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La tesis se centra en la caracterización taxonómica, estudio del grado de virulencia y de factores celulares y extracelulares asociados con la patogenicidad de cepas de Aeromonas salmonicida aisladas de peces salmónidos y no salmónidos. Se han desarrollado herramientas y técnicas para el estudio de la respuesta inmune de los peces frente a la infección y a la inmunización y se ha valorado la eficacia de la vacunación frente a la forunculosis en el grado de protección de los peces y en varios parámetros del sistema inmune innato y adquirido.

Aeromonas salmonicida y Yersinia ruckeri son bacterias patógenas de Trucha arcoíris; su detección temprana mediante el uso de pruebas de diagnóstico es fundamental para evitar la propagación bacteriana y la mortalidad excesiva en los sistemas de producción. Sin embargo, el uso de pruebas de diagnóstico no se realiza debido a que son costosas, requieren de laboratorios sofisticados y se realizan en ciudades alejadas de los centros de producción. Por ello, este trabajo tuvo como objetivo estandarizar la técnica de Amplificación Isotérmica Mediada por Bucle (LAMP), una prueba de diagnóstico molecular rápido altamente sensible y de bajo costo, para detectar simultáneamente A. salmonicida y Y. ruckeri en cepas aisladas de Trucha arcoíris. Se diseñó primers LAMP para la detección de A. salmonicida y Y. ruckeri mediante los genes vapA y rucC-rupB, respectivamente. Se elaboró un protocolo LAMP DÚPLEX corrido a 60°C durante 60 min y detenido a 80°C por 10 min. Los primers fueron específicos para A. salmonicida y Y. ruckeri, no observándose reacciones cruzadas con Aeromonas hydrophila, Virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa, Flavobacterium psychrophilum, Renibacterium salmoninarum, especies relacionadas con enfermedades infecciosas de Trucha arcoíris. Además, de Staphylococcus aureus, Echerenchia coli, Pseudomonas aeruginosa y Yersinia enterocolítica, especies bacterianas relacionadas con la contaminación ambiental y de manipulación. Finalmente, la sensibilidad analítica de LAMP fue superior a la técnica gold estándar PCR. Aeromonas salmonicida and Yersinia ruckeri are pathogenic bacteria of rainbow trout; Its early detection through the use of diagnostic tests is essential to avoid bacterial spread and excessive mortality in production systems. However, the use of diagnostic tests are not implements because they are expensive, require sophisticated laboratories and are carried out in cities far from production centers. Therefore, this work aimed to standardize the Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) technique, a highly sensitive and inexpensive rapid molecular diagnostic test, to simultaneously detect A. salmonicida and Y. ruckeri in isolated strains of rainbow trout. LAMP primers were designed for the detection of A. salmonicida and Y. ruckeri through the vapA and rucC-rupB genes, respectively. A LAMP DUPLEX protocol was developed, running at 60°C for 60 min and stopped at 80°C for 10 min. The primers were specific for A. salmonicida and Y. ruckeri, not observing cross-reactions with Aeromonas hydrophila, Infectious Pancreatic Necrosis Virus, Flavobacterium psychrophilum, Renibacterium salmoninarum, species related to infectious diseases of rainbow trout. In addition, Staphylococcus aureus, Echerenchia coli, Pseudomonas aeruginosa and Yersinia enterocolitica, bacterial species related to environmental contamination and handling. Finally, the analytical sensitivity of LAMP was superior to the gold standard PCR technique.

El cultivo de trucha arcoíris Oncorhynchus mykiss es afectado por el patógeno Aeromonas salmonicida, responsable de los brotes de furunculosis, una de las enfermedades más prevalentes en la truchicultura peruana. En el presente estudio se identificó la presencia de genes asociados a la virulencia, cromosomales y plasmídicos, en 34 cepas patogénicas, confirmados bioquímica y molecularmente como A. salmonicida, procedentes de cuatro regiones del Perú: Junín, Cajamarca, Ancash y Puno. De los ocho genes analizados, se detectó la presencia de seis con un patrón muy variado. Las 34 cepas analizados fueron positivos para los genes cromosomales, siendo el gen vapA (94%) el más frecuente, seguido de los genes satA (75%) y ahe2 (65%). Los genes plasmídicos fueron los menos frecuentes (ascV, aopH y aopO con 35%, 29%, 35%, respectivamente). Se encontró 6 perfiles genéticos en relación con la presencia de genes de virulencia, lo cual permite sugerir la plasticidad genómica de este patógeno, aunque otros factores también pudieron haber influenciado en la heterogeneidad de los datos obtenidos. Los perfiles genéticos permitieron establecer el patotipo vapA+, satA+, ahe2+ ascV+, aopH+ y aopO+ que podría estar afectando el cultivo de trucha arcoíris. Los resultados muestran que las cepas de A. salmonicida en la acuicultura peruana presentan locus genéticos que codifican para los principales factores de virulencia: capa A, proteasas, lipasas y el sistema de secreción tipo 3.

