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ilustraciones, graficas Estudios clínicos y epidemiológicos han corroborado la asociación bidireccional entre la artritis reumatoide (AR) y la periodontitis. Esta asociación es atribuida a Porphyromonas gingivalis, por la presencia de la enzima peptidil arginina deiminasa (PPAD) y con la actividad de las Arg-gingipaínas en la citrulinación, vinculadas con el quiebre de la tolerancia inmunológica en la AR. Se ha confirmado que los anticuerpos anti-P. gingivalis acompañan el desarrollo de la AR. Sin embargo, pocos estudios indagan la asociación de factores de virulencia específicos de esta bacteria con la AR. En este estudio hemos producido la PPAD de manera recombinante y purificado la gingipaína RgpA nativa a partir de vesículas de membrana externa de P. gingivalis ATCC33277, la actividad enzimática se evaluó con sustratos fluorogénicos. La presencia de las proteínas se confirmó por SDS-PAGE y Western Blot y fueron usadas como antígenos en la detección de los anticuerpos contra estos factores de virulencia mediante ELISA en 143 pacientes con AR y 112 individuos sin AR. Se encontraron diferencias significativas en los títulos de anti-RgpA entre los dos grupos y se determinó asociación con el diagnóstico de AR (OR 4.09; IC 95% 1.2-13.9), mientras que los anti-PPAD no presentan diferencias. La interacción anti-RgpA/anti-PPAD se asoció con diagnósticos de AR (OR 6.63; IC 95% 1.61-27). Además, se purificaron con éxito los dos factores de virulencia de P. gingivalis y se desarrolló el ELISA, permitiendo la detección de los anticuerpos frente a estas proteínas. Los anticuerpos anti-RgpA y la doble positividad de los anticuerpos anti-RgpA/anti-PPAD pueden ser marcadores diagnósticos de la AR. (Texto tomado de la fuente) Clinical and epidemiological studies have confirmed the bidirectional association between rheumatoid arthritis (RA) and periodontitis. This association is attributed to Porphyromonas gingivalis, due to the presence of peptidyl arginine deiminase (PPAD) together with the action of Arg-gingipains in citrullination, linked to the alteration of immunological tolerance in RA. It has been confirmed that anti-P. gingivalis accompany the development of RA. Nevertheless. Few studies investigate the association of specific virulence factors of this bacterium with RA. In this study we have recombinantly produced PPAD and purified native RgpA gingipain from outer membrane vesicles of P. gingivalis ATCC33277, the enzymatic activity was evaluated with fluorogenic substrates. The presence of the proteins was confirmed by SDS-PAGE and Western Blot and they were used as antigens in the detection of antibodies against these virulence factors by ELISA in 143 patients with RA and 112 individuals without RA. Significant differences were found in anti-RgpA titers between the two groups and an association with RA was determined (OR 4.09; 95% CI 1.2-13.9), while anti-PPAD did not present differences. The anti-RgpA/anti-PPAD interaction was associated with RA diagnoses (OR 6.63; 95% CI 1.61-27). In addition, the two virulence factors of P. gingivalis were successfully purified and the ELISA was developed, allowing the detection of antibodies against these proteins. Anti-RgpA antibodies and the double positivity of anti-RgpA/anti-PPAD antibodies can be diagnostic markers of RA. Minciencias- Ministerio de Ciencia Tecnología e Innovación. Contrato: 642-2017 Código: 130874455642 Doctorado Doctor en Biotecnología Microbiología Oral

Porphyromonas gingivalis es un patógeno periodontal, que secreta vesículas de membrana externa (OMV) como vehículo de factores de virulencia e incluso se ha reportado que estas pueden ser más virulentas que la propia bacteria y podrían modular la respuesta inmune. Objetivo: Determinar las variaciones en la expresión de mediadores inflamatorios en macrófagos humanos estimulados con vesículas de membrana externa de P. gingivalis. Métodos: Monocitos U937 fueron diferenciados a macrófagos y estimulados a diferentes tiempos con OMV, lisado bacteriano y bacteria viva. En experimentos independientes cada estímulo fue pre-tratado con los inhibidores KYT-1, KYT-36 y Polimixina-B para bloquear la acción de las gingipaínas R y K y además del LPS respectivamente. Se determinaron los niveles solubles de citocinas y quimiocinas y también del ARNm. Se usó ANOVA factorial para el análisis estadístico. Resultados: Las vesículas estimularon la producción de citocinas proinflamatorias y quimiocinas. Sin embargo, cuando se bloquean las gingipaínas R y K presentes en OMV, los niveles de IL-1β, IL-6, MCP-1, RANTES, MIP-1α e IL-8 aumentaron significativamente comparado con células sin estímulo y las estimuladas sin el bloqueo (p0,05). De manera contraria, se encontró una disminución en los niveles de TNF-α después de bloquear las proteasas o LPS. Conclusión: Las vesículas de membrana externa de P. gingivalis más que las bacterias vivas inducen cambios en la secreción de mediadores inflamatorios en macrófagos humanos por eventos de