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[ES] RESUMEN: -INTRODUCCIÓN: La Discinesia Ciliar Primaria (DCP) es una enfermedad rara respiratoria con una prevalencia de 1/20000. Es una condición hereditaria y permanente causada por defectos congénitos en la ultraestructura de los cilios. Se manifiesta causando un funcionamiento deficiente del sistema de aclaramiento mucociliar, generando congestión nasal, tos, otitis o en casos más graves problemas pulmonares como las bronquiectasias. Se trata de una enfermedad con un diagnóstico tardío e infradiagnosticada por lo que actualmente se buscan nuevas técnicas para el estudio de la enfermedad. Es por ello por lo que un cultivo en interfaz Aire-Líquido (ALI) permite generar condiciones más similares a las fisiológicas, utilizándose como modelo para el estudio de la DCP. Sin embargo, las células están sometidas a un equilibrio sustancias oxidantes-sustancias antioxidantes, que puede verse alterado por los cambios en las condiciones del cultivo ALI, generando una situación de estrés oxidativo. -MÉTODOS: Establecimiento de un modelo celular para la investigación de la DCP mediante la técnica de cultivo ALI de células epiteliales nasales obtenidas del cornete nasal medio de un individuo sano. Este cultivo permite la diferenciación celular logrando así el desarrollo de un epitelio pseudoestratificado. En segundo lugar, se llevó a cabo, mediante RT-qPCR, el análisis de la expresión de diversos genes del sistema antioxidante en las diferentes etapas del cultivo ALI. -RESULTADOS: El cultivo se alcanzó con éxito, caracterizado por la presencia de células ciliadas generadoras de movimiento. Asimismo, las células en general en el cultivo, están sometidas a un mayor estrés oxidativo cuando se encuentran totalmente sumergidas, es decir, en la etapa de crecimiento y proliferación. -CONCLUSIÓN: Los resultados obtenidos en este trabajo indican que ha sido posible, la puesta a punto en nuestro laboratorio, del cultivo ALI caracterizado por el desarrollo de células epiteliales nasales, células productoras de mucosidades y células multiciliadas características del epitelio nasal humano. En este contexto, el cultivo ALI destaca por su beneficioso uso en el estudio de enfermedades respiratorias, favoreciendo la diferenciación celular, no adquirida en los cultivos en monocapa., [EN] SUMMARY: -INTRODUCTION: Primary Ciliary Dyskinesia (DCP) is a rare respiratory disease with a prevalence of 1/20000. It is a hereditary and permanent condition caused by congenital defects in the ultrastructure of the cilia. It manifests itself by causing a deficient functioning of the mucociliary clearance system, generating nasal congestion, cough, otitis or in more severe cases pulmonary problems such us bronchiectasis. It is a disease with a late diagnosis and underdiagnosed, so new techniques for the study of the disease are currently being sought. This is why an Air-Liquid Interface (ALI) culture allows the generation of conditions more similar to physiological ones, being used as a model for the study of DCP. However, cells are subjected to an oxidant-antioxidant substance balance, which can be altered by changes in ALI culture conditions, generating oxidative stress. -METHODS: Establishment of a cellular model for the investigation of DCP using ALI culture technique of nasal epithelial cells obtained from the middle nasal concha of a healthy individual. This culture allows cell differentiation, thus achieving the development of a pseudostratified epithelium. Secondly, RT-qPCR was used to analyze the expression of various genes of the antioxidant system in the different stages of the ALI culture. -RESULTS: The culture was successfully achieved, characterized by the presence of motility-generating ciliary cells. Also, cells in general in the culture, are subjected to higher oxidative stress when they are fully submerged, that is in the growth and proliferation stage. -CONCLUSION: The results obtained in this work indicate that it has been possible, to develop in out laboratory, the ALI culture characterized by the development of nasal epithelial cells, mucus-producing cells and multiciliated cells characteristic of the human nasal epithelium. In this context, ALI culture stands out for its beneficial use in the study of respiratory diseases, favoring cell differentiation, not acquired in monolayer cultures.