En la actualidad, el uso inadecuado de los antibióticos ha favorecido el incremento de la resistencia antimicrobiana de Aeromonas salmonicida, microorganismo que frecuentemente afecta el cultivo de la trucha arcoíris. En el presente estudio se ha identificado bioquímica y molecularmente A. salmonicida, aisladas de truchas arcoíris (Oncorhynchus mykiss) procedentes de cuatro Regiones de la Sierra del Perú. A continuación, se determinó el perfil de susceptibilidad antibiótica e identificó por PCR los genes de resistencia antimicrobiana. De los 28 aislados obtenidos, algunos mostraron baja susceptibilidad (tipo no salvaje - NWT) frente a amoxicilina (96%), oxitetraciclina (64%), ácido oxolínico (57%), destacándose el perfil no salvaje amoxicilina- ácido oxolínico- oxitetraciclina (43%), indicativo de multidrogo-resistencia (MDR). Los genes sul1 y tetA fueron identificados en el 6.6% (2/30) y 3.3% (1/30) de los aislados, respectivamente. Además, el secuenciamiento del gen gyrA, permitió confirmar la presencia de mutaciones en los codones 83 y 92 de la Región Determinante de Resistencia a Quinolonas (QRDR), sugiriendo su participación en los fenotipos no salvajes identificados frente a este antimicrobiano. Los resultados muestran que los aislados de A. salmonicida obtenidos presentan perfiles de resistencia comparables a los de otros países lo cual debe afectar el éxito terapéutico frente a este patógeno.

La acuicultura es uno de los sectores de producción de alimento de más rápido crecimiento que provee actualmente casi la mitad de todo el pescado para consumo humano. Con la acuicultura intensiva en expansión a nivel mundial, los riegos asociados a la aparición y transmisión de bacterias patógenas aumentan. Un probiótico para acuicultura es un suplemento microbiano vivo que proporcionado a través de la dieta o en el agua beneficia la condición de los peces modificando la flora asociada a los mismos y al ambiente, mejorando el valor nutricional de los alimentos, la respuesta inmunológica de los peces, la eficiencia reproductiva, y la calidad del agua y del ambiente que los rodea. El objetivo de esta Tesis fue aislar cepas bacterianas autóctonas de ambientes acuáticos de la región patagónica y estudiar sus propiedades probióticas in vitroe in vivo, para evaluar su potencial utilidad en acuicultura. A partir de muestras del tracto gastrointestinal de organismos acuáticos de Patagonia se obtuvieron 149 aislamientos. Utilizando la técnicade la doble capa, se detectaron 58 aislamientos con actividad antimicrobiana contra alguno de los patógenos indicadores Aeromonas salmonicidasubsp. salmonicida, Lactococcus garvieae, Yersinia ruckeri yCarnobacterium piscicola. De dichos aislamientos, las únicas cepas cuya actividad antimicrobiana fue del tipo extracelular fueron T4, T15 y M5, y sólo contra C. piscicola. Estas cepas correspondieron al género Carnobacterium(99,93% homología en la secuencia del gen ARNr 16S con Carnobacterium maltaromaticumDSM 20345(T)). Además, se sumó al estudio la cepa H16,previamente aislada y parcialmente caracterizada, conactividad antimicrobiana extracelular contra A. salmonicida subsp. salmoniciday V. alginolyticus. La secuencia del gen ARNr 16S de H16 mostró 100% de homología con la de Lactobacillus pentosusJCM 1558(T). Carnobacteriumsp. T4, Carnobacteriumsp. T15, Carnobacteriumsp. M5 y Lactobacillus pentosusH16 mostraron baja resistencia a los antibióticos y ausencia de actividad hemolítica, las cuales son características positivas en cuanto a la seguridad microbiológica de estas cepas. La actividad antimicrobiana contra V. alginolyticusy A. salmonicidasubsp. salmonicidapresentada por H16 estuvo asociada con la producción de ácidos orgánicos. En cambio,la actividad antimicrobiana presentada por las cepas T4, T15 y M5 contra C. piscicolafue causada por la producción de bacteriocinas.Debido a la producción temprana del agente antimicrobiano y a su mayor título de inhibición, T4 fue elegida entre las cepas del género Carnobacteriumpara continuar los estudios. Así, las propiedades probióticas de T4, H16 y Lactococcus lactisTW34 (una cepa proveniente de la colección del laboratorio) fueron evaluadas en ensayos in vitroe in vivo. T4, H16 y TW34 mostraron tolerancia a la bilis de trucha arco iris (TAI) y resistencia a pH ácido, sugiriendo que podrían adaptarse a las condiciones del tracto digestivo de los peces. Además, las tres cepas fueron capaces de adherirse al mucus de TAI. La capacidad de adhesión al mucus es una condición favorable para posibilitar la colonización del intestino del pez. En particular, H16 fue capaz de inhibir la adhesión de V. alginolyticusy A. salmonicidasubsp. salmonicidaal mucus de TAI, bioencapsularse en nauplios de Artemia franciscanay protegerlos de la infección con V. alginolyticus. Estos resultados sugieren que H16 se podría administrar a través de portadores vivos, por ejemplo, en el cultivo de larvas. En ensayos in vivoutilizando el pez cebra como modelo, después de 14 días de administración de T4, H16 o TW34, los recuentos de bacterias totales disminuyeron en el intestino de los peces probablemente a expensas de las enterobacterias y Vibrio spp. que disminuyeron en promedio un orden y medio orden de magnitud, respectivamente. En cambio, las bacterias ácido lácticas (BAL) aumentaron aproximadamente dos órdenes de magnitud en los tres grupos tratados. T4 y TW34 se recuperaron del intestino sólo durante su administración mientras que H16 se recuperó 48 h después de la suspensión de su administración, con una abundancia similar a los valores registrados en el período de administración. Esto demostraría la capacidad de colonización del intestino del pez cebra de H16. En ensayos de crecimiento del pez cebra, también los recuentos de BAL en el intestino de los peces cebra fueron mayores y los de Vibriospp. y enterobacterias menores que los del grupo control sin probiótico, luego de 90 días de tratamiento con T4, H16 o TW34. A su vez, el peso corporal promedio de los peces en los tratamientos con T4 o H16 fue significativamente mayor que en el control. Particularmente, los peces tratados con H16 presentaron una mayor tasa de crecimientoespecífica, un mejor factor de condición y un menor factor de conversión del alimento, comparadocon el control. Así, el presente estudio demostró que existen microorganismos en los ambientes acuáticos de la región patagónica que cumplen con los criterios de selección de probióticos. Además, las cepas T4, H16 y TW34 lograron modificar la microbiota intestinal del pez cebra, promoviendo la población beneficiosa de BAL y disminuyendo otros grupos bacterianos conocidos por incluir patógenos oportunistas. La evaluación in vivodemostró que las cepas L. pentosusH16 y Carnobacteriumsp. T4 tuvieron efectospositivos sobre el crecimiento del pez cebra. Por lo tanto, estas cepas son prometedoras para futuros estudios de desarrollo de alimentos probióticos para acuicultura. Fil: Garcés, Marisa Elisabeth. Universidad Nacional del Comahue. Centro Regional Universitario Bariloche; Argentina.

