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La esclerosis múltiple remitente-recurrente (EM-RR) es una enfermedad desmielinizante del sistema nervioso central. A fin de entender la asociación del estrés oxidativo a nivel periférico con la recaída de la enfermedad se determinaron los niveles de marcadores de estrés oxidativo en plasma de pacientes en la recaída o brote y una semana después de la misma. Se analizaron muestras de 60 personas (20 pacientes con recaída, 20 pacientes sin recaída y 20 controles sanos). Se cuantificaron mediante métodos espectrofotométricos las actividades enzimáticas de óxido nítrico sintasa (ONS), glutatión peroxidasa (GPx), los niveles de lipoperóxidos y nitritos-nitratos y la fluidez de membrana. En el brote de la enfermedad aumentan significativamente los niveles de las actividades enzimáticas de ONS y GPx y los niveles de nitritos-nitratos y lipoperóxidos (p

ResumenLa restricción del crecimiento intrauterino (RCIU) es una enfermedad perinatal que afecta la trayectoria de crecimiento fetal, llegando a estar bajo el percentil 10 del peso esperado para la edad gestacional. Esta condición se ha asociado con un mayor riesgo cardiovascular, metabólico y de obesidad en la vida posnatal. Junto con ello se observan cambios importantes en la función placentaria, y particularmente en una molécula clave en esta regulación, que es el óxido nítrico. La síntesis del óxido nítrico presenta numerosos mecanismos de control, así como de competencia por su sustrato común, el amino ácido L-arginina, con la arginasa. Esta competencia queda de manifiesto en diversas enfermedades vasculares, y particularmente en el endotelio de los vasos umbilicales de fetos con RCIU. Junto con ello se puede observar una regulación a nivel epigenético, donde la metilación en regiones específicas de los promotores de algunos genes, como el de la sintasa del óxido nítrico regulan su expresión. Es de gran interés en la actualidad conocer los mecanismos por los cuales enfermedades como la RCIU pudieran estar condicionadas particularmente por condiciones nutricionales y metabólicas maternas y los mecanismos epigenéticos que pudieran ser eventualmente modificables y, por tanto, foco de interés para intervenciones en salud.AbstractIntrauterine growth restriction (IUGR) is a perinatal condition affecting foetal growth, with under the 10th percentile of the weight curve expected for gestational age. This condition has been associated with higher cardiovascular and metabolic risk and post-natal obesity. There are also major changes in placental function, and particularly in a key molecule in this regulation, nitric oxide. The synthesis of nitric oxide has numerous control mechanisms and competition with arginase for their common substrate, the amino acid L-arginine. This competition is reflected in various vascular diseases and particularly in the endothelium of the umbilical vessels of babies with IUGR. Along with this, there is regulation at the epigenetic level, where methylation in specific regions of some gene promoters, such as the nitric oxide synthase, regulating their expression. It is currently of great interest to understand the mechanisms by which diseases such as IUGR may be conditioned, particularly by maternal nutritional and metabolic conditions, and epigenetic mechanisms that could eventually be modifiable, and thus a focus of interest for health interventions.

Los informes de la literatura apoyan el papel de la arginina como mecanismo regulador de la respuesta inmune. Se ha descrito la correlación entre disminución de la arginina y reducción de la proliferación y la activación de los linfocitos T en trasplante hepático, trauma grave, sepsis y cáncer. Entre los efectos se describen la disminución en la expresión de la cadena CD3z (traducción de la señal de activación en el linfocito T). La disminución de la arginina está relacionada con la producción de arginasa 1 (ARG1) por parte de las células mieloides supresoras. Se han propuesto dos posibles mecanismos por medio de los cuales el aumento de la actividad de ARG1 podría estar actuando en un proceso tumoral. El primero es la disminución de la proliferación de los linfocitos y el freno del ciclo celular. El segundo es promover el crecimiento tumoral al transformar la arginina en precursores de poliaminas. Se presentan en este artículo los principales conceptos del papel de la arginina en la respuesta antitumoral. Recent findings support the potential role of arginine as a regulator of the immune response. Correlation between decreased arginine and decreased proliferation and activation of T lymphocytes has been described in liver transplantation, severe trauma, sepsis and cancer. Among the effects, decrease in the CD3z chain expression (activation signal in the T cell) has been described. Arginine is reduced in relation to the production of arginase 1 (ARG1) by myeloid suppressor cells. Two possible mechanisms have been postulated by which the increased activity of ARG1 could be acting on a tumor. The first is the reduction of lymphocyte proliferation and cell cycle arrest. The second is to promote tumor growth by transforming arginine in precursors of polyamines. We present in this article the main concepts on the role of arginine in antitumor response.

