Search

Introducción. El interferón beta (IFN-β) se usa para tratar la forma recaída-remisión de la esclerosis múltiple. Sin embargo, el uso de proteínas recombinantes como medicamentos puede generar la producción de anticuerpos, disminuyendo así la efectividad del tratamiento. Objetivo. Estandarizar una técnica de detección de anticuerpos neutralizantes contra IFN-β, mediante citometría de flujo. Materiales y métodos. Se cultivaron dos líneas tumorales humanas (U937 y K562) con IFN-β1a humano recombinante y mediante citometría de flujo se determinó la expresión de la proteína ISG15 intracelular. Los sueros se obtuvieron de un conejo Nueva Zelanda antes y después de la inmunización con 100.000 UI de IFN-β1a en adyuvante de Freund. Para la detección de anticuerpos neutralizantes, se estimularon células K562 con IFN-β1a preincubado con sueros de conejos a una dilución 1:20. Después de 24 horas de incubación se determinó la expresión de la proteína ISG15. Resultados. La expresión de ISG15 fue mayor en células K562 estimuladas. La intensidad media de fluorescencia para la ISG-15 entre células en ausencia IFN-β1a, mostró una mediana de 198 unidades arbitrarias (UA) (p25-75= 173-231 UA) y, en presencia de IFN-β1a, 430 UA (p25-75 =316-611,5), con una diferencia estadísticamente significativa (p=0,008). La presencia de anticuerpos anti-IFN-β1a en el suero del conejo inmunizado, hizo disminuir de forma acentuada la expresión de la ISG15 en células K562 cultivadas con IFN-β1a, en comparación con el control (mediana=3,040 UA Vs. 43,644 UA, respectivamente). Conclusiones. Este trabajo muestra la detección de anticuerpos neutralizantes contra IFN-β en conejos, utilizando la expresión de la proteína ISG15 por citometría de flujo. Introduction. Interferon beta (IFN-β) is a treatment for relapsing remitting multiple sclerosis. However, the therapeutic use of recombinant proteins induces a humoral immunologic response resulting in the induction of binding (BAb) or neutralizing (NAb) antibodies against the biological product. The presence of neutralizing antibodies has been associated with decreased IFN-β treatment efficacy. Materials and methods. Two tumor cell lines (K562 and U937) were cultivated with human recombinant IFN-β1a at different concentrations and lengths of time in order to measure the expression of intracellular ISG15, an inducible molecule in the IFN-β1a signaling cascade. Blood was obtained from non-immunized and IFN-β1a immunized (100,000 IU) New Zealand rabbits. The presence of BAb was evaluated by ELISA. For NAb detection, sera 1:20 dilution were added to the IFN-β1a-stimulated cell lines, and ISG15 expression was evaluated by flow cytometry. Results. K562 cells provided the better cell line for the assay, stimulated with a dose of 1,000 IU of IFN-β1a, and a 1:100 dilution for the primary antibody and a 1:200 dilution for the secondary antibody. ISG15 expression was compared between cells alone or cultivated with IFN-β1a. Mean fluorescence intensity (MFI) for ISG-15 expression median was 198 arbitrary units (AU) with interquartile ranges of 173-231 AU for non-stimulated cells and 430 AU with interquartile ranges of 316-611.5 AU for IFN-β1a stimulated cells (p

De Espeletia killipi Cuart. foi isolado uma sesquiterpenlactona identificada como acetato de longipilina que mostrou atividade citotóxica. A citotoxidade foi avaliada em células normais obtidas de sangue periférico, tiróide, testículo e epitélio da boca. Células da medula óssea de pacientes com leucemia crônica mielóide, linfoma de Hodking (do Instituto Nacional de Câncer de Bogotá, Colômbia) e células K562 também foram avaliadas. A citotoxidade foi determinada através do teste MTT (3-(4,5-dimethyldiazol-2-yl)-2,5 diphenyl Tetrazolium Bromid). Os ensaios mostraram que a substância não é tóxica para células normais mas a 3 mg/mL apresentou significante atividade em células tumorais e linhagem K562. Conseqüentemente, lavando-se em conta essa significante ação, novas investigações podem ser consideradas plausíveis. The compound responsible for the citotoxic effect was identified as longipilin acetate, a sesquiterpenelactone isolated from Espeletia killipi Cuatr. Citotoxicity was assessed by using normal cells obtained from peripheral blood, thyroid, testicle and mouth epithelium. Bone marrow cells from patients with chronic myeloid leukemia, Hodking lymphoma (from Cancer National Institute, Bogotá Colombia) and the cell line K562 were also assayed. Citotoxicity was determined by the MTT cell viability test (3-(4,5-dimethyldiazol-2-yl)-2,5 diphenyl Tetrazolium Bromid]. The assays revealed that the substance is risk-free on normal cells but at 3 mg/mL has significant activity on tumor cells and K562 cell line. Consequently, taken into account this significant action, new research approaches can be foreseen.

