Search

Bu çalışmada, Ergani Makam Dağı'ndan alınan toprak örneğinden bakteri izole edildi. İzole edilen bakteri biyokimyasal ve 16S rRNA analizleri yardımıyla Bacillus subtilis A8 olarak tanımlandı. Bakteri üremesinin optimum koşulları 24. saat, 37°C ve pH 9.0 olarak belirlendi. Proteaz aktivitesine bakıldığında optimum üretim zamanı 24 saat, optimum sıcaklık 37°C, optimum pH ise 9.0 olarak tespit edildi.Bakterinin üretim ortamına karbon ve azot kaynakları ilave edilerek proteaz üretimi üzerine etkisi araştırıldı. Karbon kaynaklarında; nişasta, glukoz, maltoz, laktozun proteaz üretiminde kontrole göre yaklaşık üç kat artış, galaktoz ilavesiyle de enzim üretiminde azalış gözlendi. Azot kaynakları içinde en yüksek değere üre ile ulaşılırken amonyum sülfat etkisi ile de enzim üretiminde önemli ölçüde inhibisyon tespit edildi.Enzimin optimum koşulları belirlendikten sonra kısmi saflaştırma gerçekleştirildi. Kısmi olarak saflaştırılan enzim üzerine %0.5'lik SDS, BRIJ, Tween- 40, Tween-80 ve TritonX-100 kullanılarak deterjan etkisi araştırıldı. SDS'nin proteaz aktivitesini %80 oranında inhibe ettiği görülürken diğer deterjanların enzim aktivitesi üzerine önemli bir etki yapmadığı tespit edildi. Kısmi saflaştırılması yapılan proteaz üzerine inhibitör etkisi incelendiğinde; EDTA (Etilendiamin tetraasetik asit), PMSF (Fenilmetilsulfonil florid), DTT (Ditiyothreitol ve β-merkaptoetanol gibi inhibitörler arasında en yüksek inhibisyon etkisi 10 mM PMSF (%92) ile elde edildi. In this study, bacteria were isolated from soil sample taken from Mount Ergani Authority. Bacteria which isolated with the help of biochemical tests and 16S rRNA analysis defined as Bacillus subtilis A8. Optimal conditions of bacterial growth were determined at 24th hour, 37°C and pH 7.0, respectively. Optimum production time was 24 hours, optimum temperature was 37°C and optimum pH was 9.0.Carbon and nitrogen sources were added to the production medium of the bacteria to investigate their effect on the production of protease. In carbon resources; starch, glucose, maltose, lactose protease production of approximately three-fold increase, galactose addition of enzyme production was observed to decrease. Among the nitrogen sources, the highest protease activity was reached with urea, while the addition of ammonium sulfate decreased the enzyme production significantly.After optimum conditions was determined, the enzyme partial was purified. To determine the effect of some detergents on the partially purified enzyme 0.5% SDS, Tween-40, Tween-80 and TritonX-100, BRIJ was used. While it was seen that SDS inhibited protease activity by 80%, it was found that other detergents had no significant effect on enzyme activity. When the effect of inhibitors such as EDTA (Ethylenediamintetra acetic acide), PMSF (Phenylmethylsulfonyl flüoride), DTT (Dithiothreitol) and β-mercaptoethanol on the partially purified protease was examined, the highest inhibition effect was obtained with 10 mM PMSF (92%). 77

YÖK Tez ID: 459289 Bu tez çalışmasının amacı, Balıkesir ilinin Bigadiç ilçesinde bulunan bor madeninin atık havuz alanından ve bor kalıntılarının bırakıldığı noktadan alınan toprak örneklerinden izole edilen bakterilerin spesifik özelliklerini, optimal üreme ve proteaz üretme koşullarını belirlemektir. Bu amaçla bakterilerinin proteaz enzimini artırmak için farklı besi ortamları denenmiş, karbon kaynakları, pH ve sıcaklık değerleri gibi önemli etmenler değiştirilerek test edilmiştir. Elde edilen bakterilerin gen dizilimleri incelenmiş ve 16S rDNA sekans analizi kullanılarak bu bakterilerin moleküler karakterizasyonları gerçekleştirilmiştir. pH, sıcaklık ve inkübasyon süresiyle ilgili yapılmış olan çalışmalarla da TK2 izolatının pH 12.0 25 °C sıcaklıkta ve 48. saatte 90.648 U/ g/mL ile en yüksek aktiviteye TK3 izolatı ise pH 7.0, 25 °C sıcaklıkta 48. saatte 93.347 U/ g/mL ile en yüksek proteaz aktivitesi gösterdiği saptanmıştır. TK2 ve TK3 izolatları ile yapılan moleküler karakterizasyon çalışmaları sonucunda TK2 suşunun Bacillus toyonensis strain BCT-7112 türüne % 100' e yakın oranda homoloji gösterdiği belirlenmiştir. TK3 suşu ise Bacillus cereus ATCC 14579 türüne % 100' e yakın oranda homoloji gösterdiği belirlenmiştir. The aim of this study, to determine optimal growth, protease production conditions and specific characteristics of the bacteria isolated from boron residue and boron in the district waste pool area at Balikesir province Bigadic. For this purpose different media tested to improve the protease enzyme, carbon sources, pH and temperature values. Molecular characterization of these bacteria were examined using the obtained gene sequences of bacteria and 16S rDNA sequence analysis was performed. The highest protease activity found 90.648 U/g/mL to pH 12.0 at 25 ° C and 48 hours of TK2 isolates and 93.347 U/g/mL pH 7.0, at 25 ° C and 48 hours of TK3 isolates. TK2 strain show that 100% homology to Bacillus toyonensis strain BCT-7112 and TK3 strain show that 100% homology to Bacillus cereus ATCC 14579.