La babesiosis bovina es una enfermedad transmitida por garrapatas causada por parásitos protozoarios del género Babesia que en el hospedador mamífero invaden y replican únicamente dentro de los eritrocitos. Esta enfermedad afecta la producción ganadera en regiones de clima tropical y subtropical generando importantes pérdidas económicas a nivel global. Si bien existen estrategias de prevención de la enfermedad tales como el control del vector o la vacunación con cepas atenuadas, las mismas presentan importantes limitaciones por lo que es necesario el desarrollo de estrategias superadoras para controlar la enfermedad. En ese sentido, resulta indispensable dilucidar las bases moleculares de la interacción patógeno-hospedador y estudiar las proteínas involucradas en los procesos de invasión, replicación y egreso parasitario. El objetivo de esta tesis fue caracterizar estructural y funcionalmente la familia de proteínas tipo perforina (PLP) en el género Babesia. Estas proteínas, en organismos estrechamente relacionados a Babesia como Toxoplasma gondii y Plasmodium spp., poseen capacidad de formar poros en membranas de células blanco y son esenciales para la invasión y/o egreso de la célula hospedadora. En este trabajo, se realizó la identificación y caracterización estructural de toda la familia de proteínas PLP en las distintas especies de Babesia mediante análisis bioinformáticos sobre genomas ya secuenciados. Se identificó un número variable de genes en las diferentes especies, desde 3 en B. canis a 8 en B. bigemina y B. divergens. El análisis estructural de las proteínas PLP identificadas mostró que están altamente conservadas a nivel de su estructura secundaria y terciaria tanto dentro del género como con otras proteínas PLP del phylum Apicomplexa, mientras que a nivel de estructura primaria las mismas son divergentes, manteniendo conservados sólo algunos aminoácidos de sus dominios funcionales. El análisis de datos de transcriptómica de diferentes estadios de B. bovis, la especie bovina más virulenta del género, mostró que los 6 genes plp se transcriben durante alguna etapa del ciclo de vida y tres de ellos (plp1, plp2 y plp5) tienen una transcripción estadio-específica. El gen plp1 presentó el mayor nivel de transcripción en el merozoíto, estadio presente sólo en bovinos. A través de análisis de Western blot realizados con el dominio funcional de la proteína PLP1 recombinante se demostró la presencia de anticuerpos específicos contra dicha proteína en bovinos naturalmente infectados con B. bovis indicando que PLP1 es inmunogénica y posee epítopes B inmunodominantes expuestos al sistema inmune bovino durante de la infección. Los ensayos de hemólisis in vitro con el dominio funcional de PLP1 recombinante demostraron una alta capacidad hemolítica de este dominio frente a eritrocitos bovinos en un amplio rango de condiciones de pH y concentración de Ca^2+. Para completar la caracterización funcional de la proteína PLP1 se generó una cepa de B. bovis knock out (KO) para el gen plp1 (Δplp1) por disrupción de su secuencia codificante, generada por doble recombinación homóloga. La línea clonal B. bovis Δplp1 fue caracterizada a nivel genético mediante PCR y Southern blot para verificar la correcta eliminación del gen plp1. A nivel fenotípico se observaron con regularidad en el cultivo Δplp1 formas tetraméricas formadas por dos pares de merozoítos presentes en un mismo eritrocito. Estas formaciones son inusuales en la cepa salvaje lo que indicaría la presencia de un fenotipo mutante en donde las formas apareadas no pueden egresar del eritrocito para invadir uno naïve. Por otra parte, la tasa de crecimiento en cultivos in vitro de la cepa Δplp1 fue significativamente menor respecto a la cepa salvaje, lo que indica que, si bien la expresión del gen plp1 no es esencial para la supervivencia del estadio sanguíneo, PLP1 juega un papel importante en estos estadios ya que su ausencia causa una disminución significativa en el fitness del parásito. En conclusión, tanto la conservación de la estructura de las proteínas PLPs como los ensayos funcionales de PLP1 en B. bovis sugieren que estas proteínas se expresan en el estadio en bovinos y tienen la capacidad de generar poros en membranas eritrocitarias. Los estudios realizados con la mutante Δplp1 muestran que la proteína PLP1 no es esencial para la supervivencia y el desarrollo del merozoíto en el eritrocito, lo que podría explicarse por la redundancia de PLP1 con otros miembros de la familia que podrían haber compensado su ausencia. En base a estos resultados postulamos que la proteína PLP1 está involucrada en el egreso de la célula hospedadora dado que los parásitos Δplp1 que carecen de esta proteína formadora de poros no pueden egresar de forma eficiente