El óxido nítrico (ON) es un potente vasodilatador endógeno que se estimula por las enzimas óxido nítrico sintetasa constitutiva y óxido nítrico sintetasa inducible a partir del sustrato L-arginina. La enzima óxido nítrico constitutiva es calcio dependiente y mantiene el equilibrio fisiológico en los tejidos donde se libera. La enzima óxido nítrico sintetasa inducible es calcio independiente, se libera en condiciones de estímulo inflamatorio y contribuye a graves cuadros de inestabilidad hemodinámica en relación con la hipotensión refractaria que produce. En la actualidad hay propuestas terapéuticas relacionadas con la regulación en la producción del ON y su administración exógena.Nitric oxide(NO) is a powerful endogenous vasodilator which is stimulated by constitutive nitric oxide synthase and inducible nitric oxide synthase enzimes from L-arginine substrate. The constitutive nitric oxide synthase enzime is dependent calcium and it keeps the physiological balance in those tissues where it is released. On the other hand, the inducible nitric oxide synthase enzime is independent calcium which is released under inflammatory conditions and contributes to serious hemodynamic inestability since it causes refractory hypotension. At present, there are several suggested therapies for controlling NO production and exogenous administration.

El objetivo de este trabajo fue interrelacionar las alteraciones conductuales, neuroquímicas e inmunológicas inducidas por estrés crónico en dos cepas endocriadas de ratones, BALB/c y C57BL/6. Se utilizó un modelo de estrés crónico moderado (CMS) que consiste en la aplicación de varios estresores de moderada intensidad, de manera crónica, alternada e impredecible durante varias semanas. Se observó que los ratones BALB/c expuestos a CMS presentaron una menor capacidad de aprendizaje y memoria compatible con alteraciones estructurales y neuroquímicas observadas en el hipocampo, como disminución de la neurogenésis, disminución de la actividad y del nivel proteico de nNOS, perfil proteico diferencial de isoformas de PKC, entre otras. Estas alteraciones no fueron encontradas en los ratones C57BL/6 expuestos a CMS. En lo que respecta a la respuesta inmune, los BALB/c CMS presentaron una disminución en la proliferación de linfocitos T y un aumento en la proliferación de linfocitos B estimulada por mitógenos. Así como un desbalance de citoquinas hacia Th2. Por el contrario, los animales C57BL/6 CMS mostraron un aumento en la reactividad en los linfocitos T sin presentar cambios en la correspondiente a los linfocitos B y un desbalance de citoquinas hacia Th1. Respecto a la participación de las hormonas clásicamente relacionadas al estrés (catecolaminas y corticosterona), los resultados indicaron que no existe una coincidencia temporal entre el aumento de dichas hormonas y la aparición de las alteraciones mencionadas. Además, los cambios observados en los ratones BALB/c CMS pudieron ser revertidos por la administración de Copaxone®, que estimula débilmente la respuesta autoinmune induciendo un aumento de las citoquinas Th1. Estos hallazgos señalan que las terapias basadas en la modulación del sistema inmune podrían ser útiles para el tratamiento de déficit cognitivos inducidos por estrés. Palabras claves: psiconeuroinmunología, ratones BALB/c y C57BL/6, estrés crónico, aprendizaje y memoria, neurogénesis, óxido nítrico sintasa, proteína quinasa C, balance Th1/Th2, Copaxone®. The aim of this work was to investigate the relationship between the behavioral, neurochemical and immunological alterations induced by chronic stress in two inbred mouse strains, BALB/c y C57BL/6. A chronic mild stress (CMS) model, consisting of the chronic application of several stressors of moderate intensity applied in an unpredictable manner for several weeks, was utilized. CMS BALB/c mice showed an impaired learning and memory which are related to structural and neurochemical changes observed in the hippocampus, such us a decrease of neurogenesis, a decrease of NOS activity and protein levels, differential protein levels of PKC isoform, among others. These alterations were not found in C57BL/6 mice subjected to CMS. Respect to immune response, CMS BALB/c mice showed a decrease in the T- lymphocyte and an increase of B-lymphocyte mitogen- stimulated proliferation, and an imbalance towards Th2 cytokines. On the contrary, CMS C57BL/6 animals showed an increase in the reactivity of T-lymphocytes without changes in the B- lymphocytes reactivity, and an imbalance towards Th1 cytokines. Concerning to the participation of the classically stress-associated hormones (catecholamines and corticosterone) in the above mentioned findings, the results indicate that there was not a temporal coincidence between corticosterone and catecholamines increase and behavioral and immune alterations. The changes observed in CMS BALB/c mice were reverted by the administration of Copaxone®, which weakly stimulates the autoimmune response increasing Th1 cytokines. These findings indicate that immune-based therapies could be useful for the treatment of cognitive deficits induced by stress. Fil: Palumbo, María Laura. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El óxido nítrico (NO) juega un papel importante en la regulación de la homeostasis vascular. La producción endotelial de NO está regulada por la óxido nítrico sintasa endotelial (NOSe), por lo tanto variaciones genéticas en el gen NOS3 podrían influir en la producción de NO. Tres polimorfismos (Glu298Asp, intrón-4 y -786T>C) en el gen NOS3, han sido asociados de forma inconsistente con enfermedades cardiovasculares (ECV). Estas variantes genéticas se han asociado con disminución de RNAm, concentración séricas bajas de nitritos/nitratos y disminución de la reactividad endotelial. A pesar de la amplia investigación de estos polimorfismos en ECV y de las aproximaciones para evaluar el papel funcional, no existe evidencia suficiente que permita esclarecer el papel causal y funcional de dichos polimorfismos sobre la enfermedad. Se requiere de nuevas estrategias que permitan seleccionar polimorfismos funcionales para determinar el riesgo atribuido al genotipo sobre la enfermedad. En la presente revisión se discute el posible efecto sobre la expresión de la actividad de la NOSe de esto tres polimorfismos genéticos descritos como de alta relevancia clínica en enfermedades cardiovasculares. Salud UIS 2010; 42: 66-77 Nitric oxide (NO) plays an important role on vascular homeostasis regulation. NO endothelial production is regulated by endothelial nitric-oxide synthase (eNOS), reason for which genetic variations in NOS3 gene could influence NO production. Three polymorphisms (Glu298Asp, intron-4, and -786T>C) in NOS3 gene have been inconsistently associated with cardiovascular diseases (CVD). These genetic variables have been linked to diminishment mRNA, nitrites/nitrate low serum levels, and low endothelial reactivity. Despite wide research on these polymorphisms in CVD and several approaches to evaluate their functional role, not enough evidence is available to clarify their functional and causal participation over the disease. New strategies are required to select functional polymorphisms and to determine genotype-attributable risk over disease. In this paper, we review and discuss the possible effect on NOSe activity expression of these genetic polymorphisms with high clinical relevance in CVD diseases. Salud UIS 2010; 42: 66-77.

La enzima óxido nítrico sintetasa ha sido estudiada en mamíferos; en los últimos años se ha descrito que existe también en protozoos, pero se desconocen aspectos importantes de su función. Se logró producir anticuerpos policlonales contra la proteína recombinante con actividad de óxido nítrico sintetasa (NOS-Tg-r) de Toxoplasma gondii y realizar marcación inmunológica en taquizoítos. Se usaron dos conejos Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus)que se inmunizaron por vía intramuscular con NOS-Tg-r, y dos tipos de adyuvantes, hidróxido de aluminio y adyuvante de Freund. Se comprobó la presencia de anticuerpos policlonales con la técnica de ensayo inmunoenzimático indirecto. Los resultados obtenidos mostraron que a NOS-Tg-r con adyuvante de Freund indujo mayor respuesta inmune que la de la NOS-Tg-r con hidróxido aluminio p 0,005). Para verificar si había reacción cruzada, se realizó una prueba ELISA utilizando como antígenos: metaloproteasa de T. gondii recombinante, cisteína proteasa 5 de Entamoeba histolytica recombinante, albúmina al 2%, hidróxido de aluminio y adyuvante de Freund. Los valores obtenidos con sueros preinmunes y contra proteínas alternas no superaron el punto de corte (0,069), lo cual indica que los anticuerpos policlonales obtenidos son específicos para NOS-Tg-r. Se realizó marcación inmunológica en taquizoítos de Toxoplasma gondii con inmunofluorescencia indirecta que mostró una marcación difusa a nivel de citoplasma y confirmó la presencia de esta proteína en los taquizoítos. The nitric oxide synthase (NOS)is an enzyme well described on mammals but little is known about the role of these enzymes on pathogenic parasites. We produced polyclonal antibodies against a recombinant NOS enzyme from Toxoplasma gondii nd e lso er formed n mmunol locali zation of the enzyme on tachyzoites. We used two New Zealand rabbits (Oryctolagus cuniculus) to perform intramuscular immunization and we used two types of adjuvant: aluminum hydroxide and Freund ’s adjuvant. We tested the generation of polyclonal antibodies by an indirect ELISA assay. The results showed that levels of antibodies were higher in rabbits immunized with Freund ’s adjuvant than with aluminum hydroxide (p =0.005). In order to test cross reactions, we used a recombinant Toxoplasma metallooprotease, a recombinant cysteine protease from Entamoeba histolytica, albumin 2%, hydroxide aluminium and Freund ’s adjuvant as antigens on indirect ELISA assays for the polyclonal serum antibodies. No serum showed absorbances higher than the cutoff level with these antigens, indicating that the polyclonal antibodies were specific for recombinant Toxoplasma NOS. Additionally, we performed immunodetection of the enzyme on Toxoplasma gondii tachyzoites and we obtained a diffuse labeling of the parasite.