TEZ10567 Tez (Doktora) -- Çukurova Üniversitesi, Adana, 2014. Kaynakça (s. 211-231) var. xix, 233 s. : res. (bzs. rnk.), tablo ; 29 cm. Bu çalışmada, toprak örneğinden izole edilen Bacillus subtilis’den alkali proteaz ve biyosürfektan üretimi ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Alkali proteaz enzimini maksimum miktarda üretmek için enzim üretim ortamının optimizasyonu yapılmıştır. Maksimum alkali proteaz üretimi için en iyi karbon kaynağı %1 ekmek tozu, en iyi azot kaynağı %1 kazein olarak belirlenmiştir. Ayrıca, optimum pH 10.5, sıcaklık 37ºC, çalkalama hızı 200 rpm, inokulum miktarı %5, inokulum yaşı 4 saat, ekmek tozu %1 olarak saptanmıştır. Aynı zamanda çalkalamalı erlen kullanıldığında maksimum alkali proteaz üretiminin olduğu belirlenmiştir. Aynı zamanda Bacillus subtilis’den biyosürfektan üretimi de çalışılmıştır. Hemolitik aktivitede Bacillus subtilis çok iyi hemoliz zonu göstermiş ve hemolitik zon çapı 3 cm’den büyük olduğu için (++++) tam hemoliz şeklinde değerlendirilmiştir. Emülsifikasyon için en iyi substat ksilen (%68) olarak belirlenmiştir. Pendant drop yöntemi kullanılarak biyosürfektanın yüzey gerilimi 48.64 mN/m olarak tespit edilmiştir. Ramnoz testi pozitiftir bu da biyosürfektanın ramnolipid tipte olabileceğini göstermektedir. Çalışmada elde edilen biyosürfektan iyi köpürme, antimikrobiyal ve antifungal aktiviteye sahiptir. Ayrıca yüksek sıcaklıklara, yüksek tuzluluğa maruz kalma süresince ve geniş pH aralığında stabilite göstermiştir. Sonuç olarak, Bacillus subtilis tarafından üretilen alkali proteaz ve biyosürfektanın sahip olduğu özelliklerden dolayı deterjan katkı maddesi olarak birlikte kullanılması geliştirilmiş yıkama verimliliği sağlayacaktır. In this study, the alkaline protease and biosurfactant from Bacillus subtilis isolated from soil sample were produced and characterized. The culture conditions were optimized for maximum alkaline protease production. The best carbon and nitrogen sources for maximum alkaline protease production were 1% waste bread powder and 1% casein, respectively. In addition optimal pH 10.5, temperature 37ºC, agitation rate 200 rpm, inoculum size 5%, inoculum age 4 hours, waste bread powder 1% were determined. Also maximum enzyme production was detected when using baffled erlenmeyer flask. The production of a biosurfactant by Bacillus subtilis was also studied. In hemolytic activity, Bacilllus subtilis showed very good hemolysis and diameter of the hemolytic zone was larger than 3 cm was evaluated as complete hemolysis (++++). Xylen was the best substrates for emulsification (68%). Surface tension of biosurfactant was determined 48.64 mN/M using pendant drop method. The rhamnose test was positive which indicates that biosurfactant could be of rhamnolipid type. It had a good foaming, antimicrobial and antifungal activities. Furthermore, it showed stability during exposure to high temperatures, high salinity and a wide range of pH. Consequently, due to the characteristic features of alkaline protease and biosurfactant produced by Bacillus subtilis their together use will provide improved wash efficiency as a detergent additive. Bu çalışma Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: FEF2013D10.

Bu çalışmada; termofilik bakteri olarak tanımlanan Aeribacillus pallidus C10'dan ekstra selüler alkalin proteaz enzimi saflaştırıldı ve karakterize edildi. Enzim amonyum sülfat çöktürmesi-diyaliz sonrasında DE52 anyon değişim kromotografisi ve ProbondTM afinite kromotografisi teknikleri ile sırasıyla %26,9 verimle 4,85 kat ve %19,56 verimle 17,32 kat saflaştırıldı. Enzimin molekül kütlesi SDS-PAGE ile yaklaşık 38,35 kDa olarak tayin edildi. Enzim için optimum pH ve sıcaklık sırasıyla 9 ve 60°C olarak belirlendi. Enzimin 20-80°C sıcaklıkları arasında 1 saat sonunda aktivitesinin %80'den fazlasını özellikle 60, 70 ve 80°C sıcaklıklarda kararlılığını büyük oranda koruduğu tespit edildi. A. pallidus C10'dan saflaştırılan proteaz enzimin aktivitesi üzerine metal iyonlarının etkisi incelendiğinde Mg+2, K+, Ca+2, Zn+2 ve Ag+ iyonları varlığında enzimin aktiviteyi artırdığı gözlenirken, Fe+2, Mn+2 ve Co+2 iyonları varlığında ise enzimin yüksek kararlılık sergilediği gözlendi. Enzimin oksidantlar, yüzey aktif maddeleri varlığında aktivite kaybettiği fakat %5 SDS varlığında enzimin aktivitesinde %16'lık bir artış olduğu belirlendi. Organik çözücüler varlığında enzimin aktivitesinin %70'den fazlasını koruduğu tespit edildi. Enzim, en yüksek aktiviteyi kazein subsratı için gösterdi. Enzimin serin proteaz inhibitörü PMSF ile tamamen inhibe olduğu belirlendi. EDTA varlığında ise enzimin aktivitesini koruduğu gözlemlendi. Bu enzim için KM ve Vmax değerleri sırasıyla 0,197 mg/ml ve 7,29 µmol.ml-1.dk-1 olarak hesaplandı. In this study, an extracellular alkaline protease was purified and characterized by Aeribacillus pallidus C10 identified as thermophilic bacteria. After ammoniumsulfate precipitation-dialysis, protease was purified by DE52 anion-exchange chromatography and ProbondTM affinity chromatography with 26,9% a yield and 4,85 fold, with 19,56% a yield and 17,32 fold respectively. The molecular weight of purified enzyme determined by using SDS-PAGE was approximately 38,35 kDa. The optimum pH and temperature for enzyme was 9 and 60°C respectively. The enzyme activity remained more than 80% of its orginal activity for 1 h between 20-80°C and was stable especially 60, 70 and 80°C. The effects of various metal ions (Mg2+, Mn2+, K+, Ag+ , Fe2+, Zn2+, Ca2+) on the protease enzyme activity were examined. This results showed that enzyme activity was increased in the presence of Mg2+, K+, Ca2+, Zn2+ ve Ag+ ions and it was maintain stability in the presence of Fe+2, Mn+2 ve Co+2 . The enzyme wasn't stable in the presence of surfactants and oxidizing agent but in the presence of 5% SDS the enzyme activity was increased %16. The enzyme activity was found to retain more than %70 in the presence of organic solvents. The protease enzyme showed highest activity together with casein. The protease was almost completely inhibited by the serine protease inhibitor PMSF. The enzyme was preserve its activity in the presence of EDTA. The kinetic parameters, Vmax and KM of the purified protease were determined by using Lineweaver-Burk plot 0,197 mg/ml and 7,29 µmol.ml-1.dk-1 respectively. 99

