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El citoesqueleto es una red compleja y dinámica, formada por biopolímeros interconectados - microtúbulos, actina y filamentos intermedios (IFS)- que, entre otras funciones, están involucrados en la determinación de la morfología celular y la generación y transmisión de fuerzas. Tradicionalmente, se ha considerado que los IFs sólo contribuyen pasivamente a la viscoelasticidad celular; sin embargo, en los últimos años, diversos trabajos han mostrado que estos filamentos presentan roles muy activos en una gran variedad de procesos biológicos. El objetivo central de esta tesis fue estudiar, en células vivas, ciertas propiedades mecánicas de los filamentos intermedios de vimentina relevantes a su función biológica. Para ello combinamos microscopías confocal y de superresolución con una rutina que permite recuperar las coordenadas espaciales de filamentos individuales con precisión nanométrica. El análisis de las formas de los filamentos, basado en la descomposición en modos de Fourier, muestra que las curvaturas de los IFS en células vivas presentan un comportamiento símil térmico caracterizado por una longitud de persistencia aparente (Ip*) similar a las reportadas en experimentos in vitro. Adicionalmente, hemos determinado que perturbaciones a las redes de actina o microtúbulos alteran la lp* y la movilidad de los IFs. Estos resultados aportan datos relevantes sobre el acoplamiento mecánico entre los IFs con las otras redes del citoesqueleto. Trabajos recientes han planteado diferencias funcionales entre la red de vimentina perinuclear y la red periférica. Mientras la primera conforma una jaula que protegería mecánicamente al núcleo, la segunda estaría principalmente asociada a la integridad mecánica del citoesqueleto. En este contexto evaluamos propiedades biofísicas en ambas poblaciones de filamentos utilizando la novedosa técnica de superresolución MoNaLISA. Observamos que los filamentos periféricos están caracterizados por una mayor Ip*, y por ende una mayor rigidez flexural, y que su movilidad se encuentra restringida en mayor proporción que los perinucleares, apoyando la hipótesis de una asociación diferencial con microtúbulos y filamentos de actina en sendas regiones celulares. Los resultados obtenidos en esta tesis apoyan la existencia de un acoplamiento mecánico entre la red de vimentina y las redes de actina y microtúbulos que le permite responder activamente para compensar, de forma parcial, las perturbaciones mecánicas generadas en el citoesqueleto o transmitidas desde el exterior celular. The cytoskeleton is a complex and dynamical network formed by crosslinked biopolymers - microtubules, actin and intermediate filaments (IFS) - which, among other functions, is intimately involved in the definition of the cell morphology and in force generation and transmission. Typically, IFs were only considered to contribute passively to the cell viscoelasticity; nevertheless, in the last years, many works have shown that these filaments have key active roles in a great variety of biological processes. We explored relevant biophysical properties of the IFS, combining confocal and super-resolution microscopies with a routine that allows the recovery of spatial coordinates from individual filaments with nanometer precision. The analysis of filaments' shapes, based on Fourier decompositions, show that IFS curvatures in live cells have a thermal behaviour, characterized by an apparent persistence length (Ip*) similar to that obtained in in-vitro preparations. Additionally, we have determined that perturbing the actin or microtubules networks modify the Ip* and the mobility of the IFs. These results provide relevant data on the mechanical coupling between IFs with the other cytoskeleton networks. Recent works have stated functional differences between the perinuclear vimentin network and the peripheral network. While the first one makes a cage that would protect mechanically the nucleus, the latter would be mainly associated to the mechanical integrity of the cytoskeleton. In this context we evaluated biophysical properties in both filaments' populations utilizing the novel technique of super-resolution MoNaLISA. We observed that peripheric filaments are characterized by a larger Ip*, which means a larger flexural rigidity, and its mobility is restricted in larger proportion respect to perinuclear ones, supporting the hypothesis of a differential association with microtubules and actin filaments in both cell regions. The results obtained in this thesis support a model in which the vimentin network is mechanically coupled with the actin and microtubules network, which allows this network to actively respond to compensate, partially, the mechanical perturbations generated in the cytoskeleton or transmitted from the exterior. Fil: Smoler, Mariano. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Objetivos: Valorar la importancia de las modificaciones que aparecen en el citoesqueleto celular (en particular a nivel de unos filamentos intermedios denominados queratinas) a lo largo de los cambios que sufre la glándula mamaria, con especial referencia a la lactación. Su expresión será diferente y servirá como método de contraste. Diseño: 40 ratones distribuidos en cinco grupos según la etapa de estudio. El esquema experimental es común para todos ellos. Material y métodos: Análisis inmunohistoquímico de las muestras procedentes de las glándulas mamarias para evidenciar modificaciones a nivel de las citoqueratinas y comparación con otros estudios en diferentes modelos animales. Resultados: Cada citoqueratina presenta una expresión diferente según sea la estirpe celular y el periodo de lactación. Se diferencian mediante el uso de anticuerpos específicos marcados. Conclusiones: La expresión citoqueratínica varía de manera fisiológica y en células tumorales. La detección inmunohistoquímica de citoqueratinas puede servir como método de diagnóstico complementario. Objectives: To assess the importance of the changes that appear into the cytoskeleton (especially referred to some specific intermediate filaments called keratins) through different stages the mammary gland bears, focusing on the lactation. Their expression will be different in pathological conditions and this will be useful for contrasting other procedures. Design: 40 mice distributed into five groups according to the stage of study. The experimental project is the same for everyone. Material and methods: Immunohistochemical analysis from samples obtained from mammary glands in order to show changes into cytokeratin expression and comparison with other researches in different animal models. Results: The expression of every cytokeratin is different according to the cell lineage and the lactation period. Specific antibodies can reveal it. Conclusions: The cytokeratinic pattern changes in a physiological sense and also in malignant processes. Immunohistochemical detection of cytokeratins may be useful as complementary diagnosis.

6 páginas, 6 figuras, 2 tablas., [EN] To assess the importance of the changes that appear into the cytoskeleton (especially referred to some specific intermediate filaments called keratins) through different stages the mammary gland bears, focusing on the lactation. Their expression will be different in pathological conditions and this will be useful for contrasting other procedures. Design: 40 mice distributed into five groups according to the stage of study. The experimental project is the same for everyone. Material and methods: Immunohistochemical analysis from samples obtained from mammary glands in order to show changes into cytokeratin expression and comparison with other researches in different animal models. Results: The expression of every cytokeratin is different according to the cell lineage and the lactation period. Specific antibodies can reveal it. Conclusions: The cytokeratinic pattern changes in a physiological sense and also in malignant processes. Immunohistochemical detection of cytokeratins may be useful as complementary diagnosis., [ES] Valorar la importancia de las modificaciones que aparecen en el citoesqueleto celular (en particular a nivel de filamentos intermedios denominados queratinas) a lo largo de los cambios que sufre la glándula mamaria, con especial referencia a la lactación. Su expresión será diferente y servirá como método de contraste. Diseño: 40 ratones distribuidos en cinco grupos según la etapa de estudio. El esquema experimental es común para todos ellos. Material y métodos: Análisis inmunohistoquímico de las muestras procedentes de las glándulas mamarias para evidenciar modificaciones a nivel de las citoqueratinas y comparación con otros estudios en diferentes modelos animales. Resultados: Cada citoqueratina presenta una expresión diferente según sea la estirpe celular y el periodo de lactación. Se diferencian mediante el uso de anticuerpos específicos marcados. Conclusiones: La expresión citoqueratínica varía de manera fisiológica y en células tumorales. La detección inmunohistoquímica de citoqueratinas puede servir como método de diagnóstico complementario.