El oxido nítrico y el factor relajante del endotelio fueron consideradas la misma molécula moduladora del tono vascular a través de la formación estimulada de guanosina 3, 5 monofosfato. El oxido nítrico (NO) se produce durante la conversión de L-arginina a L-citrulina por las isoformas de oxido nítrico sintetasa (NOS), es un gas que modula varias funciones incluyendo la relajación del mùsculo liso, neurotransmisión, la citotoxicidad celular inmune, mecanismo de accion de agentes anestesicos y vias de nocicepcion. Esta revisión considera las acciones biológicas del oxido nítrico. Nitric oxide and endothelium-derived relaxing factor were considered a single entity, modulating vascular tone through the stimulated formation of cyclic guanosine 3',5'-monophosphate. Nitric oxide (NO), produced during the conversion of L-arginine to L-citrulline by NO synthase (NOS) isoforms, is a gaseous that mediates various functions, including smooth muscle relaxation, neurotransmission, immune cell cytotoxicity, effects of anesthetic agents and nociceptive pathways. This review will consider the biologic actions of nitric oxide.

Usando una prueba inmunohistoquímica, se calculó el porcentaje de células mesenquimales de la alantoides ovina que expresaban el Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular (VEGF) y dos isoformas de la Óxido Nítrico Sintasa endotelial (eNOS) e inducida (iNOS), y el número de vasos sanguíneos en la gestación inicial. Mientras que los porcentajes de VEGF, iNOS y eNOS disminuyeron drásticamente entre los 28 y los 35 días de gestación, el número de vasos sanguíneos aumentó (P < 0,01). Existieron diferencias significativas entre los animales de una misma edad de gestación, para el porcentaje de VEGF, porcentaje de las NOS y número de vasos sanguíneos (P < 0,01), lo cual podría indicar la participación de un factor genético determinante de la vasculogénesis, como ocurre en otras especies. No toda la población de las células mesenquimales es utilizada en la vasculogénesis. No se encontró expresión de VEGF en el trofoblasto, mientras que las dos isoformas de NOS mostraron diferente reacción inmunihistoquímica, siendo más intensa la reacción observada de eNOS que la de iNOS. En conclusión, para que el proceso de vascularización sea exitoso se requiere de la expresión de VEGF, y de dos isoformas de la NOS, las cuales al ser estimuladas por el VEGF, provocan la liberación de óxido nítrico, para potenciar la acción del factor angiogénico favoreciendo la viabilidad de los embriones. The number of blood vessels and the percentage of allantoic mesenchymal cells immunochemically expressing vascular endothelial growth factor (VEGF), induced nitric oxide synthase (iNOS) and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) were calculated during early gestation in sheep. The percentages of VEGF, iNOS and eNOS drastically diminished between 28 and 35 d of gestation, and the number of blood vessels augmented (P < 0.01). There were statistically significant differences among animals at the same gestational age for all calculated values, which might imply a genetic influence for vascular development, as reported in other species. The whole population of mesenchymal cells does not participate in vasculogenesis. There was not trophoblastic VEGF expression, but eNOS was more intensely expressed than iNOS. In conclusion, in order to have a successful vascular development in the allantois it appears that VEGF, iNOS and eNOS must be expressed which could provoke liberation of nitric oxide thus enhancing the angiogenic factor function, to favour embryonic viability.