Yüksek basıncın en güncel uygulamaları enzimlerin inaktivasyonuna yönelik olmasına rağmen, bazı enzimlerin aktivite ve kararlılıklarının yüksek basınç uygulamaları ile iyileştiğine dair bulgular bulunmaktadır. Bilindiği gibi enzim aktivite ve kararlılığını arttırmada birçok fiziksel, kimyasal ve genetik yaklaşımlar kullanılmaktadır. Son yıllarda da süperkritik akışkanların biyoteknolojik proseslere uygulanmasına yönelik çalışmalar artmıştır. Bu çalışmanın amacı, süperkritik karbondioksitin hidrolitik enzimlerin aktivite ve kararlılığını arttırmada alternatif bir yöntem olarak araştırılmasıdır. İşletme parametreleri olarak basınç (60-300 bar), sıcaklık (28-80 oC), CO2 akış hızı (2-10 g/dak) ve sürenin (60-180 dak), hidrolitik enzimler olan ?-amilaz, selülaz, proteaz ve ß-glukanaz'ın aktivite ve stabiliteleri üzerine etkisi değerlendirilmiştir. ?-amilaz enzimi için en yüksek aktivite 240 bar, 41°C, 4 gr/dak akış hızı ve 150 dakika sonucunda, proses edilmemiş enzime oranla %67.7'lik bir artışla 29728 ?mol/mL/dak olarak belirlenmiştir. Selülaz enziminde en yüksek aktivite değeri %48.3'lük bir artışla 9.27 ?mol/mL/dak olarak hesaplanmıştır. Proteaz enziminin aktivitesi incelendiğinde, artan basınçla birlikte aktivite artmış ve 300 bar basınçta en yüksek aktivite (417.51 ?mol/mL/dak) elde edilmiştir. Süperkritik CO2 uygulamaları ile ß-glukanaz enziminin en yüksek aktivite değeri 240 bar, 90 dakika, 67°C ve 8 g/dak akış hızıyla 18.39 µmol/mL/dak olarak tespit edilmiştir.Basınca bağlı stabilizasyon ve aktivasyon için olası mekanizmalar NMR, SEM, FTIR ve XPS analizleri ile değerlendirilmiştir. Süperkritik CO2 ile proses edilmiş enzimlerden (?-amilaz, selülaz, proteaz ve ß-glukanaz) en yüksek ve en düşük aktivite gösteren enzim örnekleri ile süperkritik CO2'le proses edilmemiş enzim örneklerinin aktivitelerine pH'ın ve sıcaklığın etkilerinin incelenmesi amacı ile farklı pH değerlerinde (4.0-9.0) ve sıcaklık koşullarında (20-80°C) aktivite tayinleri yapılmıştır. Kinetik sabitler (Km - Vmax), Lineweaver- Burk grafikleri oluşturularak belirlenmiştir. Böylece enzimin yapısındaki muhtemel değişimlerin enzimin kinetik parametrelerinde farklılık oluşturup oluşturmadığı gözlenmiştir.En yüksek aktiviteyi gösteren süperkritik CO2 ile proses edilmiş enzim, immobilize edilerek ardışık enzimatik reaksiyonlarda kullanılmıştır. Her reaksiyon sonunda aktivite tayini yapılarak ve proses edilmiş enzimin relatif aktivitesi proses edilmemiş enzimden düşük olana kadar ardışık reaksiyonlara devam edilmiştir. Akabinde, işlem görmüş enzim aktivitesinin ardışık reaksiyonlar sonrasında arttırılıp arttırılamayacağını araştırmak amacı ile optimum süperkritik CO2 koşullarında tekrar uygulama yapılmış ve enzimlerin tekrar kullanılabilirlikleri belirlenmiştir. While most current applications of high pressure are for inactivating deleterious enzymes, there is evidence that high pressure can induce stabilization and activation of some enzymes. Various physical, chemical and genetic approaches have been applied in order to enhance enzyme stability and activity. In recent years, supercritical fluids have been of interest in the biotechnological processes.In this project, the aim is to investigate the capability of supercritical carbon dioxide to alter the stability and activity of hydrolytic enzymes as an alternative technique. The effects of operational parameters such as pressure (60-300 bar), temperature (28-80 oC), CO2 flow (2-10 g/min) and time (60-180 min) were evaluated in regards to the activity and stability of hydrolytic enzymes such as ?-amylase, cellulase, protease and ß-glucanase. For ?-amylase, maximum activity was determined as 29728 ?mol/mL/min with 240 bar, 41°C, 4 g/min flow rate and 150 min of process duration yielding 67.7% higher activity than the untreated enzyme. The highest activity for cellulase was determined as 9.27 ?mol/mL/min with an increase rate of 48.3%. Having studied the activity of protease, the activity was increased with the raise of pressure and maximum activity (417.51 ?mol/mL/min) was determined at the pressure of 300 bar. The highest activity of ß-glucanase enzyme was measured as 18.39 µmol/mL/min at 240 bar, 90 min, 67°C and 8 g/min flow rate with supercritical CO2 applications.Possible mechanisms for pressure induced stabilization and activation were investigated by NMR, SEM, FTIR and XPS analyses. The effect of pH and temperature on the activity of supercritical CO2 treated enzymes exhibiting the highest and the lowest activities (?-amylase, cellulase, protease and ß-glucanase) and the untreated enzyme at various pH (4.0-9.0) and temperature conditions (20-80°C) were evaluated. Kinetic constants (Km - Vmax) were determined by Lineweaver- Burk graphs. Hence, whether possible structural changes have an effect on kinetic parameters of the enzyme were observed. Treated enzymes exhibiting the highest activities were immobilized and used in consecutive enzymatic reactions. Activities were calculated at the end of each reaction and consecutive reactions were conducted till the residual activity of the treated enzyme becomes lower than the untreated enzyme. Subsequently, the treated enzyme was once again treated under optimized supercritical CO2 conditions in order to figure out whether the activity can be enhanced or not and the reusage of the enzymes were determined. 163

