Search

Bitkiler uzun yıllardan beri farklı amaçlarla kullanılmaktadır. Tez kapsamında çalışılan Boraginaceae familyası üyesi Echium L. cinsi de, içermiş olduğu metabolitlerin sayısının fazlalığı nedeniyle endüstride kullanılabilir bitkilerdendir. E. italicum L.'de bulunan şikonin ve türevleri ile yağ asitlerinin üretimi ve artırımı için farklı kültürler (kotiledon yaprağı ve kök süspansiyon ile saçak kök kültürleri) oluşturulmuştur. Oluşturulan kültür hatlarına elisitasyon (+4 °C, MeJA, DMSO, ABA, AgNO3, SC Ekstraktı) uygulanarak metabolit üretiminin artırımı hedeflenmiştir. Çalışma sonucunda, en yüksek miktarda şikonin eldesi 10 µM MeJA'nın 24 saat uygulandığı saçak kök kültürlerinde tespit edilirken, en yüksek düzeylerde yağ asidi üretimi ise herhangi bir elisitasyon uygulamasının olmadığı kontrol grubu kotiledon yaprağı süspansiyon kültürlerinde elde edildi. Bununla birlikte, saçak köklere MeJA uygulaması sonucunda üretilen kültürlerden saflaştırılan Şikonin Türev-3 ekstraktı, [(İzovaleril/2-Metil Bütiril Şikonin) elisite edilmiş saçak kök kültürleri kaynaklı] meme kanseri hücre hatlarından MCF-7 ve MDA-MB-231'e uygulandı. Düşük miktarlarda denenen Şikonin Türev-3 fraksiyonu, MCF-7 ve MDA-MB-231 kanser hücre hatlarında antiproliferatif etki göstermiştir. E. italicum L.'nin in vitro kültür hatlarına metabolit üretimi için uygulanan yöntemlerin, Echium L. cinsinin yanı sıra diğer türlerde de mevcut biyoaktif bileşiklerin endüstriyel ölçekte kitlesel üretimleri için kullanılabilme potansiyeli bulunmaktadır. Plants have been used for different purposes for many years. The genus Echium L. from Boraginaceae family examined in the present study are among the plants that can be used in industry as it containes various secondary metabolites. Different cultures (cotyledone leaves, root suspension and hairy root cultures) for the production and elevation of fatty acids and shikonin with its derivatives have been initiated in E. italicum L.. Moreover, elicitation (+4 °C, MeJA, DMSO, ABA, AgNO3, SC Extract) is also carried out to increase metabolite production in these cultures. The highest amount of shikonin was determined in the hairy root cultures with 10 µM MeJA applied for 24 hours, while the highest concentrations of fatty acids was observed in the control group of cotyledon leaf suspension cultures without any elicitation. However, purified Shikonin Derivative-3 [Isovaleryl/2-Methyl Butyryl Shikonin (derived from elicited hairy root cultures)] was applied on MCF-7 and MDA-MB-231 cancer cell lines. Low amounts of shikonin Derivative-3 fraction was examined antiproliferative effect in MCF-7 and MDA-MB-231 cancer cell lines. The methods used for the production of metabolites to in vitro culture lines of E. italicum L. have the potential for the mass production of bioactive compounds found in the genus Echium L. as well as other species. 229

Enginar (Cynara scolymus L.) Asteraceae familyasına ait olup, dünyada çok geniş bir alanda yetiştiriciliği yapılmaktadır. Sahip olduğu biyoaktif bileşenler sayesinde önemini gün geçtikçe arttırmakta olup, fonksiyonel gıda olarak kabul görmektedir. Enginarda doku kültürü çalışmaları pek çok avantaj sunmaktadır. Ancak bu aşamada en önemli problem in vitro köklenmedir. Bu problemi aşabilmek amacıyla bu tez çalışması kapsamında, Bayrampaşa ve Sakız enginarları ile Olympus F1 çeşidi değerlendirmeye alınmıştır. Bu üç çeşitte başarılı bir mikroçoğaltım sürecini takiben invitro köklenme etkinliğinin arttırılması amacıyla protokol geliştirilmeye çalışılmıştır. Çalışmanın sonucunda in vitro çoğaltım ve in vitro köklenme açısından çeşitlerin besi ortamlarına verdikleri tepkilerde farklılıklar olduğu ortaya koyulmuştur.Bu tez çalışması kapsamında enginarda in vitro kallus oluşumuna yönelik araştırmalar yapılmıştır. Enginarda in vitro kallus oluşumunu takiben çeşitler bazında en etkili kallus oluşum besi ortamları belirlenmiş ve hücre süspansiyon kültürleri oluşturulmuştur. Bununla birlikte son yıllarda oldukça ilgi çekici bir konu olan elisitör uygulamalarına yönelik bir araştırma da yapılmıştır. Bu amaçla iki farklı elisitör (metil jasmonat ve kitosan), üçer