El papel de las células dendríticas es fundamental en la señalización de la infección por Leishmania desde la piel hasta los ganglios linfáticos; sin embargo, la proliferación de Leishmania en estas células está restringida. En el macrófago, célula hospedera de Leishmania por excelencia, los parásitos proliferan irrestrictamente y el control de la infección depende directamente de los niveles de óxido nítrico. Debido a que la disponibilidad de hierro celular modula la actividad de la enzima óxido nítrico sintetasa del macrófago y para analizar las causas de la restricción de la proliferación de Leishmania en células dendríticas, en este trabajo evaluamos la influencia del hierro libre intracelular sobre la funcionalidad de células de dendríticas y la infección por Leishmania major. Los resultados demuestran que la en células de Langerhans de la piel expuestas a quelantes de hierro la infección por Leishmania major y la expresión del receptor de transferrina disminuyen, sin alterar la producción de óxido nítrico y otras propiedades funcionales de la célula. La incubación de células dendríticas de médula ósea con quelantes de hierro no afecta la infección por Leishmania major ni la producción de óxido nítrico de la célula. Estos resultados demuestran que la restricción de la proliferación de Leishmania en células dendríticas es independiente de los niveles de hierro celular y de los niveles de óxido nítrico. The immune changes associated to the experimental infection of mice with Leishmania major and the leading role played by the Langerhans cells in the signalling of the infection from the skin up to the lymphatic ganglions are well known; however, the physiological mechanisms that restrict parasite proliferation in these cells have not been yet identified. In macrophages, control of infection is associated with nitric oxide production. The availability of cellular iron modulates this effector’s system, including the activity of the enzyme nitric oxide synthase. Herein, and in an attempt to analyze if the iron metabolism- nitric oxide synthase expression loop described in other immune cells is present in dendritic cells, we have analyzed the effect of iron chelators as deferroxamine and pyridoxal-isoniconoyl hidrazone on different functions of dendritic cells isolated from BALB/c mice bone marrow. The results suggest that the control of Leishmania infection in dendritic cells is independent of the iron metabolism- nitric oxide synthase expression loop.

La autoinmunidad es una causa importante de enfermedad en los seres humanos. El síndrome de Sjögren es una enfermedad inflamatoria crónica que se caracteriza por una pérdida progresiva de la secreción salival y lagrimal. La cepa de ratones diabéticos no obesos (NOD) es el modelo murino más ampliamente utilizado para el estudio de esta enfermedad debido a que el desarrollo de la sialoadenitis está acompañado por una disminución de la respuesta secretoria. Estudios en las glándulas salivales sugieren que el óxido nítrico podría tener un papel en la regulación de la secreción salival. Por tal motivo nuestro objetivo es investigar si la disfunción secretoria de los ratones NOD está asociada a alteraciones en la actividad de la óxido nítrico sintasa y su relación con la aparición de infiltrados linfocitarios en las glándulas o la expresión de citoquinas en las mismas. Los resultados expuestos indican que las glándulas salivales de ratones NOD presentan una menor actividad de NOS a partir de las 12 semanas comparada con la de BALB/c de la misma edad y ratones NOD de 8 semanas. La disminución es total en el caso de las glándulas submaxilares. El efecto sobre la NOS coincide con una reducción del flujo salival estimulado por pilocarpina sola o pilocarpina y VIP. Ambos efectos preceden al aumento de los niveles de citoquinas proinflamatorias en las glándulas y en el suero y a la aparición de infiltrados linfomononucleares en las glándulas. Además los resultados apoyan la hipótesis de una regulación negativa de la NOS por CaM KII, como el mecanismo responsable de la disminución de la actividad observada. Autoimmunity is an important cause of disease in human beings. Sjögren´s syndrome is a chronic autoimmune disorder characterized by histological and functional alterations of exocrine glands that result in a severe dryness of the mouth and the eyes. The non obese diabetic (NOD) mouse model of Sjögren´s syndrome is the widest model used due to the fact that the development of sialoadenitis is associated to a decrease of salivary secretion. Studies in salivary glands suggest that nitric oxide could play a role in the regulation of the salivary secretion. Our objetive is to determine if the secretory dysfunction of NOD mice is associated to alterations in the activity of nitric oxide synthase and if this is previous to the appearance of lymphocytic infiltrates or cytokine expression in the glands. Our results show that the salivary glands of NOD mice present a diminished activity of NOS compared with BALB/c of same age and NOD mice of 8 weeks old. The loss of activity is complete in submandibular glands. The effect of NOS is associated with a reduction of the salivary flow stimulated by pilocarpine or pilocarpine and VIP. Both effects precede the increase of the levels of proinflammatory cytokines in glands and serum and the appearance of infiltrates in the glands. In addition the results support the hypothesis of a negative regulation of NOS by CaMKII, as the responsible mechanism for the decrease of the activity observed. Fil: Rosignoli, Florencia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