El aluminio (Al) es un elemento ampliamente distribuido en la Naturaleza, dehecho, el tercero en abundancia. A pesar de su ubicuidad, no posee una funciónbiológica conocida, por lo tanto, su incorporación a los seres vivos puede provocarsignos de toxicidad. La sobrecarga con Al ha sido asociada con la aparición dediferentes desórdenes, tales como: defectos óseos, encefalopatía y alteracioneshematológicas. Estos signos de toxicidad, aunque fueron inicialmente detectados enpacientes con insuficiencia renal crónica, pueden presentarse también en individuos confunción renal intacta. El extenso uso de este elemento en la vida cotidiana lo convierteen un riesgo potencial para la población en general. Una vez ingresado al organismo, el Al es conducido a través del torrentesanguíneo por la misma proteína que transporta hierro (Fe), la transferrina (Ti) yacumulado en distintos órganos y tejidos. Diversos antecedentes permitieron relacionarla acumulación de Al con el desarrollo de anemia. Por lo tanto, el objetivo planteadopara desarrollar este trabajo de investigación fue estudiar la interferencia del Al con elmetabolismo normal de Fe. Para ello, se emplearon células de la línea eritroleucémica K562, las cuales expresan receptores específicos para Tf (RTf y RTf2) en su membranay experimentan maduración eritroide por la acción de inductores, tales como hemina ybutirato de sodio. Los resultados demostraron que el Al interfiere con el proceso de diferenciacióncelular, ya que provoca disminución del número de células hemoglobinizadas. Elcálculo de las Kd correspondientes mostró que el RTf posee afinidad similar por loscomplejos Tf-Fe y Tf-Al, lo cual conlleva al establecimiento de una relación competitivacuando ambos están presentes simultáneamente en el entorno celular. Esta situacióntrae como consecuencia la disminución de la incorporación total de Fe y, por lo tanto,de su utilización en la síntesis de hemo. Sin embargo, cuando el Al es removido,dependiendo de la duración de la exposición a este metal y de las condiciones deinducción, la captación de Fe excede a la de las células que no fueron expuestaspreviamente a Al. Esta observación sugiere la activación de algún mecanismo destinadoa compensar la menor incorporación del metal esencial por efecto del Al. La posibilidadde que la expresión del RTf o RTf2 fuera regulada positivamente fue descartada, ya quelos niveles de ARNm y de proteína no fueron modificados como consecuencia de laexposición a Al. Además de las vías que median la incorporación de Fe unido a Tf, existenmecanismos alternativos para la captación del metal esencial cuando está presente en laforma de compuestos de bajo peso molecular. La remoción de Al, después de untratamiento previo, indujo una regulación positiva de estos sistemas de transporte de Feindependientes de Tf. Puede concluirse que la presencia de Al en el entorno celular interfiere la normalincorporación y utilización de Fe. Ello induce una adaptación celular tendiente aalcanzar los niveles del metal esencial requeridos para el metabolismo. La regulaciónpositiva de las vías alternativas de captación de Fe, las cuales no participan en laincorporación de Al, da cuenta de parte de esta respuesta, aunque no puede serdescartada la posibilidad de que la afinidad de los receptores para Tf pueda sermodificada. Sin embargo, a pesar de estas adaptaciones, la presencia continua de Al enel medio impide a las células lograr la utilización adecuada de Fe en la síntesis dehemoglobina. Aluminum (Al) is widely distributed in Nature and, in fact, it is the third elementmore abundant. In spite of this, its biological function is not known, and its incorporationto living beings proved to have toxic effects. The exposure to Al has been associated todifferent disorders, such as: bone defects, encephalopathy, and hematologic alterations. Even though these toxicity signs were first detected in patients with chronic renaldeficiency, they may be also observed in people with intact renal functions. The wide useof this metal in everyday life turns it into a potential hazard to the population in general. Once it enters the organism, Al is transported through the bloodstream bytransferrin (Tf), the same protein that transports iron (Fe), and it is accumulated indifferent organs and tissues. Several facts related Al accumulation to the development ofanemia. Therefore, the aim of this work was to study Al interference with normal Femetabolism. Assays were carried out using cells from the erythroleukemic line K562,which express specific receptors for Tf (TfR and TfR2) in their membranes andexperienced erythroid maturity due to the action of inducers such as hemin and sodiumbutyrate. Results showed that Al interferes with the cellular differentiation process causing adecrease in the number of hemoglobinized cells. The determination of the corresponding Kd showed that TfR has similar affinity for complexes Tf-Fe and Tf-Al, thus establishinga competitive relation between them when they are simultaneously present in the cellularenvironment. This situation triggers a reduction in the total incorporation of Fe and, thus,in its utilization in the synthesis of heme. However, when Al is removed, depending on thelength of the exposure and on the induction conditions, Fe incorporation is higher than incells not previously exposed to Al. This suggests the existence of a certain mechanismdeveloped to compensate the lower essential metal incorporation caused by Al. Positiveregulation of TfR or TfR2 expression was discarded since RNAm and protein levels werenot modified by Al exposure. Apart from the pathways that mediate Tf-Fe incorporation, there are alternativemechanisms for essential metal uptake when it is in the form of low molecular weightcompounds. The removal of Al after a previous treatment induced the positive regulationof these transport systems of Tf-independent Fe. We may conclude that the presence of Al in the cellular environment interfereswith normal Fe incorporation and utilization. This induces a cellular adaptation intendedto reach the essential metal levels necessary for metabolism. The positive regulation of thealternative Fe uptake pathways, which do not participate in Al incorporation, partlyexplains this response, but the possibility that the affinity of Tf receptors may be modifiedshould not be discarded. However, in spite of these adaptations, the continuous presenceof Al in cellular environment prevents the adequate utilization of Fe in hemoglobinsynthesis. Fil: Pérez, Gladys Mabel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.