farklı konsantrasyonda ve üçer farklı sürede uygulanmıştır. Çeşitler arası tepkiler değerlendirildiğinde Olympus F1 çeşidinin ülkemiz çeşitleri olan Bayrampaşa ve Sakız kadar iyi tepki vermediği tespit edilmiştir. Bayrampaşa ve Sakız için hücre süspansiyon kültürü etkinlikleri değerli bulunmuştur.Yenilebilir kısmının (başlar) fenolik bileşiklerce zengin olduğu iyi bilinmektedir. Bunun yanısıra, yaprakları bitki artığı veya atık madde olarak değerlendirilmekte ve ayrıca birçok polifenol içermektedir. Son yıllarda, enginar yapraklarının kullanımı özellikle farmasötik alanda artmış ve birçok bitkisel ilacın aktif maddesi olmuştur. Yaprak morfolojik farklılıklarına dayanarak sekonder metabolitlerin içeriğinde bir değişiklik olup olmadığını ortaya çıkarmak için yapılan bu çalışmada, Bayrampaşa, Sakız ve Olympus F1 çeşitlerinin yapraklarındaki fenolik bileşikleri ve flavonoidleri vefarklı yaprak yaşlarına göre değişimleri belirlenmiştir. Enginar yaprakları iç ve dış olarak konumlarına göre aylık olarak, 7 ay boyunca (Ekim – Nisan) toplanmış ve enginar yaprağı numuneleri kurutulup öğütüldükten sonra % 80 metanolik ekstraksiyon çözücüsü kullanılarak ekstraksiyon yapılmış ve sonra HPLC-DAD'de kantitatif olarak analiz edilmiştir. Çalışmanın bulguları, çeşitler ile iç ve dış yaprak pozisyonları arasında, ayrıca farklı aylar arasında biyoaktif bileşenlerin içeriği açısından farklılıklar olduğunu ortaya koymuştur. Çeşitler arasında Sakız enginarının, yaprak pozisyonları değerlendirildiğinde ise iç yaprakların biyoaktif bileşenler açısından ön plana çıktığı ve Mart ayının da oldukça ümitvar sayılabileceği bulunmuştur. Bu tez çalışmasının sonuçlarına dayanarak, enginar yaprağının zengin polifenolik profilinin nutrasötik ve farmakolojik uygulamalarda kullanımı için faydalı olabileceği düşünülmektedir. Artichoke (Cynara scolymus L.) belongs to Asteraceae family and is cultivated in a wide area in the world. Thanks to its bioactive components, its importance increases day by day and is accepted as functional food. Artichoke tissue culture studies offer many advantages. However, the most important problem in tissue culture studies is in vitro rooting. In order to overcome rooting problem, two artichoke cultivars, Bayrampaşa and Sakız, which are valuable for our country, and Olympus F1, wereevaluated within the scope of this thesis. Following successful micropropagation process in these cultivars, a protocol has been tried to be developed in order to increase in vitro rooting efficiency. As a result of the study, micropropagation and in vitro rooting showed based on the cultivars and the nutrient media.In this thesis, in vitro callus formation of artichokes was investigated, too. Following the in vitro callus formation in artichoke, the most effective callus growth media were determined and cell suspension cultures were established. A research on elicitor applications has also been conducted. For the purpose, two different elicitors (methyl jasmonate and chitosan) were applied in three different concentrations and three different periods. When the reactions between the cultivars were evaluated, it was found that Olympus F1 did not react as well as Bayrampaşa and Sakız. Cell suspension culture activities were found to be valuable for Bayrampaşa and Sakız. It is well known that the edible portion (heads) is rich in phenolic compounds. On the other hand, the leaves are considered to be plant waste or waste material and also contain many polyphenols. In recent years, the use of artichoke leaves has increased particularly in the pharmaceutical field and has been the active ingredient of many herbal medicines. In this study, it was aimed to evaluate the phenolic compounds and flavonoids in leaves of Bayrampaşa, Sakız and Olympus F1 cultivars and their changes according to different leaf ages. To serve this purpose, artichoke leaves were collectedon a monthly, internal and external basis during 7 months (October - April), and after artichoke leaf samples were dried and grounded, they were extracted using 80% methanolic extraction solvent and then quantitatively analyzed by HPLC-DAD.The findings of the study showed that there were differences between cultivars, inner and outer leaf positions, as well as the content of bioactive components between different months. Among the cultivars, Sakız was found to be prominent in terms of bioactive constituents when the leaf positions were evaluated, and March was quite hopeful. Based on the results of this thesis, it is thought that the rich polyphenolic profile of artichoke leaves may be useful for use in nutraceutical and pharmacological applications. 255