de los eritrocitos con la consecuente disminución del fitness del parásito. Futuros ensayos que evalúen la transcripción y expresión de los miembros de la familia PLP en la cepa Δplp1 y de replicación in vivo de esta cepa en infecciones experimentales de bovinos y garrapatas permitirán determinar si la proteína PLP1 es necesaria para la replicación y el desarrollo de otros estadios de B. bovis y si la compensación funcional con otras proteínas de la familia es capaz de suplantar su función en el fenotipo KO. Bovine babesiosis is a tick-borne disease caused by protozoan parasites of the Babesia genus that invade and replicate within the host's red blood cells. This disease affects livestock production in tropical and subtropical regions causing significant economic losses worldwide. Although there are strategies to control the disease, such as vector control or vaccination with attenuated strains, they have important drawbacks. Therefore, it is necessary to develop improved strategies to control the disease. In this sense, it is essential to elucidate the molecular basis of the host-pathogen interaction including the proteins involved in the processes of parasitic invasion, replication and egress. The aim of this thesis was to characterize the family of perforin-like proteins (PLP) in the Babesia genus at the structural and functional levels. The PLP proteins of organisms closely related to Babesia such as Toxoplasma gondii and Plasmodium spp. have the ability to form pores in cell membranes and are essential for invasion and/or egress from the host cell. In this work, the identification and structural characterization of the PLP family in different Babesia species was accomplished through bioinformatics analysis on available genomes. A variable number of genes was identified in different species, ranging from 3 in B. canis to 8 in B. bigemina and B. divergens. Comparative analysis showed that the secondary and tertiary structure of PLPs are highly conserved, both within the genus and with other PLP proteins of the phylum. On the contrary, the primary amino acid sequence is divergent, conserving only a few amino acids of their functional domain. Transcriptomic data analysis from different B. bovis stages, the most virulent bovine species of the genus, showed that the 6 plp genes are transcribed during at least one stage of the life cycle and three of them (plp1, plp2 and plp5) have a stage-specific transcription. The plp1 gene showed the highest level of transcription in merozoites, a stage only present in cattle. Western blot analysis performed with the recombinant PLP1 protein demonstrated the presence of specific antibodies against it in cattle naturally infected with B. bovis, indicating that PLP1 is immunogenic and contains B-cell epitopes exposed to the bovine immune system during infection. Hemolysis assays with the functional domain of recombinant PLP1 demonstrated high hemolytic capacity against bovine red blood cells in a wide range of pH conditions and Ca^2+ concentration. To complete the functional characterization of the PLP1 protein, a B. bovis knock out (KO) strain was generated for the plp1 gene (Δplp1) by disruption of its coding sequence by double homologous recombination. The B. bovis Δplp1 clonal line was characterized at the genetic level by PCR and Southern blot to verify the correct elimination of the plp1 gene. At the phenotypic level, tetrameric forms formed by two pairs of merozoites present in the same erythrocyte were regularly observed in the Δplp1 culture. These formations are unusual in the parental strain which suggests a mutant phenotype where the paired forms cannot egress the erythrocyte to invade a naïve one. On the other hand, the in vitro growth rate of the Δplp1 strain was significantly lower compared to the wild type strain, which indicates that although expression of the plp1 gene is not essential for the survival of the blood stages, PLP1 plays an important role in these stages since its absence causes a significant decrease in the parasite's fitness. In conclusion, the conservation of the structure of the PLP proteins and the functional characterization of PLP1 in B. bovis suggest that these proteins are expressed in merozoites and have the ability to generate pores in the erythrocyte membrane. Studies on the endogenous PLP1 show that this protein is not essential for the survival and development of merozoite in the erythrocyte, which could be explained by the redundancy of PLP1 with other family members, that could have compensated for its absence. The PLP1 protein is probably involved in the egress of the parasite from the host cell and since Δplp1 parasites lack this pore-forming protein they cannot egress efficiently from the erythrocytes, leading to a decrease in the parasite's fitness. Future assays aimed to evaluate transcription and expression of other PLPs in the Δplp1 strain, and the in vivo replication of this strain in experimental infections of cattle and ticks will allow to determine if PLP1 is necessary for the replication and development of other stages of B. bovis and to determine redundancy between PLP family members. Fil: Paoletta, Martina Soledad. