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Objetivo: Este estudo pretende identificar o clima e a cultura organizacional entre enfermeiros que trabalham em Ambulâncias de Suporte Imediato de Vida (ASIV). Métodos: Foi realizado um estudo descritivo, quantitativo e transversal com 81 enfermeiros portugueses que atuam em Ambulâncias de Suporte Imediato de Vida no Instituto Nacional de Emergência Médica (INEM). Os dados foram analisados pelo método de análise de componentes principais (ACP), seguido de uma rotação Varimax, e os modelos foram validados mediante os testes Kaiser-Meyer-Olkin e de esfericidade de Bartlett. Resultados: A análise fatorial produziu quatro fatores, a saber: Suporte (24,5%), Objetivos (13,6%), Regras (9,7%) e Inovação (8,01%), associados ao clima e à cultura organizacional. Enfermeiros com um diploma de graduação perceberam significativamente mais suporte do que aqueles com qualificações mais altas. O suporte também variou de acordo com o estado civil, revelando que enfermeiros casados tiveram uma percepção maior do que aqueles que coabitavam. Conclusão: O clima e a cultura organizacional contribuem de forma inequívoca para o desenvolvimento de um ambiente de trabalho saudável e seguro e são decisivos para a qualidade da assistência de enfermagem.