En el presente trabajo abordamos la implantación embrionaria en ratas controles ydiabéticas desde el punto de vista del fenómeno vasoactivo que conlleva. Las prostaglandinas son necesarias para permitir la implantación de losembriones en el lumen, ya sea incrementando el flujo sanguíneo y lavasodilatación del útero durante la decidualización endometrial, como regulando Ia actividad contráctil del tejido miometrial. El óxido nítrico ha sido reconocido como agente vasodilatador y miorrelajante, yparte de su efecto es mediado a través de la regulación de la síntesis deprostaglandinas en diversos procesos fisiológicos. Se ha determinado variaciones en la síntesis uterina de prostaglandinas y deóxido nítrico en la preñez temprana en la rata, y se ha establecido una relacióncausal entre ambos mecanismos fisiológicos durante la implantación embrionaria. En el útero dichos agentes vasoactivos aumentan durante los días peri-implantatoriosde la preñez, como resultado de la combinación de la acción de losesteroides ováricos y de agentes locales derivados del embrión o de la madre. Las isoformas Cab-dependiente y Cap-independiente de la enzima sintetizadorade óxido nítrico son las responsables del incremento en la actividad enzimática enel día de la implantación. La inhibición de la síntesis intraluminal de óxido nítricoreduce el número de embriones implantados en un 50%, probablemente alterandola adecuada irrigación sanguínea al sitio de implantación. También se determinóque la producción uterina de prostaglandina E y qu depende tanto de laproducción de óxido nítrico como de señales embrionarias tempranas. Nuestros resultados indican además, que la acción vasoactiva del óxido nítrico yde las prostaglandinas puede modularse de manera tal de compensaralteraciones metabólicas en la rata diabética de tipo no-insulino-dependiente, ypermitir que el proceso implantatorio ocurra eficientemente en esta patología. This thesis addresses the process of embryo implantation in control and diabeticrats focusing in the vasoactive changes it involves. We have established the roleof prostaglandins and nitric oxide. The first group of molecules is required to allowembryo implantation in the uterine lumen, by increasing uterine blood flow andvasodilatation during endometrial decidualization and by regulating the contractileactivity of the miometrial tissue. On the other hand, nitric oxide, a recognizedvasodilating and muscular relaxing agent, exerts part of its effects in severalphysiological processes by modulating prostaglandin synthesis. In the presentwork we have determined the existence of significant changes in the uterinesynthesis of prostaglandins and nitric oxide during the early pregnancy in the ratand we have established a causal relationship between both mechanisms duringthe embryonic implantation. The observed increase in the concentration of these vasoactive agents in theuterus takes places in the peri-implantation days, as a result of the combinedaction of ovarian steroids and local factors derived either from the embryo or thematernal tissue. Both the Cap-dependent and independent isoforms of the nitricoxide synthetase are responsible for the increase in enzymatic activity in theimplantation day. The relevant role played by nitric oxide is revealed by the factthat inhibition of uterine nitric oxide synthesis reduces the number of implantedembryos by 50%, probably because it alters the appropriate blood supply to theimplantation site. In addition, it was determined that the production ofprostaglandin E and an depends both on the production of nitric oxide and onearly embryonic signals. Our studies also indicate that the vasoactive effect of nitric oxide andprostaglandins is modified in the non-insulin dependent diabetic rat in such a wayas to compensate the metabolic alterations that this pathology involves, thusallowing an efficient embryo implantation. Fil: Novaro, Virginia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Este trabajo de Tesis se basa en una completa descripción del aparato genital masculino del sapo Bufo arenarum, desarrollando un modelo que permite el estudio dinámico de los procesos fisiológicos involucrados en la espermiación; a la vez que posibilita el análisis de los neuropéptidos expresados en el testículo y el espermatozoide del sapo. La expresión de neuropéptidos en las gónadas representa una forma posible de comunicación intercelular. La inervación peptidérgica presente en el testículo sugiere una regulación neural que, operando en coordinación con la conocida regulación hormonal, interactuaría con mecanismos de control autócrinos y parácrinos mediados por sustancias producidas localmente. En este sentido, la localización de los neuropéptidos en los espermatozoides sugiere distintos roles en la función espermática y su estudio permitirá entonces, profundizar el conocimiento del proceso de la fertilización. This Thesis is based on a complete description of the male genital tract of the toad Bufo arenarum, and involves the development of a dynamic method for the study of physiological processes related with spermiation, allowing the analysis of neuropeptides expressed in the testis and spermatozoa of the toad. A way of intercellular communication in the gonads could be represented by neuropeptide expression. The peptidergic innervation present in