Search

Bu çalışma, TÜBİTAK (Proje No: 112S636) ve PAÜ Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından desteklenmiştir (Proje No: 2018SABE012). Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) yüksek metastatik kapasitesinden dolayı agresif bir kanser tipidir. Nükleer Faktör Kappa B (NF-κB), malign akciğer kanseri hücrelerinde sürekli aktif bir transkripsiyon faktörüdür ve KHDAK progresyonunda hayati öneme sahiptir. Aynı zamanda, tümör baskılayıcı ve onkogen olarak fonksiyon gösteren mikroRNA’lar (miRNA’lar) dahil olmak üzere birçok genin transkripsiyonel düzenlenmesinde yer almaktadır. Bazı miRNA’ların NF-κB tarafından indüklenen gen üyeleri olarak tanımlanmasının giderek arttığı bildirilmiştir. Bu çalışma NF-κB tarafından düzenlenen yeni miRNA'ları bulmayı amaçlamıştır. NF-κB bağımlı miRNA'ların belirlenmesinde Kromatin İmmünopresipitasyon Sekans (ChIP-Seq) deneyi ve biyoenformatik analiz kullanılmıştır. Western blot analizi, kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR), lusiferaz reporter gen deneyleri miRNA'ların hedef genlerini araştırmak için gerçekleştirildi. Biyolojik aktiviteyi belirlemek için, H1299 ve A549 KHDAK hücre hatlarında transwell invazyon, migrasyon ve MTT testi yapılmıştır. miRNA ekspresyon düzeyi, metastatik tanı almış ve almamış olan KHDAK hastalarının primer tümör doku örneklerinde değerlendirildi. ChIP-Seq ve qRT-PCR deneyleri miR-548as-3p, miR-8078, miR-1915-5p, miR-621, miR-1203 ve miR-3179'un tümör nekroz faktör-α (TNF-α) aracılı NF-κB tarafından transkripsiyonel olarak düzenlendiğini gösterdi. Sonra, tümör baskılayıcı fosfataz ve tensin homolog (PTEN)’un miR-548as-3p’nin doğrudan hedefi olduğunu bulduk. Üstelik miR-548as-3p, fosfatidilinositol-3-OH kinaz (PI3K)/AKT/NF-κB yolağını ve Slug, Zeb1 ve matriks metalloproteinaz 9 (MMP9)’un dahil olduğu NF-κB ilişkili genleri aktive etmektedir. Ayrıca, miR-8078'in C2 kalsiyum bağımlı domain içeren 2 (C2CD2)’yi hedefleyerek KHDAK hücrelerinin invazyon ve çoğalmasını arttırdığını tespit ettik. miR-548as-3p ve miR-8078'in KHDAK hücrelerinin invazyonunu arttırdığını ve metastatik tanı almış olan KHDAK hastalarının tümör dokularında metastatik tanı almamışlara göre yüksek seviyede olduğunu gösterdik. Tüm bu bulgular, miR-548as-3p ve miR-8078'in, akciğer kanserinin tedavisi için yeni bir aday hedef molekül olabileceğini göstermektedir. Non-small cell lung cancer (NSCLC) is an aggressive cancer type due to high metastatic capacity. Nuclear Factor Kappa B (NF-κB) is a consistently active transcription factor in malignant lung cancer cells and has crucial significance in NSCLC progression. It is also implicated in the transcriptional regulation of many genes including microRNAs (miRNAs) that function as tumor suppressor or oncogene. It has been increasingly reported that several miRNAs defined as gene members are induced by NF-κB. The present study aimed to find novel miRNAs that are regulated by NF-κB. Chromatin Immunoprecipitation Sequencing (ChIP-Seq) experiment and bioinformatic analysis were used to determine NF-κB–dependent miRNAs. Western blot analysis, quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR), luciferase reporter gene assays were carried out to investigate the target genes of miRNAs. To determine biologic activity, transwell invasion, migration and MTT assay were carried out on H1299 and A549 NSCLC cell lines. miRNA expression level was evaluated in primer tumor tissue samples of NSCLC patients with or without metastatic diagnosis. ChIP-Seq and qRT-PCR experiments showed that miR-548as-3p, miR-8078, miR-1915-5p, miR-621, miR-1203 and miR-3179 are transcriptionally regulated by tumor necrosis factor-α (TNF-α)-mediated NF-κB. Then, we found that tumor suppressor phosphatase and tension homolog (PTEN) is a direct target of miR-548as-3p. Furthermore, miR-548as-3p activates phosphatidylinositol-3-OH kinase (PI3K)/AKT/NF-κB pathway and NF-κB-related genes including matrix metalloproteinase 9 (MMP9), Slug and Zeb1. Also, we determined that miR-8078 increases invasion and proliferation of NSCLC cells by targeting C2 calcium dependent domain containing 2 (C2CD2). We further showed that miR-548as-3p and miR-8078 increased invasiveness of NSCLC cells and was upregulated in tumor samples of NSCLC with metastatic diagnosis compared to without non-metastatic diagnosis. All these findings provide that miR-548as-3p and miR-8078 could be a new candidate target molecule for the treatment of lung cancer.