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La esclerostina, codificada por el gen SOST, es un inhibidor de la vía Wnt, y por ello tiene una influencia negativa sobre la masa ósea. Algunos polimorfismos del promotor de SOST se han asociado a diferencias en la densidad mineral ósea (DMO) en varios estudios, pero se desconocen cuáles son los mecanismos moleculares implicados. El objetivo de este estudio fue comprobar las consecuencias funcionales de uno de esos polimorfismos in vitro. Para ello se clonó la región promotora proximal del gen SOST, con diferentes alelos del polimorfismo rs851054, y se transfectaron en células HEK-293T, SAOS-2 y HOS-TE85. En ningún caso se observaron diferencias significativas en la actividad transcripcional entre los vectores con el alelo A y los vectores con el alelo G. La co-transfección de vectores de expresión de los factores de transcripción RUNX2 y OSX estimuló claramente la actividad transcripcional (2,5±0,9 veces sobre el valor basal para el alelo A y 1,9±0,8 veces para el alelo G; en ambos casos, p

Introducción. Giardia intestinalis es un organismo tempranamente divergente en el que recientemente se demostró la presencia de intrones. La maquinaria responsable de la remoción de intrones en organismos eucariotas superiores es el empalmosoma, el cual está conformado por cinco ribonucleoproteínas, cada una de las cuales tiene un ARN pequeño nuclear, un set de siete proteínas Sm (B, D1, D2, D3, E, F y G) y varias proteínas específicas. En G. intestinalis se han identificado los genes de algunas proteínas del empalmosoma por bioinformática. Aunque se asume que este es el responsable del empalme en el parásito, su caracterización bioquímica no se ha hecho. Objetivo. Inhibir dos genes que codifican para proteínas del empalmosoma de G. intestinalis con el fin de determinar si esta inhibición afecta el crecimiento o el enquistamiento del parásito. Materiales y métodos. En un vector específico para G. intestinalis se clonaron secuencias antisentido de los genes que codifican para las proteínas SmB y SmD3 del empalmosoma del parásito. Posteriormente, se transfectó G. intestinalis con los vectores recombinantes y se seleccionaron aquellos parásitos que lo incorporaron. Se confirmó la disminución del mensajero mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, y se evaluaron el crecimiento y el enquistamiento en parásitos silvestres y transfectados. Resultados. Se observó una disminución de 40 y 70 % en el ARNm de SmB y SmD3, respectivamente. El crecimiento y el enquistamiento no se vieron afectados en estos parásitos. Conclusión. La disminución de SmB y SmD3 no afectó al parásito, lo que indica que el empalmosoma sigue siendo funcional, o que el empalme no es una función vital del parásito. Introduction. Giardia intestinalis is an early divergent organism that was recently shown to have introns. The machinery responsible for the removal of introns in higher eukaryotes is the spliceosome, which consists of five ribonucleoproteins. Each of these ribonucleoproteins has a small nuclear RNA, a set of seven Sm proteins (B, D1, D2, D3, E, F and G) and several specific proteins. Some genes that encode spliceosome proteins have been bioinformatically identified in the parasite genome. Although it is assumed that the spliceosome is responsible for splicing in this parasite, biochemical characterization is lacking. Objective. To inhibit two G. intestinalis spliceosome protein genes in order to determine whether this inhibition affects parasite growth or encystation. Materials and methods. Antisense sequences of the genes encoding the spliceosomal parasite proteins SmB and SmD3 were cloned into a specific G. intestinalis vector. G. intestinalis individuals were subsequently transfected with the recombinant vectors and those parasites that incorporated the vector were selected. A decrease in mRNA levels by real-time PCR was confirmed and the growth and encystation in wild and transfected parasites was assessed. Results. A decrease of 40% and 70% of SmB and SmD3 mRNA levels, respectively, was observed. Growth and encystation in these parasites were not affected. Conclusion. Decrease of SmB and SmD3 mRNA levels does not affect the parasite, indicating that the spliceosome remains functional or that splicing is not essential for parasite viability.