the testis suggests a neural regulation that coordinately operates with the well known hormonal one, and would interact with locally produced substances-mediated autocrine and paracrine control mechanisms. In this way, the localization of neuropeptides in the spermatozoa suggests different roles in the sperm function and its study would allow the further characterization of the fertilization process. Fil: Achi, María Verónica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Este trabajo se llevó a cabo con el fin de comprender mejor la neuroanatomía química del área preóptico-hipotalámica del sapo, y especialmente los mecanismos regulatorios involucrados en el control de varios de los múltiples mensajeros neuronales allí presentes. Se analizó la influencia de manipulaciones experimentales en la expresión de sustancias neuroactivas poniendo énfasis particular en las neuronas que contienen el péptido galanina. Por otra parte un objetivo central de este trabajo de tesis fue estudiar las variaciones en la expresión de estas sustancias en condiciones extremas como por ejemplo durante la lesión neuronal. This work was conducted in order to get a better understanding of the chemical neuroanatomy of the preoptic-hypothalamic region of the toad and the regulatory mechanisms involved in the expression of some neuronal transmitters in the area. We studied the influence of experimental manipulations in the immunoreactivity of several neuroactive substances, with a particular interest in galanin containing neurons. A special aim of this work was to investigate the differential expression of these molecules under extreme circumstances such as neuronal damage. Fil: González Nicolini, María Valeria. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Virtualmente todas las células de mamíferos están bajo la influencia del radical libre denominado óxido nítrico (NO). Las enzimas responsables de la síntesis del NO se conocen como óxido nítrico sintasas (NOS 6 NO-sintasas). En mamíferos, se han clonado tres isoenzimas de la NO-sintasa. Las isoformas neuronal y endotelial son dependientes de Ca++ y se expresan constitutivamente, mientras que la isoforma inducible es Ca++ independiente y se induce en presencia de lipopolisacáridos y citocinas. Todas las isoformas pertenecen a la farnilia de los citocromos P-450, utilizan L-arginina como sustrato, con oxígeno molecular y nicotinamida adenina dinucleótido fosfato forma reducida (NADPH) como co-sustratos. Las funciones del NO fueron descriptas primeramente en tres sistemas fisiológicos (vascular, nervioso e inmune) y a partir de dicho estudio se fueron descubriendo funciones del NO en otros sistemas como el reproductor, respiratorio y excretor. En reproducción, se vio que el NO induce la erección peniana, estimula al factor liberador de la hormona luteinizante (LH-RH) y modula la síntesis de prostaglandinas uterinas y ováricas durante la luteólisis en la rata. Sin embargo, hasta el momento no se había descripto la participación del NO en el proceso de fertilización. En el presente trabajo se presentan evidencias de la existencia de la enzima NO-sintasa en la gameta masculina murina y su participación en la fertilización in vitro. Mediante ensayos farmacológicos determinamos que la adición de inhibidores específicos de la NO-sintasa (NG-nitro-L-arginina (NO2-arg) ó NG-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME)) durante el proceso de capacitación in vitro disminuye el porcentaje de ovocitos fertilizados. Esta inhibición es estereoespecífica y depende de la concentración. Dado que el proceso de fertilización se encuentra afectado en presencia de L-NAME y NO2-arg, medimos la motilidad espermática y el patrón de hiperactivación. A los 120 min de incubación, el L-NAME disminuye el porcentaje de espermatozoides mótiles e hiperactivados, mientras que un generador de NO como el nitroprusiato de sodio (NP) acelera estos parámetros de manera concentración dependiente. Considerando que el NO también podía participar en la reacción acrosomal, medimos el efecto del L-NAME sobre espermatozoides reaccionados espontáneamente ó en presencia de un inductor fisiológico como la progesterona. En estos casos, la exocitosis acrosomal también se halla inhibida; la inhibición es estereoespecífica y depende de la concentración. Contrariamente, 0.1 mM de spermine-NONOate (generador de NO) estimula la reacción acrosomal en espermatozoides previamente capacitados a niveles semejantes a los obtenidos con 15 microM de progesterona. Luego de los ensayos farmacológicos, evidenciamos la presencia de la NO-sintasa espermática mediante ensayos inmunológicos. Por inmunofluorescencia indirecta localizamos la NO-sintasa en el acrosoma y en la cola de espermatozoides no capacitados. Durante la capacitación, la fluorescencia desaparece del acrosoma y se mantiene en el flagelo, otorgando a esta enzima un potencial significado fisiológico en el proceso de capacitación y/o de reacción acrosomal. Seguidamente, realizamos ensayos de Western Blot, los cuales nos permitieron demostrar que anticuerpos anti-NOS neuronal, endotelial e inducible reconocen una única fracción proteica de 140 kD bajo condiciones desnaturalizantes y no reductoras en espermatozoides frescos de ratón. Cuando realizamos los experimentos cinéticos, detectamos la presencia de formación de NO, medida como conversión de L-arginina a L-citrulina en espermatozoides intactos y vivos (condiciones in vivo). Los espermatozoides sintetizan NO