proteólisis dependientes de gingipaínas lo cual podría estar involucrado en el establecimiento de un estado crónico característico de la enfermedad periodontal. Abstract: Porphyromonas gingivalis is a periodontal pathogen, which secretes outer membrane vesicles (OMV) as a vehicle for virulence factors and it has even been reported that these can be more virulent than the bacterium itself and could modulate the immune respon se. Objective: To determine the variations in the expression of inflammatory mediators in human macrophages stimulated with outer membrane vesicles of P. gingivalis . Methods : U937 monocytes were differentiated into macrophages and stimulated at different t imes with OMV, bacterial lysate and live bacteria. In independent experiments each stimulus was pre - treated with inhibitors KYT - 1, KYT - 36 and Polymyxin - B to block the action of the R and K gingipains and in addition to the LPS respectively. The soluble lev els of cytokines and chemokines and also of the mRNA were determined. Factorial ANOVA was used for the statistical analysis. Results: The vesicles stimulated the production of proinflammatory cytokines and chemokines. However, when the R and K gingipains p resent in OMV are blocked, the levels of IL - 1β, IL - 6, MCP - 1, RANTES, MIP - 1α and IL - 8 increased significantly compared with cells without stimulus and those stimulated without the blockade (p 0.05). Conversely, a decrease in TNF - α levels was found after bl ocking proteases or LPS. Conclusion: The outer membrane vesicles of P. gingivalis , more than live bacteria , induce changes in the secretion of inflammatory mediators in human macrophages due to gingipain s - dependent proteolysis events , which could be involv ed in the establishment of a chronic state characteristic of periodontal disease. Maestría

Porphyromonas gingivalis es un microorganismo fuertemente asociado con la etiología de la periodontitis. Esta bacteria posee varios factores de virulencia, dentro de los que destacan las gingipaínas, debido a sus múltiples acciones relacionadas con la destrucción de la matriz extracelular del tejido conectivo periodontal, la modulación del sistema inmune del hospedero y la estimulación de la expresión de citoquinas pro-inflamatorias. Estas proteinasas tienen afinidades específicas siendo Arg-gingipaínas (RgpA y RgpB, codificadas por los genes rgpA y rgpB, respectivamente) y Lys-gingipaínas (Kgp, codificada por el gen kgp). Se ha descrito que existen polimorfismos en los genes que codifican para esta proteinasas. El objetivo del presente estudio fue describir la frecuencia de los genotipos identificados para los genes rgpA y kgp en aislados clínicos de P. gingivalis, obtenidos desde pacientes con periodontitis. Para ello se utilizó amplificación por PCR de los genes rgpA y kgp, seguido de análisis de restricción. De un total de 47 aislados provenientes de 4 individuos con periodontitis crónica y 2 con periodontitis agresiva, se genotipificaron 38 aislados para el gen rgpA, exhibiendo la totalidad de éstos el patrón electroforético A (100%). Para el gen kgp se genotipificaron 43 aislados, presentando 28 de ellos (65.2%) el perfil electroforético kgp-I y 15 aislados (34.8%) el perfil kgp-II. En los aislados provenientes de un individuo fue posible apreciar ambos genotipos descritos para el gen kgp. Los resultados indican un predominio del patrón electroforético A (rgpA) y que el genotipo kgp-I fue el más frecuentemente encontrado de los genotipos kgp. Porphyromonas gingivalis is a microorganism strongly associated with the etiology of periodontitis. This periodontal bacterium possesses an array of virulence factors, among which gingipains have a key importance, being involved with extracellular matrix destruction of periodontal tissues, modulation of host immune response and stimulation in the production of pro-inflammatory cytokines by different types of cells. These proteinases have specific affinities, being Arg-gingipains (RgpA and RgpB, encoded by rgpA and rgpB genes, respectively) and Lys-gingipains (Kgp, encoded by the kgp gene). It has been described that there are polymorphisms in the genes encoding for gingipains. Therefore, the aim of the present study was to describe the frequency of rgpA and kgp genotypes in clinical isolates of P. gingivalis obtained from periodontitis patients. For determining the rgpA and kgp genotypes, we used PCR amplification and restriction analysis. From 47 isolates obtained from 4 individuals with chronic periodontitis and 2 subjects with aggressive periodontitis, 38 were typified for rgpA gene and all exhibited the electrophoretic pattern A (100%). For kgp gene, we characterized 43 isolates, 28 of them (65.2%) with the kgp-I electrophoretic profile and 15 isolates (34.8%) with the kgp-II profile. In the isolates belonging to one individual, we found both genotypes of kgp gene. The results indicate a clear predominance of the electrophoretic pattern A (for rgpA gene) and kgp-I genotype was the most frequently found of the kgp genotypes.