[ES] La proteína klotho es una β-glucuronidasa cuya sobrexpresión está relacionada con la prolongación de la vida. A pesar de que su mecanismo de acción todavía no se conoce con exactitud, estudios recientes sugieren que klotho podría evitar el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer (EA) asociado con el envejecimiento, probablemente inhibiendo la señalización insulina/IGF-1, y por lo tanto el daño oxidativo en el cerebro. El objetivo de este estudio es investigar la expresión de la proteína klotho en muestras humanas de cerebros con EA. Para lograrlo, se requiere la producción previa de la proteína klotho in vitro. Con este fin, el gen klotho será clonado en un vector de expresión (pGV). Después, se llevará a cabo la transfección transitoria en la línea celular humana HEK 293 para la producción in vitro de la proteína. El extracto de proteína total será cuantificado. La proteína klotho será analizada por Western Blot y cuantificada por desitometría. Con los datos obtenido se realizará una curva patrón para el posterior análisis y cuantificación relativa de la proteína klotho en las muestras humanas de cerebros., [EN] Klotho protein is a β-glucuronidase whose overexpression is related to life extension. Despite its mechanism of action is not fully understood, recent studies suggest that klotho might prevent the development of Alzheimer's disease (AD) associated with aging, probably by inhibiting insulin/IGF-1 signaling, hence oxidative injury in the brain. The aim of this study is to investigate the expression of klotho protein in human samples of AD. To achieve this, in vitro production of human recombinant klotho is previously required. For this purpose, klotho gene will be cloned in an expression vector (pGV). After that, transient transfection in the human cell line HEK 293 will be performed for in vitro klotho production. The total protein extract will be then quantified. Klotho protein will be analysed by Western Blot and quantified by densitometry. With these data, a calibration curve will be obtained for subsequent analysis and relative quantification of human brain samples., [CA] La proteïna Klotho és un factor neuroprotector rel·lacionat amb l’envelliment i la malaltia d’Alzheimer (AD, de l’anglés Alzheimer’s disease). La variant secretada de la proteïna (s-KL), la més expressada en humans, sembla tindre un paper important en el manteniment de les funcions cognitives. És per això que l’estudi de la variant s-KL en humans és de gran rellevància per poder entendre la seua implicació en l’AD i l’envelliment. En aquest treball, el cDNA de la proteïna s-KL humana va ser clonat en un vector d’expressió eucariota. Després, la proteïna s-KL fou produïda per transfecció transitòria en la línia cel·lular humana HEK-293, i els seus extractes proteics foren quantificats i analitzats per Western Blot. La immunodetecció de s-KL es va realitzar mitjançant un anticòs específic (K-18.2) mai abans utilitzat, i per al qual es va desenvolupar un nou protocol. Aquest assaig va permetre avaluar la producció de s-KL per les cèl·lules transfectades i la especificitat del nou anticòs K-18.2. Finalment, es va portar a terme una validació complementaria de l’anticòs K-18.2 utilitzant extractes proteics de cervells humans, obtinguts de pacients sans i malalts d’AD.

[ES] Cuando las células madre neuronales se crecen in vitro forman unos agregados no adherentes denominados neuroesferas (NF). Estos agregados son capaces de diferenciarse a neuronas, astrocitos y oligodendrocitos cuando se eliminan los factores de crecimiento del medio de cultivo. En esta capacidad de diferenciación se basa su efecto terapéutico. Sin embargo a partir de las biopsias cerebrales que se han hecho a pacientes no se ha conseguido obtener un número significativo de neuroesferas. El objetivo es modificar las células mediante la tecnología del c-mycERTAM . Este transgen genera una proteína de fusión que estimula la proliferación celular en presencia de 4-hidroxi-tamoxifeno (4-OHT)(droga sintética), favoreciendo la rápida extensión en cultivo de estas células. En ausencia de 4-OHT y de factores de crecimiento en el medio de cultivo, se inactiva el gen c-myc, provocando que el crecimiento celular se detenga y que las células se diferencien a neuronas, astrocitos y oligodendrocitos., [EN] Adult neural stem cells (NSCs) have been proposed as candidates for use in cell therapy to treat degenerative diseases of the central nervous system. When the NSCs are grown in vitro form cell aggregates or clones called neurospheres. These aggregates are capable of differentiating into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes upon removing growth factors from the culture medium. This capability of differentiation is the base of their therapeutic effect. Our group, in cooperation with the Neurosurgery department from the Vall d’Hebron hospital, collected brain biopsies, from patients, and although we were able to obtain neurospheres, we could not reach a significant number of cells, due to its low proliferative capacity and, therefore their limited expansion. In this study, NSCs were modified by the technology of c-mycERTAM. This transgene produces a fusion protein that stimulates cell proliferation (in a c-myc dependent manner) in the presence of 4-hydroxy-tamoxifen (synthetic drug), facilitating the rapid expansion in culture of these cells. This has been demonstrated in embryonic NSCs cells, CHO and fibroblasts, but not in adult NSCs. Our work shows an increase in cell proliferation at the doses used, which increased in subsequent passes, with no change in the self-renewal. Our results imply a step forward in the optimization of NSCs expansion, which would be useful in the case of a possible future treatment.