Son on yıldır, Akdeniz ülkelerinde akuakültür üretimi daha çok çipura (Sparus aurata) ve levrek (Dicentrarchus labrax) üzerinde yoğunlaşmış durumdadır. Bu durum, ekonomik değeri yüksek potansiyel alternatif türlerin üretimini gündeme getirmiştir. Bu çalışmada, son yıllarda alternatif türler arasında değerlendirilen sinarit (Dentex dentex) balığının larva kültüründe (0-40 gün) önemli yere sahip olan sindirim enzimlerinden proteaz grubu enzimlerin aktivitesindeki değişimler incelenmiştir. Yumurtadan çıkan larvalarda 3. günde ağız ve anüs açılımı gözlenmiş ve dışarıdan yem girişi yapılmıştır. Alkalin proteaz aktivitesi, eksojen besin alımı ile birlikte tespit edilmiş ve larval gelişime bağlı olarak spesifik aktivitesi yükselmiştir. Bununla birlikte, asit proteaz aktivitesi, 28. günden itibaren fonksiyonel mide oluşumu ile tespit edilmiş, aynı şekilde spesifik aktivitesi deneme sonuna kadar değişim göstermiştir. Larval üretim sonunda, total boy ve ağırlık gelişimi sırası ile 19.83±2.6 mm ve 42.12±4.3 mg olarak tespit edilmiştir. Ayrıca spesifik büyüme oranı (SBO) ve yaşama oranı ise sırası ile 9.35±1.9 %/gün ve %18.6±3.7 olarak hesaplanmıştır. Sonuç olarak, sinarit larvalarının proteaz grubu enzimlere ait aktivite değişimleri, alternatif türler kapsamında yer alan fangri (Pagrus pagrus), kırma mercan (Pagellus erythrinus) ve sivriburun karagöz (Diplodus puntazzo) gibi diğer Sparidae türleri ile yakın benzerlikler göstermiştir. During the last decade, Mediterranean aquaculture mainly based on gilthead sea bream, Sparus aurata, and European sea bass, Dicentrarchus labrax, and this situation caused production of promising candidate species. In this study, changes of alkaline and acid protease enzymes activity in recent candidate species common dentex larvae (between 0 and 40 days) were investigated. Mouth and anus were opened on day 3 and also exogenous feeding started. The specific activity of alkaline protease was firstly detected on day 3 concurrently with starting of exogenous feeding and also relatively increased by larval age and size. However, the specific activity of acid protease was firstly measured at 28 days after hatching concurrently with formation of functional stomach. At the end of the larval rearing, total length and weight development was determined as 19.83±2.6 mm and 42.12±4.3 mg, respectively. Additionally, specific growth rate (SGR) and survival rate were calculated as 9.35±1.9 %/day and 18.6±3.7%, respectively. As a result, ontogenic development and enzymatic profile in common dentex larvae were demonstrated similar profile as abserved in the other promising candidate Sparid species such as red porgy (Pagrus pagrus), common pandora (Pagellus erythrinus) and sharpsnout (Diplodus puntazzo) sea bream larvae. 68

Çalışmada TÜBİTAK-MAM-GMBE, Enzim ve Fermentasyon Teknolojisi Laboratuvarı tarafından izole edilen ve yeni bir tür olan Bacillus marmariensis GMBE 72 suşundan izole edilen alkalen proteaz (AP) enziminin saflaştırılarak karakterizasyonu yapılmıştır. 54 saatlik fermentasyon sonunda kültür ortamı santrifüjlenerek hücreler uzaklaştırılmış, kültür üst sıvısındaki protein % 55 (NH4)2SO4 çöktürmesi ve DEAE-selüloz iyon-değişim kromatografisi kullanılarak saflaştırılmıştır. Tuz ilavesinden önce kültür üst sıvısının pH değeri 6.5'e ayarlanmıştır. Tuz çöktürmesinden elde edilen çökelek 50 mM pH 10.5 NaOH-glisin tampon çözeltisine karşı gece boyunca diyaliz edilmiş elde edilen diyalizat DEAE-selüloz anyon değişim kromatografi kolonuna yüklenmiştir. Enzim pH 10.5 NaOH-glisin tampon çözeltisindeki 0-0.25 mol l-1 NaCl lineer gradienti ile kolondan yıkanmıştır. Proteolitik aktivite piki 0.20 mol l-1 iyonik güçte gözlenmiştir. Saflaştırma verimi % 35 ürün ve saflaştırma katsayısı değeri 17'dir. Enzim SDS-PAGE'de tek bant protein olarak gözlenmiş ve molekül ağırlığı 24.26 kDa olarak tespit edilmiştir. Alkalen proteazın; Km ve Vm değerleri sırasıyla 3.12 mg ml-1 kazein, 1.60 µmol tirozin ml-1dak-1, optimum sıcaklık ve pH değerleri sırasıyla 60ºC ve 11.0 olarak tespit edilmiştir. Enzim 2 mM fenilmetilsülfonilflorür (PMSF) tarafından tamamen inhibe edildiği için enzimin serin alkalen proteaz olduğu tespit edilmiştir. Peptid nitroanilid ve protein substratlar arasında N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA ve süt tozunu en yüksek spesifite ile hidrolizlemiştir. Enzim % 2 Tween-20, 40, 60, 80 varlığında stabilitesini korurken % 0.2 sodyumdodesil sülfat (SDS) ve 5% H2O2 varlığında stabilitesini kaybetmiştir. Alkalen proteaz aktivitesi üzerine 4 mM Cu2+ iyonlarının etkisi incelenmiş 30 ve 60°C sıcaklıklarda Cu2+ iyonlarının enzimi aktive ettiği Fe2+ iyonunun ise her iki sıcaklık değerinde enzim üzerinde kuvvetli inhibisyon etkisi yarattığı gözlenmiştir. In this study was carried out purification and characterization of a serine alkaline protease from newly isolated Bacillus marmariensis GMBE 72 by TÜBİTAK-MAM-GMBE, Enzyme and Fermentation Technologies Lab. After 54 h cultivation, the culture medium was centrifuged to remove cells. The dissolved proteins in the supernatant were precipitated by the addition of ammonium sulphate to 55% saturation and DEAE-cellulose ion-exchange chromatography. Culture filtrate pH was adjusted to 6.5 before salt addition. The precipitate was collected by centrifugation dialyzed against 50 mM NaOH-glisin buffer, pH 10.5 and then loaded to a DEAE-cellulose anion-exchange column. Alkaline protease (AP) was eluted with lineer gradient of 0-0.25 mol l-1 NaCl in the pH 10.5 NaOH-Gly buffer. The peak of proteolytic activity was observed at 0.2 mol l-1 ionic strength. The enzyme was purified 17-fold by DEAE-cellulose chromatography followed by (NH4)2SO4 precipitation with 35% yield. The enzyme was showed single band protein on SDS-PAGE and molecular mass was estimated to be 24.26 kDa. Km and Vm values of the alkaline protease of the strain GMBE 72 were found to be 3.12 mg ml-1 caseine, 1.60 µmol tyrosine ml-1 min-1 respectively. The optimal temperature and pH for the proteolytic activity were 60ºC and 11.0 respectively. Enzyme activity was completely inhibited by 2 mM phenylmethylsulphonylfloride (PMSF), suggesting that the enzyme is a serin protease. Among the peptide nitroanilides and protein substrates examined, AP efficiently hydrolysed N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA and skim milk respectively. Enzyme was stable in the presence of the 2 % concentration of Tween-20, 40, 60, 80 however it was not stable in the presence of 5% H2O2 and 0.2 % sodiumdodecyl sulphate (SDS). AP activity was increased and stabilized by Cu2+ divalent metal ions at 30-60°C. Enzyme was strongly inhibited by Fe2+ ions in the same conditions Cu2+ metal ions. 253