Migraine is a common disorder which manifests itself as severe headache. Migraine pathophysiology needs deeper understanding in order to develop more effective treatments. Cortical spreading depression (CSD) is the neurophysiological correlate of migraine aura. The idea that "Migraine pain emerges as a result of CSD-triggered parenchymal and subsequent meningeal sterile inflammatory response" is increasingly accepted. Formation of the inflammasome complex in neurons by CSD, activation of caspase-1 and release of high-mobility group box 1 (HMGB1) are the key events that activate the pro-inflammatory NF-kappa B cascade in astrocytes. We hypothesized that the resolution of this sterile inflammation may have a role in the spontaneous cessation of migraine headache and tested this hypothesis in male Swiss albino mice brain after single CSD introduced by pinprick. HMGB1 was found to be released immediately from the nuclei of 23±3.0% of all cortical cells (n = 3), yet not replaced within 24 hours (26±1.8%; p=0.26, n=3). We showed that HMGB1 carrying exosomes were released from neurons and detectable in the peripheral blood. It was found that the neuronal caspase-1 activity began to decrease 3 hours after CSD (1, 3 and 5 hours after CSD, active enzyme ratio was 11±3.0%, 5±0.4 and 6±1.1%, respectively; p=0.08; n=3). In nonneuronal cells, NF-kappa B subunits cRel (effective in resolution phase) and p65 (proinflammatory) were immediately activated by CSD, and within 24 hours cRel activity increased and p65 activity tended to decrease (respectively, active cell ratios 24±2.5 and 36±3.0% for cRel, 25±2.1 and 21±3.6% for p65; n=3). I-kappa B was also observed to migrate to 33±4.6% of nonneuronal nuclei after CSD (p=0.002; n=3). In nonneuronal cells, inflammation triggered by CSD appears to be regulated by a concerted action of pro- and anti-inflammatory processes. Furthermore, in 31±3.2% of neuronal nuclei cRel was constitutively present, and preliminary data suggest that p65 and cRel activity in neurons might play a role in synaptic spine restoration after CSD. In conclusion, the inflammatory response triggered by CSD begins to terminate within 24 hours by fading of neuronal caspase-1 activity, and in astrocytes, by a complex process involving anti-inflammatory c-Rel and I-kappa B activity. Single cell transcriptomics are required for further cellular details. Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi (TSA-2017-14418) TÜBİTAK (118S435) İÇİNDEKİLER Sayfa ONAY SAYFASI iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv ETİK BEYAN SAYFASI v TEŞEKKÜR vi ÖZET vii ABSTRACT viii İÇİNDEKİLER ix SİMGELER VE KISALTMALAR xii ŞEKİLLER xiii TABLOLAR xvi 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. Migren Baş Ağrısı ve Kortikal Yayılan Depresyon ile İlişkisi 3 2.2. Migren Baş Ağrısı Patofizyolojisinde Kortikal Yayılan Depresyonla Tetiklenen İnflamasyonun Yeri 5 2.3. İnflamasyonun