó una búsqueda "in silico" de promotores inducibles y de genes candidatos que puedan ser potencialmente útiles para el control de enfermedades en cítricos. Por útimo se optimizaron metodologías de diagnóstico molecular para la detección de la bacteria Candidatus Liberibacter spp. a través de PCR convencional y en tiempo real. También se diseñó un juego de cebadores que amplifica un fragmento del gen 16S ADNr de las tres especies asociadas a HLB en una misma reacción. Estos resultados se desarrollaron en el marco del Programa Nacional de Prevención de HLB de Argentina. Argentina ranks eighth and first in citrus and lemon (Citrus limon) production, respectively, in the world. This makes citrus manufacturing one of the most important economic activities in the country. However, both citrus production and marketing are negatively affected by quarantinable and emerging diseases. Among these, the Asian citrus canker, caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc), and Huanglongbing, triggered by Candidatus Liberibacter spp., are two of the diseases with most incidence in citrus crops in our country and worldwide. This thesis aimed principally to study, develop, and optimize biotechnological methods for a sustainable management, prevention, or early detection of plant diseases of high impact on citrus production in Argentina. The interaction between Citrus limon and the AT isolate of Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc AT), which presents a lower virulence (‘avirulence’) in lemon, was characterized. Via transcriptome studies, putative genes that might be involved in a Xcc AT-induced response were identified. Some of these could be used in resistance breeding against the disease. Considering that Citrus limon is recalcitrant for in vitro shoot regeneration, a protocol using young tissue from Eureka (C. limon) variety was optimized, increasing regeneration efficiency from 23 to 66 %. This achievement will signal the beginning of genetic modification trials for this species. Moreover, stable genetic transformation of Citrus sinensis cv. Pineapple with Agrobacetrium tumefaciens was accomplished by using young tissue. A construction with the X. vesicatoria Bs2 resistance gene (of Capsicum annun), under the control of gst1 gene promoter (of Solanun tuberosum) inducible by Xcc, was used. Seven transgenic lines were obtained and challenged by virulent Xcc bacterium to evaluate the functionality of the transgene. It was observed that 2 of the 7 lines with Bs2 gene showed a decrease in the area presenting symptoms of the disease. These results were validated by means of a real time PCR, while evaluating Bs2 gene expression levels. The Southern blot technique further allowed identifying two Bs2 gene copies in the resistant transgenic lines, both of which constituted different events. In the meantime, inducible promoters and candidate genes that could potentially be used to control citrus diseases were in silico searched. Finally, molecular diagnosis methodologies for detecting Candidatus Liberibacter spp. bacterium with conventional and real time PCR were optimized. In addition, it was possible to design a set of primers which amplify a 16S rDNA gene fragment of the three HLB related species with a single reaction. All these developments were attained as part of the activities of Argentina’s National HLB Prevention Program Fil: Orce, Ingrid Georgina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Salta. Instituto de Investigaciones para la Industria Química. Universidad Nacional de Salta. Facultad de Ingeniería. Instituto de Investigaciones para la Industria Química; Argentina

Las estrategias de mejoramiento genético para encontrar resistencia al pasador del fruto, Neoleucinodes elegantalis, en tomate, Solanum lycopersicum L. se han basado en métodos tradicionales de introgresión genética por medio de retrocruzamiento. Sin embargo este proceso es largo y dispendioso. Debido a esta problemática, se utilizó la técnica molecular cDNA-AFLP para identificar genes involucrados en la resistencia a esta plaga en poblaciones segregantes de tomate, con el fin de identificar marcadores moleculares que puedan ser utilizados en futuros programas de fitomejoramiento. Los materiales de tomate evaluados fueron Unapal-Maravilla (susceptible), S. habrochaites var. glabratum, accesión PI 134418 (resistente) y tres retrocruzamientos obtenidos del cruzamiento interespecífico entre ambas especies. De estos materiales vegetales se extrajo el RNA total y se sintetizó el cDNA, el cual se utilizó como material de inicio de la técnica cDNA-AFLP. A partir del preamplificado de cDNA se evaluaron diferentes combinaciones de primers: +1+1, +3+3 y sus derivados. La combinación que presentó mejores amplificados fue la +1+1, para un total de 37 bandas polimórficas. De estas bandas, 9 fragmentos tipo EST (Expressed Sequence Target) fueron recuperados, siendo candidatos a explicar la resistencia al pasador del fruto en tomate. Breeding strategies for resistance to fruit borer Neoleucinodes elegantalis in tomato Solanum lycopersicum K L. have relied on traditional methods through genetic introgression by backcrossing. However, this process is slow and expensive. The cDNA-AFLP molecular technique was used to identify genes involved on fruit borer resistance in tomato segregating populations, The evaluated materials of tomato were: Unapal maravilla (susceptible to fruit borer) , S. habrochaites var. glabratum, acc. PI 134418 (resistant to fruit borer), and three interspecific backcross produced by crossbreeding between those two species. From these plant materials, total RNA was extracted and cDNA-AFLP technique was implemented. From the preamplified cDNA, different combinations of primers: +1+1, +3+3 and their derivates were evaluated. The combination that showed better amplified was +1+1 for a total of 37 polymorphic bands and 9 fragments type Expressed Sequence Target was isolated, which could explain the resistance of tomato to fruit borer.