Background: Plasma high density lipoproteins (HDL) are involved in reverse cholesterol transport mediated by the scavenger receptor class B type I (SR-BI). Nicotinic acid increases HDL cholesterol levels, even though its specific impact on SR-BI dependent-cellular cholesterol transport remains unknown. Aim: To determine the effect of nicotinic acid on HDL particle functionality in cholesterol efflux and uptake mediated by SR-BI in cultured cells in hypoalphalipoproteinemic patients. Material and Methods: In a pilot study, eight patients with low HDL (≤ 40 mg/dL) were treated with extended release nicotinic acid. HDL cholesterol and phospholipid levels, HDL2 and HDL3 fractions and HDL particle sizes were measured at baseline and post-therapy. Before and after nicotinic acid treatment, HDL particles were used for cholesterol transport studies in cells transfected with SR-BI. Results: Nicotinic acid treatment raised total HDL cholesterol and phospholipids, HDL2 levels as well as HDL particle size. Nicotinic acid significantly increased HDL cholesterol efflux and uptake capacity mediated by SR-BI in cultured cells. Conclusions: Nicotinic acid therapy increases SR-BI-dependent HDL cholesterol transport in cultured cells, establishing a new cellular mechanism by which this lipid-lowering drug appears to modulate HDL metabolism in patients with hypoalphalipoproteinemia.

Plasmodium falciparum es el parásito que causa la malaria más severa en humanos,enfermedad que afecta mundialmente a 200–300 millones de individuos al año. Ladescripción del genoma, del transcriptoma y del proteoma son un recurso importantepara poder entender la función y la regulación de la expresión génica. En el caso delparásito P. falciparum, el 60% de los genes anotados siguen siendo hipotéticos, debidoa la gran distancia evolutiva del parásito respecto de organismos modelo. Por otro lado,la presencia y abundancia de un ARNm no necesariamente se correlaciona con laabundancia de la proteína correspondiente y la cuantificación de estos parámetros sonpor lo tanto representaciones imperfectas de la regulación génica y proteómicasubyacente. En esta tesis se establece la conexión entre ARNm y proteína midiendodirectamente la traducción a nivel genómico usando la técnica de perfilamientoribosomal, revelando por primera vez la dinámica de este proceso durante los estadíosintraeritrocíticos del parásito. Los resultados obtenidos demuestran que los procesos detranscripción y traducción están estrechamente acoplados, que el 11% deltranscriptoma está regulado traducciónalmente y que este tipo de regulación juega unrol importante en genes con funciones de egreso e invasión del merozoito. Además, sepresenta un conjunto de métodos mejorados para la manipulación genética a escalagenómica de P. falciparum. Este conjunto de protocolos puede ser aplicado para lainvestigación y descubrimiento de la función de los genes del parásito. Plasmodium falciparum is the causative agent of the most burdensome form of humanmalaria, affecting 200–300 million individuals per year worldwide. For the study of P.falciparum, the description of the genome, the transcriptome and the proteome are atremendous resource for understanding gene function and gene expression regulation. However, 60% of the annotated genes in the genome remain hypothetical due to theevolutionary distance of this parasite to model organisms, and mRNA and proteinabundance measurements remain imperfect representations of the underlying geneticand proteomic regulation, since the presence and abundance of an mRNA species doesnot necessarily correlate with the abundance of the corresponding protein. The workpresented in this thesis bridges this disconnect by measuring whole genome translation,using the ribosome profiling technique, revealing for the first time translation dynamicsthroughout the asexual intraerythrocytic developmental cycle. The findings show thattranscription and translation are tightly coupled in this parasite, that 11% of thetranscriptome is translationally regulated and that this type of regulation plays a majorrole on genes related to merozoite egress and invasion. Additionally, presented here isan improved set of methods for 96-well plate-based transfection and culture thatfacilitate genome-scale genetic manipulation of P. falciparum. This set of protocols canbe applied to investigation and discovery gene functions in this parasite. Fil: Caro, Florence. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