durante el proceso de capacitación alcanzando un plateau a los 120- 180 min de incubación. Además, la producción de NO depende de la concentración de L-arginina presente en el medio de incubación y es inhibida por L-NAME pero no por aminoguanidina (inhibidor específico para la NO-sintasa de caracter inducible), sugiriendo la existencia de una NO-sintasa espermática de caracter constitutivo. Considerando que en los ensayos farmacológicos evidenciamos la participación de la NO-sintasa del espermatozoide en la exocitosis acrosomal inducida por progesterona, se estudió también la modulación de este esteroide sobre la formación de NO en espermatozoides capacitados. Así, observamos que 15 microM de progesterona estimula directamente la síntesis de NO durante el período ensayado (90-120 min). Basándonos en trabajos realizados en nuestro laboratorio intentamos relacionar al NO con la síntesis de prostaglandinas e hidroxiácidos. Para ello, en primer término, demostramos que los espermatozoides de ratón son capaces de sintetizar PGE2 e hidroxiácido 5-HETE y luego observamos que el NP estimula la síntesis de estos metabolitos en la gameta masculina. Sin embargo, la síntesis basal de prostaglandinas no se ve modificada en presencia de L-NAME. Los resultados de este trabajo evidencian por primera vez la presencia de la NO-sintasa en el espermatozoide de ratón y demuestran su participación en el proceso de fertilización, modulando la motilidad espermática y la exocitosis acrosomal. Podemos afirmar entonces, que el NO sintetizado por la NO-sintasa espermática, es necesario para que el espermatozoide pueda expresar su plena capacidad fertilizante in vitro. Mammalian cells are all virtually exposed to the action of nitric oxide (NO). Nitric oxide synthases (NOS or NO-synthases) are the enzymes that catalyze the production of NO. Three distinct isoforms of NO-synthase have been cloned in mammals. The neuronal and the endothelial isoforms are Ca++-dependenat nd are constitutively expressed while the inducible isoform does not depend on Ca"' and is induced with bacterial products and cytokines. NO actions have been previously described in the vascular, the nervous and the immune systems. However, many other fbnctions are being shown in the reproductive, the respiratory and the urinary systems. In the reproductive field, it was found that NO induces penis erection, stimulates LH-RH factor and modulates prostaglandins synthesis in the rat uterus. Nevertheless, till now it was not described the role of NO in the fertilization process. Our results show that NO-synthase inhibitors (NO-nitro-L-arginina (NO,-arg) 6 No-nitro- L--arginina meti1 kster (L-NAME)) added at the onset of capacitation reduce the percentage of f e e d oocytes. This inhibition is stereospecific and depends on the concentration. Moreover, we demonstrate that L-NAME reduces the percentage of motile and hyperactivated spermatozoa at 120 min of incubation, while a nitric oxide donor named sodium nitroprusside (NP) accelerates hyperactivation in a concentration manner. We were then interested in searching the effect of NO-syntahse inhibitors on the spontaneous and progesterone-induced acrosome reaction. In these cases, the acrosomal exocytosis is inhibited, the inhibition is stereospecific and depends on the concentration. In contrast, 0.1 mM spermine-NONOate (NO donor) stimulates the progesterone-induced acrosome reaction. Then, we evidence the presence of sperm NO-synthase by immunological assays. Thus, we localized NO-synthase in the acrosome and tail of non capacitated mouse spermatozoa by the immunofluorescence technique. During capacitation the fluorescence disappears in the acrosome and it persists in the tail. Besides, under denaturing and non reducing conditions, Western Blot analysis of solubilized sperm proteins reveal a unique band of Mr=140 kD with the three NO-synthase antisera tested (neuronal, endothelial and inducible isoforms). By means of kinetics assays, we detect the production of NO by intact spermatozoa (in vivo conditions). During the capacitation period (120 min), lo7 spermatozoa are capable to synthesize 7*2 picomoles of NO. Besides, NO formation depends on the incubation periodand on the concentration of L-arginine present in the incubation medium. Different concentrations of L-NAME but not aminoguanidine, inhibit L-['JC]citrulline formation, suggesting that sperm NO-synthase is a constitutive isoform. In the pharmacological assays, we demonstrated that NO-synthase may be involved in the progesterone-induced acrosome reaction; so we studied the effect of this steroid on the production of NO by capacitated sperm. In this set of experiments we show that 15 pM progesterone stimulates NO formation in spermatozoa. Based on studies done in our laboratory, we finally intend to relate NO to prostaglandins and hydroxyacids synthesis. We first demonstrate that mouse spermatozoa synthesize PGE, and 5-HETE and that these synthesis are stimulated by NP. However, L-NAME does not inhibit these basal synthesis. The results presented here evidence for the first time the presence of NO-synthase in the murine male gamete and the role of this enzyme in the fertilization process: sperm NO-synthase modulates sperm motility and the acrosomal exocytosis. So, we can say that NO, synthesized by sperm NO-synthase is necessary for spermatozoa to express its full fertilizing ability. Fil: Herrero, María Belén. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.