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Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura:21-09-2018, Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 21-03-2020, Las enfermedades cardiovasculares constituyen la mayor causa de muerte y hospitalización a nivel mundial, sin embargo, el papel de las proteínas de unión a RNA (RBPs) en las mismas no se conoce lo suficiente. Nosotros hemos observado que tras un infarto de miocardio (MI), la expresión de SRSF3 se reduce, sugiriendo que podría desempeñar un papel en la enfermedad y/o la homeostasis cardiaca. La falta de expresión cardiaca de SRSF3 durante el desarrollo resulta letal para los embriones, indicando que SRSF3 es necesario para la correcta formación del corazón, sobre todo tras E11.5 cuando su expresión cardiaca se incrementa. Para determinar su papel en el corazón adulto desarrollamos un modelo de ratón knockout para SRSF3 cardio-específico e inducible con tamoxifeno. Tras la inyección de tamoxifeno, los ratones muestran una dramática reducción en la contractilidad del corazón, lo que da lugar a la muerte de los animales en ocho días. Estos ratones muestran un incremento en marcadores de disfunción cardiaca junto con una importante bajada de expresión de genes involucrados en la contracción cardiaca. También descubrimos que SRSF3 interactúa con LSM14A, el cual interviene en el proceso de decapping y degradación de los mRNAs. Curiosamente, existe un aumento del decapping de los mRNAs que reducen su expresión tras la pérdida de SRSF3. Estos resultados sugieren que SRSF3 previene el decapping de los mRNAs, probablemente mediante su interacción con LSM14A y que su eliminación induce la degradación de los genes implicados en la contracción debido al incremento del decapping. Utilizando un virus adeno-asociado de serotipo 9 que expresa SRSF3 (AAV9-SRSF3), observamos que tras un MI, los ratones sobrexpresantes de SRSF3 muestran un incremento de la fracción de eyección y una reducción del volumen diastólico del ventrículo izquierdo, sugiriendo que la bajada de expresión de SRSF3 tras el MI es parcialmente responsable del empeoramiento de la función cardiaca. Además, también hemos observado un incremento del decapping y una bajada de expresión de los genes implicados en la contracción en ratones C57BL/6 tras un MI.

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímia. Fecha de lectura: 27-01-2020, Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 27-07-2021, Las enfermedades cardiovasculares constituyen la mayor causa de muerte a nivel mundial, sin embargo la regulación de los mecanismos post-transcripcionales y el papel de las proteínas de unión a RNA (RBPs) en estas enfermedades continúa siendo un campo por descubrir. Estudios recientes muestran que la expresión aberrante de RBPs puede afectar a varios puntos del procesamiento del RNA, alterando la función de sus genes diana. La RBP serine-arginine rich factor 4 (SRSF4) está implicada en el desarrollo de patologías neurológicas y en cáncer. Sin embargo, su papel en el corazón es completamente desconocido. Nuestros análisis ecocardiográficos mostraron que los ratones con pérdida cardio-específica de SRSF4 (SRSF4 KO) desarrollan hipertrofia ventricular izquierda por un incremento del área de los cardiomiocitos, y disfunción diastólica en edades más avanzadas. Además, los ratones SRSF4 KO presentaron una actividad electrofisiológica alterada bajo condiciones de estrés cardiaco inducido por isoproterenol, incluyendo una depresión después del QRS y un QT largo, indicando un elevado riesgo de muerte súbita. El análisis por RNA-seq mostró cambios de expresión en un gran número de RNAs largos no codificantes (lncRNAs), entre los que se encontraba el lncRNA-GAS5 (Growth Arrest Specific 5), el cual hemos identificado como diana directa de SRSF4 en cardiomiocitos mediante individual nucleotide-resolution Cross-Linking and ImmunoPrecipitation (iCLIP). GAS5 es un inhibidor del receptor de glucocorticoides (GR), y su expresión se encontraba disminuida en los corazones SRSF4 KO. Consecuentemente, encontramos una elevación de la actividad transcripcional del GR que conducía a un incremento de marcadores de hipertrofia y del área celular. Además la sobreexpresión de GAS5 reducía la hipertrofia de los cardiomiocitos., Cardiovascular diseases are the main cause of death worldwide, however the regulation of post-transcriptional mechanisms, like alternative splicing and the role of the RNA Binding Proteins (RBPs) during these diseases continues to be a field to be discovered. Emerging studies have shown that RBPs play critical roles in human biology and pathogenesis. Aberrant expression of RBP genes affect various steps of RNA processing, altering target gene function. Serine/arginine splicing factor 4 (SRSF4) has been related with neuropathies and cancer. However, its role in the heart is completely unknown. Echocardiographic analysis showed that cardio-specific knockout mice for SRSF4 (SRSF4 KO) develop left ventricular hypertrophy and present an increased cardiomyocyte area compared to controls. These mice also showed increased expression of heart disease markers. Older mice also presented diastolic dysfunction. Moreover, SRSF4 KO mice presented an altered electrophysiological activity under cardiac stress induced by isoproterenol, with a depression after the QRS and long QT interval, indicating an elevated risk of sudden cardiac death. RNA-Seq analysis showed expression changes in several long noncoding RNAs (lncRNAs), among which we found the lncRNA-GAS5 (Growth Arrest Specific 5), which we have identified as a direct target for SRSF4 in cardiomyocytes by individual nucleotide-resolution Cross-Linking and ImmunoPrecipitation (iCLIP). GAS5 is a repressor of the glucocorticoid receptor (GR) and it was downregulated in SRSF4 KO hearts. Consequently, we found an elevated transcriptional activity of GR in cardiomyocytes which leads to an increase in hypertrophy markers and cell size. Furthermore, we also found that the GAS5 overexpression in cardiomyocytes lacking SRSF4 reduces cell hypertrophy.