Çözülmesi 7 2.4. Nükleer Faktör-Kappa B Ailesi 8 2.5. HMGB1 13 2.6. Eksozomlar ve KYD ile İlişkisi 15 3. GEREÇ VE YÖNTEM 18 3.1. Kullanılan Hayvanlar ve Barındırma Koşulları 19 3.2. Kortikal Yayılan Depresyon Dalgasının Oluşturulması 3.2.1. Tek KYD Oluşturulması 3.2.2. Birden fazla KYD Oluşturulması 19 20 3.3. Beyin ve Kan Örneklerinin Eldesi 21 3.4. İmmunofloresan İşaretleme 3.4.1. p65, cRel, HMGB1 ve Iba-1 İşaretlemeleri 3.4.2. p65-Neun, cRel-Neun ve I-kappa B-Neun Çifte İşaretlemeleri 3.4.3. p65-S100B ve cRel-MAP2 Çifte İşaretlemeleri 3.4.4. Aktif Kaspaz-1 İşaretlemesi 21 22 22 23 23 3.5. İmmünofloresan İşaretleme Verilerinin Sayısal Analizi 24 3.6. Nükleer Proteinlerin Ayrıştırılması 24 3.7. Doku Örneklerinin Lizat Haline Getirilmesi 25 3.8. Beyin Dokusu ve Plazmadan Nöron Kökenli Eksozomların Ayrıştırılması 3.8.1. Beyin Dokusu ve Plazmadan Eksozomların Ayrıştırılması 3.8.2. Kortikal ve Plazma Eksozomlarının Akış Sitometrisiyle Tayini 3.8.3. Plazmadan Nöron Kökenli Eksozomların Ayrıştırılması 25 25 26 28 3.9. Konsantrasyon Tayini 29 3.10. Western Blotlama ve Verilerin Sayısal Analizi 29 3.11. İmmünoelektron Mikroskopi ile HMGB1 İşaretlemesi 30 3.12. Sayısal Verilerin İstatistiksel Analizi 31 4. BULGULAR 34 4.1. HMGB1 Salıverilmesinin İmmünofloresan Işaretlemeyle Tayini 34 4.2. Total Eksozom İzolasyonu 37 4.3. Nöron Kökenli Eksozomların Periferik Kandan İzolasyonu 40 4.4. Kortikal Eksozomların HMGB1 Taşıdığının Gösterilmesi 42 4.5. Nöron Kökenli Plazma Eksozomlarının HMGB1 Taşıdığının Gösterilmesi 43 4.6. HMGB1 Salıverilmesinin İmmünoaltın Işaretlemesiyle Gösterilmesi 44 4.7. Kaspaz-1 Aktivitesinin İmmünofloresan Işaretlemeyle İncelenmesi 47 4.8. Kaspaz-1 Aktivitesinin Western Blotlama ile İncelenmesi 50 4.9. KYD ile NF-kappa B p65 ve cRel’in Hücre İçi Yer Değişimleri 53 4.10. KYD ile Tetiklenen İnflamasyonun Çözülmesinde I-kappa B’nin Yeri 69 4.11. KYD ile NF-kappa B Üyelerinin Çekirdeğe Göç Ettiğinin Nükleer Protein Lizatlarında Gösterilmesi 74 5. TARTIŞMA 76 5.1. Nöroinflamasyonun Çözülmesinde HMGB1’in Rolü 77 5.2. Nöroinflamasyonun Çözülmesinde İnflamazom Kompleksinin Rolü 81 5.3. Nöroinflamasyonun Çözülmesinde NF-kappa B’nin Rolü 82 5.4. Nöronlarda NF-kappa B’nin Sinaps Düzenlenmesindeki Rolü 85 6. SONUÇ VE ÖNERİLER 87 7. KAYNAKLAR 89 8. EKLER 96 EK-1: Tez Çalışması ile İlgili Etik Kurul İzinleri EK-2: Tez Çalışması Orijinallik Raporu 9. ÖZGEÇMİŞ 100 Migren şiddetli baş ağrısıyla kendini gösteren, sık görülen bir hastalıktır. Daha etkili tedavilerin geliştirilebilmesi için migren patofizyolojisi daha iyi anlaşılmalıdır. Kortikal yayılan depresyon (KYD), migren aurasının nörofizyolojik karşılığıdır. “KYD’nin tetiklediği, parankimal ve bunu izleyen meningeal inflamatuvar yanıt sonucunda migren baş ağrısı oluşmaktadır” görüşü literatürde giderek kabul görmektedir. KYD ile nöronlarda inflamazom kompleksinin oluşumu, kaspaz-1 aktivasyonu ve high mobility group box1’in (HMGB1) salıverilmesi astrositlerde pro-inflamatuvar nükleer faktör kappa B (NF-kappa B) yolağını aktifleştiren ana olaylardır. Çalışmamızda bu steril inflamasyonun çözülmesinin, migren baş ağrısının kendiliğinden sonlanmasında etkili olabileceği hipotezini erkek Swiss albino ırkı fare beyinlerinde iğne batırılmasıyla tek KYD tetikleyerek araştırdık. HMGB1’in KYD ile naif beyne kıyasla tüm kortikal hücrelerin %23±3,0’ının çekirdeklerinden hemen salıverildiği (n=3), 24 saat içinde ise yerine konmadığı görüldü (%26±1,8; p=0,26, n=3). Nörondan salıverilen ve periferik kana karışan eksozomların HMGB1 taşıdığı gösterildi. Nöronlardaki kaspaz-1 aktivitesinin KYD’den 3 saat sonra azalmaya başladığı saptandı (KYD’den 1, 3 ve 5 saat sonra sırasıyla aktif enzim oranı %11±3,0; 5±0,4 ve 6±1,1; p=0,08; n=3). Nöron dışı hücrelerde NF-kappa B ailesinin sırasıyla inflamasyon çözülmesinde etkili ve pro-inflamatuvar alt birimleri cRel ve p65'in KYD ile hemen aktifleştiği; 24 saat sonunda cRel aktivitesinin arttığı, p65’inkinin ise azalma eğiliminde olduğu tespit edildi (sırasıyla aktif hücre oranları 15. dakikada ve 24 saatte, cRel için %24±2,5 ve 36±3,0; p65 için %25±2,1ve 21±3,6; n=3). I-kappa B’nin de inflamasyonun tetiklenmesiyle hücrelerin %33±4,6’sında çekirdeğe göç ettiği görüldü (p=0,002; n=3). Bu bulgular sonucunda nöron dışı hücrelerde KYD ile tetiklenen inflamasyonun, inflamasyonun çözülmesinde rol oynayan süreçlerle birlikte yönetildiği düşünüldü. Ayrıca, cRel’in nöronların %31±3,2’sinde devamlı transkripsiyonel aktivite gösterdiği tespit edildi. Nöronlardaki p65 ve cRel aktivitesinin KYD sonrası sinaptik dikenlerin yapısal düzenlenmesinde etkili olabileceğine dair ön bulgular saptandı. Sonuç olarak KYD’nin tetiklediği inflamatuvar cevap, nöronlarda kaspaz-1 etkinliğinin sönmesi ve astrositlerde anti-inflamatuvar c-Rel ve I-kappa B aktivitesini içeren kompleks bir süreçle yaklaşık 24 saat içinde sonlanmaya başlamaktadır. Tek hücre transkriptom çalışmaları bu olayların hücresel detaylarını ortaya koymak için gereklidir.

Pancreatic ductal adenocarcinoma is now one of the most common causes of cancer death worldwide. K-ras mutations are present in up to 90% of pancreatic cancer cases. The expression of mutant K-ras activates the Akt/protein kinase B pathway, resulting in the activation of the nuclear factor-kappaB (NF-kB) transcriptional factor. Based on in vitro studies, constitutive NF-kB activity plays a key role in pancreatic carcinoma. NF-kB expression does not have direct effects on the overall survival of pancreatic ductal adenocarcinoma. The correlation with the positive lymph node status suggests a role in invasive properties of the tumor. Activation of NF-kB is most likely an early event in pancreatic carcinogenesis. Due to the increased activation in pancreatic cancer, NF-kB seems to be a good target for therapeutic interventions. [Archives Medical Review Journal 2015; 24(4.000): 565-577]