Bu çalışmada çeşitli sıcak su, çamur ve toprak örneklerinden izole edilmiş olan bazı ekstrem termofil anaerobik bakteriler alkali proteaz aktiviteleri bakımından incelenmiştir. Test edilen 36 suş arasından Raman (Batman, Türkiye) petrol kuyusundan izole edilen, Ç olarak kodlanan ve Techirgiol (Köstence, Romanya) çamur banyosundan izole edilen, RÇ3 olarak kodlanan iki bakterinin ekstraselüler alkali proteaz enzimi üretikleri saptanmıştır. Bu enzimlerin üretim koşulları ile karakteristik özelliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Ç ve RÇ3 logaritmik gelişimlerini sırasıyla 32 ve 42. saatte tamamlamışlardır. Yapılan çalışmada Ç ve RÇ3'ün optimum gelişme sıcaklığı ve pH'ları sırasıyla 65°C, 55°C ve 9.0, 9.5 olarak belirlenmiştir. Gelişme sırasında maksimum alkali proteaz aktivitesi Ç için 42. satte 91.3 U/ml, RÇ3 için ise 46. saatte 78.5 U/ml olarak belirlenmiştir. Enzimlerin optimum sıcaklığı ve pH değeri; Ç için 70°C ve pH 9.5, RÇ3 için 65°C ve pH 9.0 olarak bulunmuştur. 70°C'de 2 saat inkübasyondan sonra Ç izolatı enzim aktivitesinin %20'sini, 65°C'de RÇ3 ise %45'ini kaybetmişlerdir. Bakteriler, Ç izolatı için, karbon kaynağı olarak maltoz, azot kaynağı olarak pepton ve kazein karışımı; RÇ3 izolatı için ise, laktoz ve soya unu içeren besiyerlerinde maksimum gelişme göstermişlerdir. Maksimum alkali proteaz üretimi Ç için, maltoz, pepton ve kazein karışımında, RÇ3 için ise laktoz ve kazein hidrolizat içeren besiyerlerinde meydana gelmiştir. Alkali proteaz aktivitesi, besiyerine 2 mM CaCl2 ilavesi ile, sırasıyla Ç için %136 ve RÇ3 %142 oranla artmıştır. Kaba enzim sıvısına, Ç için Ca2+ ve Mn2+ , RÇ3 için Fe3+ ve Co2+ iyonları ilavesi ile enzim aktivitesi artmıştır. Ç için Co2+ ve Cu2+, RÇ3 için ise Zn2+ ve Mn2+ iyonları ilavesi enzim aktivitesini azaltmıştır. EDTA ilavesi ile Ç ve RÇ3 izolatları için enzim aktivitesi sırasıyla %51 ve %45 oranına düşmüş, PMSF ilavesi ile her iki enzim aktivitesi de %90'dan daha büyük oranda inhibe olmuştur. In this study some extremely thermophilic anaerobic bacteria isolated from various hot water, mud and soil samples were examined for alkaline proteolitic activity. It has been determined that among the 36 strains tested, the isolates coded as Ç from an oil well in Raman region (Batman, Turkey) and RÇ3 from a mud bath in Techirgiol (Constanta, Romania) produced extracellular alkaline protease enzymes. The purpose of this study is to determine the production conditions and properties of the enzymes. Ç and RÇ3 isolates have completed their logarithmic growth in 32nd and 42nd hours of incubation, respectively. According to the results, the optimum growth temperature and pH values for isolates Ç and RÇ3 were 65°C, 55°C and pH 9.0, 9.5, respectively. The maximum alkaline protease activities during the growth were established as 91.3 U/ml at 42nd hour for the isolate Ç and 78.5 U/ml at 46th hour for the isolate RÇ3. The optimum temperature and pH values for enzymes have been found as 70°C, pH 9.5 for the isolate Ç and 65°C, pH 9.0 for the isolate RÇ3. After 2 hours of incubation at 70°C, isolate Ç has lost 20% of its enzyme activity, and similarly RÇ3 has lost %45 of its enzyme activity at 65°C. The isolate Ç exhibited maximum growth in the medium that contains maltose as the carbon source, peptone and casein mixture as the nitrogen source, while the isolate RÇ3 exhibited maximum growh in the medium that contains lactose and soy bean meal. The maximum alkaline protease production took place in a medium containing maltose, peptone and casein for the isolate Ç, and in a medium containing lactose with casein hydrolysate for the isolate RÇ3. Alkaline protease activity was increased to %136 and %142 levels by addition of 2 mM CaCl2 in to the growth medium for the isolates Ç and RÇ3 respectively. Enzyme activity was increased by addition of Ca2+ and Mn2+ ions to the enzyme solution for the Ç isolate, and Fe3+ and Co2+ ions for the RÇ3 isolate . Addition of Co2+ ve Cu2+ ions for Ç isolate and Zn2+ ve Mn2+ ions for the isolate RÇ3, decreased the enzyme activiy. Enzyme activities for the isolates Ç and RÇ3 were decreased to %51 and 45% respectively by addition of EDTA, while addition of PMSF inhibited the enzyme activity up to %90 for both isolates. 65