Resumen Objetivos: Las Aeromonas salmonicida son bacilos gram-negativos, anaerobios facultativos, normales en medios ambientes acuáticos y en suelos, identificadas como agentes patógenos en animales poiquilotermos y homeotermos. Los cambios climáticos y la alta contaminación del agua han aumentado probablemente las bacterias en el medio ambiente e incrementado la casuística en las producciones piscícolas comerciales e intensivas, generando altas mortalidades y pérdidas económicas considerables, razón por la cual es importante identificar el agente patógeno por medio de los diferentes métodos diagnósticos. Resultados: El tratamiento a instaurar debe contemplar un manejo integral del medio acuático, contemplar métodos alternativos como la herbolaria medicinal o fitoterapia de plantas de uso común y de fácil acceso, económicos y biodegradables. Conclusiones: Se reporta por primera vez esta bacteria en la Estación Piscícola Caldas, coincidiendo con los cambios ecológicos y climáticos sufridos como factores predisponentes. Abstract Objetives: Aeromonas salmonicida are gram-negative bacilli, facultative anaerobes, normal in aquatic environments and in soils, identifi ed as pathogenic agents in poikilotherms and homeotherms. Climate changes and high-water pollution have probably increased the bacteria in the environment, increasing the casuistic in commercial and intensive fi sh production, thus generating high mortality and considerable economic losses, which is why it is important to identify the pathogen through diff erent diagnostic methods. Results: Th e treatment to be established must contemplate a comprehensive management of the aquatic environment, contemplate alternative methods such as medical herbalism or fi toterapia of plants of common use and easy access, economic and biodegradable. Conclusions: Th is bacterium is reported for the fi rst time in the Caldas Fish Station, coinciding with the ecological and climatic changes suff ered as predisposing factors. Key words: Aeromonadaceae, Aeromonas salmonicida, tilapia, cichlidae, fi sh farming.