Utilizando la técnica de inmunoperoxidasa y un panel de anticuerpos monoclonales, se realizó un estudio para caracterizar la expresión de citoqueratinas y vimentina, proteínas constituyentes de los filamentos intermedios, en los tejidos en diferenciación de embriones de cerdo y bovino, en diferentes etapas de la embriogénesis. Ambas especies presentaron características similares en la expresión de citoqueratinas y vimentina. En los embriones prefetales, mayores de 18 mm de longitud cráneo-caudal, ya existe un patrón de citoqueratinas en la mayoría de las células epiteliales, ya que éstas se tiñeron intensamente con los anticuerpos antiqueratinas AE1/AE3 y AE1. En embriones menores, sólo reaccionaron moderadamente con estos anticuerpos, el mesonefros, tubo digestivo y epitelio celómico. La vimentina aparece en embriones más pequeños en el endotelio vascular, en el mesonefros y en algunas células conectivas y del tubo neural. En embriones mayores, además, aparece inmunotinción con este anticuerpo, en el endocardio, dermis, plexos coroídeos, osteoblastos y odontoblastos. La citoqueratina 18 y los controles negativos de las inmunotinciones empleadas, no mostraron reacción positiva en ninguna de las estructuras embrionarias de ambas especies. Nuestros resultados enfatizan la importancia de los filamentos intermedios, especialmente de las citoqueratinas, como marcadores de diferenciación de los tejidos embrionarios y sugieren que en aquellos órganos que comienzan a funcionar tempranamente en el embrión, como el mesonefros y la red vascular, el citoesqueleto se organiza más tempranamente Using immunoperoxidase technique, an established panel of antibodies was used to characterise the cytokeratin and vimentin intermediate filaments profile of tissues from bovine and pig embryos, in different stages of development. Both species presented similar characteristics in cytokeratin and vimentin expression. In prefetal embryos, a pattern of keratin is established in most of the epithelial cells. These epithelial cells were intensely stained with the antikeratin antibodies AE1/AE3 and AE1. In embryos smaller than 18 mm crown-rump length, there was only a weak immunoreaction with these antibodies in the mesonephros, in the intestinal tract and, in the coelomic epithelium. In these embryos, the immunostain with antivimentin antibody was positive only in vascular endothelium, in the mesonephros and, in some mesenchymal cells. No histological tissues were positive to the antikeratin 18 antibody in both species, at the stages studied. No positive staining was observed in the negative controls of immunostains for different antibodies employed in this work. The different pattern of cytokeratins are related to the degree of differentiation of immature epithelial cells. Our results emphasizes the importance of intermediate filaments, mainly cytokeratins, as useful markers of embryonic tissue differentiation, and suggest that in those organs that begin their function early in development, like the mesonephros and vascular system, the cytoskeleton organizes earlier in the embryonic life.

Keratins are intermediate filaments of the cytoskeleton of epithelial cells. They express themselves in simple (Ks. 7, 8, 18, 19 y 20) or stratitified epithelia (Ks. 1, 2, 5, 9, 10, 11, 16). The different expression of these multigenic cytoskeletal proteins is related to cell specific differentiation programs (OSBORN & WEBER, 1983; NAGLE, 1988); For these reasons the analysis of keratins are very relevant for the study of new aspects of histology, histopathology and developmental biology. Moreover, evaluation of keratins by immunofluorescent or immunohistochemistry is useful for the proper identification and characterization of normal, displasic and neoplasic cells (OSBORN & WEBER, 1983; NAGLE). The different patterns of expression of keratins are related to the degree of differentiation of inmature epithelial cells, as well as the degree of differentiation of malignant tumours (FUCHS & GREEN, 1980; FRANKE et al., 1981b; MOLL et al, 1892a; SCHAAFSMA & RAMAEKERS, 1994). Lastly, evaluation of the changes of immunoexpresion of keratins is useful for the differential diagnosis between typical and atypical squamous metaplasia, including moderate and severe epithelial displasia and intraepithelial neoplasia -formerly known as carcinoma in situ- (MOLL et al., 1982a; TSENG et al., 1982; QUINLAN et al., 1985; HUSZAR et al., 1986; GIGI-LEITNER et al; HEID et al.,1988)

RESUMEN: Utilizando la tecnica de inmunoperoxidasa y un panel de anticuerpos monoclonales, se realizo un estudio para caracterizar la expresion de citoqueratinas (CK) constituyentes de los filamentos intermedios, en el epitelio de la mucosa gingival humana y de raton. El epitelio que reviste la encia humana varia de ortoqueratinizado a paraqueratinizado y no cornificado, predominando el paraqueratinizado. Este epitelio se caracteriza por un estrato corneo con nucleos picnoticos y un estrato granuloso pobremente definido. La expresion de citoqueratinas es ligeramente diferente del ortoqueratinizado. El epitelio gingival ortoqueratinizado se caracteriza por la presencia de CK 1 - 10, queratinas especificas de la diferenciacion tipo epidermis. En cambio el epitelio gingival no queratinizado se diferencia del queratinizado porque todas sus celulas suprabasales contienen las CK tipo esofago 13 y 14, pero no las de tipo epidermis. Todas las capas celulares de estos epitelios reaccionan negativamente con los anticuerpos anti CK 18 y 19. El epitelio gingival de raton es principalmente ortoqueratinizado y muestra un patron de expresion de citoqueratinas similar a este tipo de epitelios. Existen diferencias notorias en la expresion de citoqueratinas en el epitelio gingival, que estan relacionadas con el grado de queratinizacion que puede ser comprobado histologicamente. Las citoqueratinas siguen siendo los mejores marcadores de la diferenciacion epitelial en la cavidad oral.