IV ÖZET Yüksek ya da düşük sıcaklık ve pH gibi koşullar altında optimal aktivite gösteren enzimler, biyoteknololojik yönden önem taşıdıkları gibi, bilimsel olarak da ilginçtirler. Deterjanlarda yüksek alkalen pH optimumları olan proteazlar tercih edilmekte, Bacillus licheniformis soyu, bu endüstriyel enzimin üretiminde yaygın şekilde kullanılmaktadır. Diğer bir Bacillus soyu olan ve gen klonlama ve ekspresyonu için yararlı bir sistem oluşturan B. subtilis ' in homolog ve heterolog proteinleri medyuma salgılaması ve patojen olmaması gibi nedenler, onu endüstriyel uygulamalar için çok ilgilenilen bir organizma kılmaktadır. Ancak genlerin klonlandığı plazmitlerin rekombinant B. subtilis kültürlerindeki kararsızlığı, endüstriyel uygulamalardaki temel problemi oluşturmaktadır. Büyüme ya da saklama sırasındaki plazmit kararsızlığından ve üretim süreci sonunda uygulanan inaktivasyon basamağına karşın spor bulundurma riskinden kaçınmak ve proteaz üretimini arttırmak üzere, B. licheniformis alkalen proteaz geni; bu çalışmanın ortak olarak sürdürüldüğü TÜBİTAK-GMBAE Enzim Moleküler Genetiği Grubu tarafından, bir E. coli plazmiti olan pUC 19 üzerine klonlanmıştır (Öztürk, S., 1, et.al.2002). B. licheniformis kökenli alkalen proteaz geninin E. co// 'deki ve B. subtilis'deki ekspresyonunun sağlanması, plazmit kararlılığının belirlenmesi ve ekspresyonun optimize edilmesi bu tez çalışmasının temel amaçlarını oluşturmuştur. pUC19 vektörü üzerinde lac promotoru altına klonlanmış olan B. licheniformis ATCC 53926 alkalen proteaz geni E. coli JM109 ve B. subtilis hücrelerine aktarılmış ve yapılan optimizasyon çalışmaları sonucunda en yüksek gen ekspresyonu E. coli JM109 soyunda, IPTG ile uyarımlı koşullarda gözlenmiş ve üretilen enzimin %60'ının kültür ortamına salgılandığı belirlenmiştir. SUMMARY Enzymes having optimal activity under extreme conditions, such as high or low temparature and pH, are not only biotechnologically important, but also scientifically interesting. Proteases that have high alkaline pH optimum are preferred as detergent additives and Bacillus licheniformis strains have been widely used in the production of these industrial enzymes. Bacillus subtilis, is a useful microorganism for gene cloning and expression in industrial applications due to its non-pathogenic character and secretion of proteins into the growht medium. However, the instability of the plasmids carrying genes of interest, in recombinant B. subtilis cultures is the major problem İn the industrial applications. In order to increase the protease production, and to get rid of plasmid instability occuring during growth or storage, and to avoid the risk of spore presence despite of inactivation step applied at the end of the production period, B. licheniformis alkaline Protease gene was cloned into the pUC19, which is an E.coli plasmid, by the Enzyme Molecular Genetics Group, TÜBİTAK, GMBAE with which collaboration was done during this thesis work (Öztürk, et al. 2002). The realization of the expression of B. licheniformis derived alkaline protease gene in E. coli and B. subtilis, the determination of the plasmid stability and the optimization of the expression are the main goals of this thesis work. Both E. coli JM109 and B. subtilis were transformed with B. licheniformis ATCC 53926 alkaline protease gene, which was cloned under the lac promoter on the pUC 19 vector. It has found that the highest gene expression level was observed in E. coli JM109 strain under IPTG-induced conditions, resultingin %60 of the enzyme produced secreted into the growth medium. 92

ÖZET Yüksek Lisans Tezi RECOMBINANT Bacillus sp. İLE ALKALİ PROTEAZ ÜRETİMİ İÇİN KOMPLEKS ÜRETİM ORTAMI TASARIMI Muzaffere YAĞIZ Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman : Prof. Dr. Güzide ÇALIK Rekombinant Bacillus licheniformis ile serin alkali proteaz (SAP) üretiminde kompleks üretim ortamının enzim aktivitesine etkisi araştırılmıştır. Laboratuvar ölçekli biyoreaktörlerde başlangıç glukoz derişiminin biyoproseste SAP aktivitesi ve mikroorganizma derişimine etkisi incelenmiş; A=748 U/cm3 olarak belirlenen maksimum SAP aktivitesine Ca=7.0 g/dm3 derişiminde ulaşılmıştır. En iyi kompleks üretim ortamının bulunması amacıyla kazein, yağı alınmış soya, mısır-altı şurubu, nişasta, hidrolizlenmiş melas ve melasın etkileri incelenmiş, A=1218 U/cm3 olarak belirlenen maksimum SAP aktivitesi Cm=30.0 g/dm3 sukroz içeren melas ile Cs=0.5 g/dm3 soya bulunan ortamda elde edilmiştir. VR=3.5 dm3 hacimli, karıştırma, pH, sıcaklık, köpük, çözünmüş oksijen derişimi kontrollü pilot ölçek biyoreaktörde kompleks üretim ortamının etkisi sınanmış; yapılan işletimde SAP aktivitesi pH, çözünmüş oksijen, mikroorganizma, sukroz ve toplam protein derişinüerinin kalma süresi ile değişimleri incelenmiş ve maksimum aktivite A=2020 U/cm3 olarak Cm=30.0 g/dm3 sukroz içeren melas bulunan kompleks ortamda gözlenmiştir. Dinamik Yöntem ile proses boyunca sıvı faz hacımsal kütle aktarım katsayısı kLa ve mikoorganizmamn oksijen tüketim hızı rC) belirlenmiştir. 2000, 115 sayfa ANAHTAR KELİMELER: Serin alkali proteaz, rekombinant Bacillus sp., kompleks ortam tasannu ABSTRACT Master Thesis DESIGN OF COMPLEX MEDIUM FOR ALKALINE PROTEASE PRODUCTION BY RECOMBINANT Bacillus sp Muzaffere YA?IZ Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemical Engineering Supervisor : Prof. Dr. Güzide ÇALIK Effect of complex medium on enzyme activity for serine alkaline protease (SAP) production was investigated by recombinant Bacillus licheniformis. In shake-flask bioreactors, effect of initial glucose concentration (Co) on SAP activity and cell concentration in the bioprocess was investigated; maximum SAP activity was obtained as A=748 U/cm3 at Cg= 7.0 g/dm3. Effect of complex media on SAP activity was investigated with casein, defatted soybean, corn-steep liquor, starch, hydrolysed sugar cane molasses and sugar cane molasses. Maximum SAP activity was obtained as A= 12 18 U/cm3 in the medium that contained molasses involving Cm=30.0 g/dm3 sucrose and Cs=0.5 g/dm3 soybean. In VR=3.5 dm3 pilot scale bioreactor with stirring rate, temperature, pH, foam and dissolved oxygen control; the variations of SAP activity, pH, dissolved oxygen, cell, sucrose and total protein concentrations were determined versus residence time and the maximum SAP activity was obtained as A=2020 U/cm3 with Cm=30.0 g/dm3 sucrose containing molasses solution. Liquid phase volumetric mass transfer coefficient kLa and oxygen consumption rate r0 were determined with the Dynamic Method. 2000, 115 pages KEY WORDS: Serine alkaline protease, recombinant Bacillus sp., design of complex medium 115