The success of the methods employed in the detection of Aeromonas salmonicida depends on several factors including detection limits which are not always considered when planning a diagnostic protocol. First, detection limits of A. salmonicida by Coomassie Brilliant Blue Agar (CBBA) culture, Immuno-Fluorescence Antibody Test (IFAT), Coagglutination test (CoAgT) and Polymerase Chain Reaction (PCR) were analyzed, then a controlled wet-lab experiment was conducted using 60 masu salmon (Oncorhynchus masou) fry inoculated with A. salmonicida and based on the results obtained, an epizootiological survey of selected rivers in Hokkaido was then conducted. Detection limits were 10^2 for CBBA, 10^4 for the IFAT, 10^5 for PCR and 10^3 for the CoAgT from an original de A. salmonicida broth culture of 1.3 x 10^8 CFU/mL demonstrating that CBBA and the CoAgT were better at detecting the bacteria at low concentrations. The wet-lab analysis produced results of detection limits of a similar trend, with CBBA, IFAT, PCR and CoAgT at 10^-3, 10^-3, 10^-1 and 10^-3 from kidney samples of 9.9 X 10^4 CFU/g respectively. The results from the epizootiological survey in Hokkaido showed positive from CBBA with IFAT, CoAgT and PCR corroborating them in varying degrees thus demonstrating the importance of a multi-diagnostic approach in scenarios of this nature.

[Resumen] Los sideróforos, pequeñas biomoléculas sintetizadas por algunos microorganismos para captar hierro del medio, constituyen una herramienta importante en la lucha contra bacterias patógenas. El presente Trabajo de Fin de Grado está enfocado en la síntesis y caracterización de intermedios sintéticos clave en la obtención del sideróforo acinetobactina, producido por la bacteria patógena de peces Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida. En base a esto, se propone para la síntesis de dicho sideróforo la obtención de dos intermedios clave (Fragmentos A y B) de acuerdo con lo mostrado en el Esquema 1. En la primera parte de esta memoria se estudia la preparación del fragmento A a partir de histamina comercial mediante halogenación y posterior sustitución nucleófila con una amina protegida. La segunda parte del trabajo se centra en la obtención del compuesto 3, precursor del fragmento B, mediante el acoplamiento de derivados protegidos del ácido 2,3- dihidroxibenzoico y el aminoácido L-treonina. La caracterización de los productos sintetizados se lleva a cabo mediante resonancia magnética de protón y carbono y espectrometría de masas ESI positiva de alta y baja resolución. [Abstract] Siderophores, small biomolecules produced for microorganism in lack of iron, are important agents against pathogenic bacteria. The work reported herein deals with the preparation of some key advanced synthetic intermediates on the synthesis of the siderophore acinetobactin, from fish pathogen Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida. The siderophore above mentioned could be obtain from two synthetic intermediates (Fragments A and B) as is reported in Scheme A. The first part of this work deals with preparation of fragment A from histamine by halogenation and subsequent nucleophilic substitution with a protected amine. The second part of this work focuses on the preparation of a precursor of fragment B, compound 3, by a coupling reaction between protected derivatives of 2,3-dihydroxybenzoic acid and L-threonine. Characterization of the synthetized compounds is carry out by magnetic resonance techniques. Also products are characterized by mass spectroscopy of high and low resolution. [Resumo] Os sideróforos, pequenas biomoléculas sintetizadas por algúns microorganismos para captar ferro do medio, constitúen una importante arma na loita contra bacterias patóxenas. O presente Traballo de Fin de Grao céntrase na sínteses e caracterización de intermedios sintéticos clave na obtención do sideróforo acinetobactina, producido pola bacteria patóxena de peces Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida. En base a isto, proponse para a sínteses do citado sideróforo a obtención de dous intermedios clave (Fragmentos A e B) según o disposto no Esquema 2. Na primeira parte de esta memoria estúdase a preparación do fragmento A partindo de histamina comercial mediante haloxenación e posterior sustitución nucleófila cunha amina protexida. A segunda parte do traballo céntrase na obtención do composto 3, precursor do fragmento B, mediante o acoplamento de derivados protexidos do ácido 2,3-dihidroxibenzoico e o aminoácido L-treonina. A caracterización dos produtos sintetizados lévase a cabo mediante resonancia magnética de protón e carbono e espectrometría de masas ESI positiva de alta e baixa resolución. Traballo fin de grao (UDC.CIE). Química. Curso 2013/2014

El objetivo principal de este estudio es estandarizar las metodologías de ensayos de susceptibilidad a agentes antimicrobianos de especies bacterianas patógenas de salmónidos presentes en la salmonicultura chilena. Unpublished