Cardiovascular diseases are a major cause of mortality and hospitalization worldwide, however the role of RNA binding proteins (RBPs) in heart disease is poorly understood. We have found that SRSF3 expression decreases after myocardial infarction (MI), suggesting that it may play a role in cardiac homeostasis and/or disease. We found that SRSF3 cardiac depletion during development is embryonic lethal, indicating that SRSF3 is necessary for heart development, especially after E11.5 when its expression is upregulated in the heart. To determine the role of SRSF3 in the adult heart we developed a cardiomyocytespecific tamoxifen-inducible SRSF3 knockout mouse line. After tamoxifen injection, mice showed a dramatic reduction in heart contractility, resulting in death of the animal within eight days. Gene expression analysis showed increased expression of cardiac dysfunction markers, together with a downregulation of genes involved in cardiac contraction. We also found that SRSF3 interacts with LSM14A, which has been described to promote mRNA decapping and degradation. Interestingly, we observed increased decapping of those mRNAs downregulated after SRSF3 depletion. These results suggest that SRSF3 prevents mRNA decapping probably by interacting with LSM14A and that its depletion induces the degradation of contraction related genes due to decapping. Using an adeno-associated virus serotype 9 that overexpresses SRSF3 (AAV9-SRSF3), we observed that after MI, overexpression of SRSF3 resulted in an increase in left ventricular ejection fraction and a decrease in left ventricular diastolic volume, suggesting that the downregulation of SRSF3 after MI is partially responsible for the deterioration of cardiac function. Furthermore, we have also found increased decapping and downregulation of contraction related genes after MI in C57BL/6 mice.

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 21-12-2015, Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 21-06-2017, El splicing alternativo desempeña un papel muy importante durante la diferenciación de las células progenitoras embrionarias (ESC). Nuestros resultados muestran como Mbnl1 regula el splicing del mRNA de calcineurina A beta (CnAβ) en ESC de ratón, resultando en la expresión de la variante atípica CnAβ1 que posee un dominio C-terminal único. La inhibición de CnAβ1 provoca la inactivación de la señalización de Akt/GSK3β/β-catenina, lo que su vez se traduce en un defecto en la especificación a mesodermo. Hemos identificado un dominio específico en la segunda α-hélice de la región C-terminal que regula la activación de la vía de Akt/GSK3β/β-catenina. Tras realizar un ensayo de doble híbrido en levadura, encontramos que CnAβ1 interacciona con Cog8 en el aparato de Golgi. La inhibición de Cog8 deslocaliza CnAβ1 e interfiere con la diferenciación a mesodermo de las ESC. En resumen, hemos determinado las bases estructurales para el mecanismo de acción de CnAβ1 y su función en la diferenciación de las ESC al linaje de mesodermo. Con el fin de caracterizar mejor la función de CnAβ1 in vivo, eliminamos la región C-terminal única de CnAβ1 por la eliminación del intrón 12-13, que llamamos CnAβΔi12. Los ratones provenientes de esta construcción nacen de manera normal y no presentan ningún defecto a 2 meses de edad, pero con el tiempo desarrollan una hipertrofia cardiaca a los 15 meses. Curiosamente, la sobreexpresión de CnAβ1 en los cardiomiocitos, bajo el promotor de α-MHC, es capaz de disminuir los efectos de la hipertrofia cardiaca en un modelo de sobrecarga por presión. Estos resultados son opuestos a los descritos anteriormente para otras isoformas de calcineurina y sugieren su potencial uso para terapias, Alternative splicing plays a key role in embryonic stem cell (ESC) differentiation but the mechanisms involved remain poorly understood. Here, we show that Mbnl1 regulates the splicing of the calcineurin A gene in mouse ESCs (mESC), resulting in expression of the atypical variant CnAβ1, which has a unique C-terminal domain. CnAβ1 knockdown results in inactivation of the AKT/GSK3β/-catenin signalling pathway, leading to defective mesoderm specification. We found that a specific motif in the second alpha helix of the Cterminal domain drives CnAβ1 localisation to the Golgi apparatus, which is necessary for the activation of the AKT/GSK3β/-Catenin pathway. Following a yeast 2-hybrid screening, we found that CnAβ1 interacts with Cog8 in the Golgi apparatus. Cog8 knockdown delocalises CnAβ1 and interferes with mESC mesodermal differentiation. In summary, we unveil here the structural basis for the mechanism of action of CnAβ1 and its role in the differentiation of mESC to the mesodermal lineage. To further unveil the function of CnAβ1 in vivo we have deleted the unique C-terminal region of this isoform by deleting intron 12- 13, which we called CnAβΔi12. These mice are born normally and do not present any defect at 2 months of age, however they developed cardiac hypertrophy by 15 months of age. Interestingly, the overexpression of CnAβ1 in the cardiomyocytes under the αMHC promoter is able to reduce cardiac hypertrophy in a mouse model of pressure overload. This result is opposite to the function described for other calcineurin isoforms and suggests its potential use for therapies