V ÖZET SUBTTLISIN (ALKALİN PROTEAZ). ÜRETİCİSİ BACILLUS TÜRÜ BAKTERİLERİN TARANMASI VE PROTEAZ AKTİVİTELERİNİN ÖLÇÜLMESİ ONMUŞ, Fatma Yüksek Lisans Tezi, Biyoloji Bölümü Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Sanver EKMEKÇİ İzmir'in farklı bölgelerinden alman toprak örneklerinden, 29 Alkalofilik Bacillus straini izole edilmiştir. Bu izolatlann Alkalin proteaz aktiviteleri araştırılmıştır.İzolat 14 en iyi alkalin proteaz üreticisi olarak belirlenmiştir. Bu izolatlar için biyokimyasal testler yapılmıştır. Alkalofilik Bacillus strainleri için hiçbir klasifıkasyon taslağı olmadığı için bu biyokimyasal testler sonucunda, bu izolatlar sadece genus seviyesinde identifiye edilmiştir. İzolatlar arasındaki benzerlikler, sayısal analiz metodlan kullanılarak belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Alkalin proteaz, Alkalofilik Bacillus, Sayısal Taksonomi vn ABSTRACT SCREENING OF THE SUBTBLISIN (ALKALINE PROTEAZ) PRODUCER BACILLUS STRAINS AND DETECTION OF PROTEAZ ACTIVITIES ONMUŞ, Fatma MSc in Biology Department Supervisor: Prof. Dr. Sanver EKMEKÇİ 29 Alkalophilic Bacillus strains were isolated from soils collected from different areas of İzmir. Alkaline proteaz activities of these isolates have been studied. Isolate 14 were detected as a best of alkaline proteaz producer. Biochemical tests have been done on these isolates. Because there is no classification task for Alkalophilic Bacillus strains, at the end of these biochemical tests, the isolates have been identified on genus level. The similarities between the isolates have been determined by using numerical analyses methods. Keywords: alkaline proteaz, alkalophilic Bacillus, numerical taxonomy 80

1 ÖZET Yüksek Lisans Ted SERİN ALKALt PROTEAZ GENİ SubC Badüta PLASMİDLERİNE KLONLANARAK REKOMBİNANT BıYOKATALİZÖR İLE ALKALİ PROTEAZ ÜRETİM I Nerml KALENDER Ankara Colvcnltesi Fen Bfflnüeri EnsötOsû Kimya M OhendbUğİ Anahtöm Dah Danışman: ProEDr. RTançcrÖZDAMAR Eş Danışman: DoçJ>r. Pınar ÇALDC 2000,232 sayfa Jflriî ProCDr. ILTunferözdamar Doc,Dr. Pmar Çalık ProtDr.Thanr Doğu ProtDr. Semra Kocabıyık ProtDr. Serpil Takaç '-ndüstrlyel enzimlerden serin alkali proteaz (SAP) Üretiminde verim ve seçlminiğuı arttırılması İrin enetik mühendisliği teknikleriyle farklı Badüus tDrierl geliştirilmesi amacıyla, yüksek SAP liretim otanslyeUne sahip olduğa bQlnen Badüus iichaûfarmis*U SAP üretiminden şortunla dan SubC geni nce pRS316 ELcoU-yeast shuttle plasmlde klonlannuş sonra da pHVI431 E.coE-Badüus shuttle ılasmlde sob-klonkuna yapılnuş ve elde edilen reknmblnant plasmld Sn6C+pHVl431, NRRL kültür nUekstyonundan getirtilen Bacillus ahei, Badüus ccrats, Badüus firmus, Badüta subtiüs, Badüus tmyfoUquefadens, Bacillus badîta, Badüus spkaerieus ve Bacilku coagulans** aktarılarak farklı «kombinan! Bacillus türleri elde edilmiştir. SAP genini taşıyan rekomblnant pîasmldin BaaBus Orlerine aktardmasutda B.coagulans dışındakilerde doğal transformasyon, Rcoagulans'te be doğal ransformasyonun başarısız olması Özerine elektroporasyon yöntemi kaUanılnusnr. Geliştirilen -ekombtnant BaaBus türleri De doğal fiadttus'lann ürettiği enzim aktivlteleri karşüaştırtldığında, SAP [eninin aktarılmasıyla SAP aktrriteslnln r-Aatef de 34 kat, r-B.cereus*to 42 kal, r-BJirmtıs'U 35 kat, -B.subala*te 33 kat, r-B.oıryloüauefadens'te 2 kat, r-B.sphaerİois'ta 101 kat ve r-Bcoagulaja't» 27 tat arttığı bulunmuştur. Genetik tekniklerle SAP üretimi Idn geliştirilen rekomblnant Bacillus türleri le labaratuvar ölçekli blyoreaktBrierde, SAP Üretim prosesi gerçekleştirilmiş ve karbon kaynağı olarak çullanılan glukozun Badüta türlerinin çoğalmasına, SAP üretimine etkisi araştırılmış, rekomblnant Vaciüus türlerinin çoğalma kinetiği, ürün ve yan-ürün dağılımları İncelenmiş; r-B.alvd/ r-ftcereuf, r- BJirmus, r-BJubtüh, T-B.amyloUquefttnetıst T-Rbadms, r-Bjphaeriats ve r-B-eoagulatts İrin sırasıyla /°532, 1073, 745, 686, 1611, 689, 822 ve 912 t'/cra* olarak belirlenen maksimum SAP akthitelerine arasıyla Cc= 10.0, 20.0, 7.0, 8.0, 20.0, 7.0, 6.0 ve 10.0 kg/m1 glukoz deriştmlerinde ulaşılmıştır. Rekombmant Badüus türlerinin çoğalma kinetiklerinin Monod Modeline oyduğa ve herWr mikroorganlzmanm proses süresince ortama salgıladığı van-urUnlerin nitelik ve nicelik açısından farklılıklar gösterdiği belirlenmiştir. Son olarak yüksek aktlvlte gösteren mikroorganizmalardan r- BJirmus De pDot Ölçekli sistemde Q»/V-=0J wm ve N-700 dk ' oksijen aktarım koşullan ve laboratuvar ölçek deneylerinde bulunan optimum koşullarda SAP üretimi gerçekleştirilerek blçek büyütmenin etkisi İncelenmiş; proses süresince çözünmüş oksijen ve pH*ın değişimi gözlenmiş, biyoreaktörden kalma süresine karşı alman örneklerle mikroorganizma derişimi, SAP aktlvitesl, girdi ve ürün derislmleri ölçülmüş ve proses boyunca dinamik yöntemle im faz baransal kütle aktarım katsayısı kıa ve mikroorganlzmanm oksijen tüketim hızı r0 belirlenmiştir. ANAHTAR KELİMELER: Serin alkali proteaz Üretimi, SubC geni, transformasyon, rekomblnant Badüus türleri, ürün dağılımları. u ABSTRACT Master Thesis ALKALINE PROTEASE PRODUCTION USING RECOMBINANT BIOCATALVST BY CLONING SERINE ALKALINE PROTEASE GENE SubC TO BadBus PLASMIDS Nerm) KALENDER Anka» University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemical Engineering Supervisor : Professor RTanceröZDAMAR Co-Supervfaor : Associate Professor Pmar ÇALIK 2000,232 pages Jury i ProtDr. ILToncer Özdamar Doc.Dr. Pmar Çalık ProCDr. Timor Doğa ProtDr. Semra Kocabryık ProtDr. Serpil Takac Recombinant Bacillus species carrying SubC gate encoding serine alkaline protease (SAP) enzyme were developed In order to Increase the yield and selectivity In bloprocess for SAP production. Thus, by using genetic engineering techniques SubC gene was amplified from the chromosomal DNA of the wild type B.