The fast growth of Chilean aquaculture has impelled the exploration of new strategies of sanitary prevention. DNA vaccines appear as a feasible alternative for disease control, however there are technical barriers such as the form of administration and the carrier systems which need to be resolved. Liposomes are widely used for gene delivery in mammalian cell lines, but their high cost makes difficult their use at an industrial scale. Considering this economic problem and in order to contribute with anin vitroprocedure for transfection of salmon cells, the objectives of this work were to formulate a liposome from DOTAP lyophilized powder and to develop a transfection protocol using eukaryotic vectors for the fish cell line CHSE-214. The liposome properties and the optimal transfection conditions were established using pcDNA 4.0 HisMax I TOPO and pIRES-EGFP vectors and Chinook CHSE-214 cell line (ATCC 1681). The results indicated that the liposome formulated from DOTAP lyophilized powder shares all the characteristics with the commercial liposomes and has a lower cost, approximately 10 times less. By using this liposome, it was possible to develop a transfection protocol for CHSE-214 fish cells with eukaryotic vectors without toxicity signs which allowed the expression, in both vectors, of the incorporated gene. &nbsp, El rápido crecimiento de la acuicultura chilena ha incentivado la exploración de estrategias innovadoras de prevención sanitaria. Las vacunas de ADN se presentan como una alternativa viable para el control de enfermedades, pero existen barreras técnicas, como la vía de administración y los sistemas de transporte y entrega que necesitan ser soslayados. Los liposomas catiónicos son utilizados ampliamente en la incorporación de genes en líneas celulares mamíferas pero su alto costo hace prohibitivo su uso en escala comercial. Con el fin de abordar la problemática económica en la obtención del liposoma y para contribuir con un procedimiento de transfecciónin vitroen células de salmón, los objetivos de este trabajo fueron formular un liposoma a partir de polvo liofilizado de DOTAP y desarrollar un protocolo de transfección de vectores eucarióticos en la línea celular CHSE-214. Para ello se utilizaron los vectores pcDNA 4.0 HisMax I TOPO y pIRES-EGFP y la línea celular de salmón Chinook CHSE-214 (ATCC 1681), estableciendo tanto las características del liposoma formulado como las condiciones óptimas de transfección. Los resultados indicaron que el liposoma formulado desde polvo liofilizado de DOTAP comparte todas las características de los liposomas comerciales con la ventaja de poseer bajo costo, aproximadamente 10 veces menos. Con este liposoma se logró establecer un protocolo óptimo de transfección de células de peces CHSE-214, con vectores eucarióticos, no mostrando signos de toxicidad y permitiendo la expresión del gen incorporado en ambos vectores. &nbsp

Los antimoniales pentavalentes Glucantime® y Pentostam® son los medicamentos de primera línea usados en el tratamiento anti- Leishmania; sin embargo, no hay estudios in vivo que comparen su eficacia y toxicidad controlando variables del hospedero. Los estudios bioquímicos en Leishmania detectaron diferencias entre los dos medicamentos en la inhibición de la topoisomerasa I, que podrían reflejarse en diferencias en su efectividad. Para evaluar la eficacia clínica se infectaron hámsteres en la pata trasera derecha con 106 promastigotes de Leishmania panamensis silvestre y transfectada con el gen de la luciferasa. Para evaluar la eficacia parasitológica se estandarizó la cuantificación de parásitos en los tejidos por luminometría. Tres semanas después de la inoculación, los animales se trataron intramuscularmente con Glucantime® o Pentostam® (30, 60 o 120 mg de SbV/kg por día por 20 días). La toxicidad se evaluó en hámsteres tratados intramuscularmente con 120, 160 o 240 mg de SbV/kg por día por 20 días de Glucantime® o Pentostam®. La resolución de las lesiones en los animales inoculados con ambas cepas fue similar con ambos medicamentos. La carga parasitaria disminuyó de forma equivalente con ambos medicamentos en todas las dosis, y resultó en diferencias significativas con respecto a los controles ( p