üchetujbrmis by using PCR technology; and then SubC gene was first cloned in pRS316 ELcoB-yeast shuttle plasmld, then sub-cloned to pHV1431 tZcoli-Badllus shuttle vector, and transferred to BaciBus alvâ, Bacillus cereus, BacWusJumus, Bacillus subtilis. Bacillus amytoiiquefaciens, BaciBus baalus, BaciBus spbamats and Bacillus coagulans. Except B.coagulans pHV1431+lSa/ r~B.cereust r-B.firmu3t r-BaubHus* r-Bamyloliquefadens, r-B.badius, r- B.sphaericus and r-B.coagulans were obtained respectively as AB532, 1073, 745, 686, 1611, 689, 822 and 912 U/cm1; and their optimum glucose concentrations were Cq=» 10.0, 20.0, 7.0, 8.0, 20.0, 7.0, 6.0 and 10.0 kg/m1, respectively. The growth kinetics of the r-BacUlus obeyed the Monod kinetics. In the forth phase of the research programme, pUof-scale bloreactor experiments were carried out using Q/V= 0.5 wm and N= 700 rain'1 oxygen transfer conditions with r-Bfirmus under optimum conditions that are found In laboratory scale experiments. The variations of the glucose, ceU, SAP activity and concentration were determined with respect to residence time; and with the application of the dynamic method the oxygen uptake rate r0 and oxygen transfer coefficients Kl» were determined during the course of the batch-bloprocess. KEY WORDS: Serine alkaline protease production, SubC gene, transformation, recombinant Bacillus species, prod net distributions. 232

The bioprocess design parameters for serine alkaline protease (SAP) production by using a mutant of Bacillus subtilis was investiga ted; and a method for quantitative protein analysis were developed by using HPCE. Effects of pH and temperature on the bioprocess were in vestigated simultaneously with a programme at T»37,45,50,55°C and at e^ery temperature least with seven pH values in the range of pH«5-12; and the optimum values were determined as pH=10 and 55°C. Because the culture conditions that promote production of SAP and neutral prote- ase(NP) were found significantly different from each bother and from the culture conditions promoting cell growth; it was therefore essen tial to design a media in order to maintain a high cell density cultu re under conditions promoting SAP production rather then NP. Since the components of the medium regulates the SAP activity and concentration, starting from the semi -defined media in the literature a set of compo nents and their effects on the design af the media were investigated. Inorganic compounds Ca, Mg+Z and Cu+Z were increased the protease activity and SAP concentration; however Zn+Z has a negative effect. 0.25g/dnr was found as the optimum for L-serine; nevertheless, it has not much effect on enzyme activity in the defined media. It was found that fructose increased the activity and the stability of SAP; however it has an inhibitor effect on the production of NP. While pepton was increasing the concentration of SAP, yeast extract increased NP con centration. In the fifth phase of the programme, by using two alter native mediums with and without fructose the course of activity, SAP and NP concentrations were investigated. After 96h of operation, the fructose containing and the fructose free mediums produced 1.63/gdnr and 1.59g/dnr SAP, respectively. However, the NP productions were found none in the first, but 3.2g/dm3 in the latter. In the last phase, by using the best process conditions found, in a temperature, pH, foam and oxygen controlled pilot-scale reactor the results were tested during with least 50 hours of runs. KEY WORDS: Serine alkaline protease, neutral protease, production of protease, capiller electroforesis, design parametres, Bad 7 lus subtnis. İV The bioprocess design parameters for serine alkaline protease (SAP) production by using a mutant of Bacillus subtilis was investiga ted; and a method for quantitative protein analysis were developed by using HPCE. Effects of pH and temperature on the bioprocess were in vestigated simultaneously with a programme at T»37,45,50,55°C and at e^ery temperature least with seven pH values in the range of pH«5-12; and the optimum values were determined as pH=10 and 55°C. Because the culture conditions that promote production of SAP and neutral prote- ase(NP) were found significantly different from each bother and from the culture conditions promoting cell growth; it was therefore essen tial to design a media in order to maintain a high cell density cultu re under conditions promoting SAP production rather then NP. Since the components of the medium regulates the SAP activity and concentration, starting from the semi -defined media in the literature a set of compo nents and their effects on the design af the media were investigated. Inorganic compounds Ca, Mg+Z and Cu+Z were increased the protease activity and SAP concentration; however Zn+Z has a negative effect. 0.25g/dnr was found as the optimum for L-serine; nevertheless, it has not much effect on enzyme activity in the defined media. It was found that fructose increased the activity and the stability of SAP; however it has an inhibitor effect on the production of NP. While pepton was increasing the concentration of SAP, yeast extract increased NP con centration. In the fifth phase of the programme, by using two alter native mediums with and without fructose the course of activity, SAP and NP concentrations were investigated. After 96h of operation, the fructose containing and the fructose free mediums produced 1.63/gdnr and 1.59g/dnr SAP, respectively. However, the NP productions were found none in the first, but 3.2g/dm3 in the latter. In the last phase, by using the best process conditions found, in a temperature, pH, foam and oxygen controlled pilot-scale reactor the results were tested during with least 50 hours of runs. KEY WORDS: Serine alkaline protease, neutral protease, production of protease, capiller electroforesis, design parametres, Bad 7 lus subtnis. İV 141