Vaccaria hispanica (Mill.) Rauschert (Caryophyllaceae) doğada yaygın şekilde yetişen, özellikle triterpenoid saponin ve kaliteli nişasta içeriği çok zengin bir doğal bitkidir. Bu tez çalışmasında literatürde henüz ele alınmamış bir konu olan V. hispanica'da somatik embriyogenesis ile ilgili olarak somatik embriyogenesisin ilk basamağı olan embriyojenik kallusların elde edilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla biri nişasta (Genotip A), diğeri saponin (Genotip B) içeriği yüksek iki V. hispanica genotipinin hipokotil, kotiledon, boğum arası ve yaprak eksplantları, iki grup denemede çok sayıda besin ortamında kültüre alınmıştır. Bu ortamların bazal besin ortamları I. grup kallus denemelerinde MS ve NN ortamları, II. grup kallus denemelerinde ise sadece MS ortamı olup, bazal besin ortamlarına oksin olarak 2,4-D veya NAA nın 0, 1 ve 2 mg/L ile sitokinin olarak da BA veya TDZ nin 0, 0.5, 1 ve 2 mg/L lik konsantrasyonlarından oluşan bitki gelişim düzenleyicileri (BGD) çeşitli kombinasyonlarda ilave edilmiştir. Çalışmada bu ortamların iki V. hispanica genotipine ait farklı eksplant tiplerinde; kallus (%) ve embriyojenik kallus oluşturma (%) ile çeşitli kallus özellikleri ve ayrıca kalluslardan meydana gelebilecek farklı morfolojik yapıları oluşturma üzerine etkileri araştırılmıştır.Çalışmanın sonuçlarına göre V. hispanica'nın kallus, embriyojenik kallus ve çeşitli morfolojik yapıları oluşturma yönünden çok yüksek rejenerasyon kapasitesine sahip olduğu belirlenmiştir. Bu kapasite; hiçbir hormonun kullanılmadığı kontrol ortamlarında bile çok yüksek oranda kallus, yoğun kök yapıları ve sürgün oluşması nedeniyle, büyük ölçüde V. hispanica'nın yüksek olduğu tahmin edilen içsel hormon seviyelerinden kaynaklanmaktadır. Çeşitli BGD lerin kullanıldığı tüm ortamlarda ise V. hispanica'nın hem A hem de B genotiplerinde içsel oksin düzeyinin de yüksek olması nedeniyle her iki genotipin bütün eksplantlarında oldukça yüksek oranlarda kallus meydana gelmiştir. Bu nedenle V. hispanica'da sadece kallus oluşturma yönünden belirli bir ortam önerisinde bulunmak mümkün değildir. Ancak bu kalluslara embriyojenik özellik kazandırılabilmesi için, hazırlanacak ortamlara oksin olarak 2,4-D ve sitokinin olarak TDZ nin belirli kombinasyonlarda ilave edilmesinin gerekli olduğu belirlenmiştir. Genotip A ve Genotip B'nin tüm eksplantlarında aynı anda en yüksek oranda embriyojenik kallus oluşturabilmek için önerilebilecek en etkili ortamın, MS + 2 mg/L 2.4-D + 0.5 mg/L TDZ içeriğine sahip ortam olduğu tespit edilmiştir. Çalışmada elde edilen morfolojik yapılara gelince; çoğunluğu globular aşamada en yüksek embriyo oluşumu her iki genotipte MS + 2 mg/L 2,4-D içeren ortamda meydana gelmiştir. En fazla embriyo oluşumu miktar olarak Genotip A da yaprak, Genotip B de ise kotiledon ve onu takiben yaprak eksplantlarından elde edilmiştir. En fazla sürgün oluşumu Genotip A da hem I., hem de II. grup denemelerde BGD içermeyen kontrol ortamında kültüre alınan boğum arası eksplantlarında, Genotip B de ise yaprak eksplantlarında gerçekleşmiştir. Farklı yapıdaki köklenmeler yönünden Genotip A ve Genotip B'de; en yüksek orandaki kısa kök oluşumlarının genel olarak sitokininsiz 2,4-D içeren ortamlarda, uzun ve gerçek kök oluşumlarının ise oksinsiz NAA içeren ortamlarda oluştuğu dikkat çekmiştir. Bu çalışmada elde edilen özellikle köklenmelere ait detaylı bulguların, içerik yönünden zengin V. hispanica'da ileride yapılabilek in vitro sekonder metabolit çalışmaları için de faydalı olması umulmaktadır. Vaccaria hispanica (Mill.) Rauschert (Caryophyllaceae) is a natural plant that grows widely in nature, especially rich in triterpenoid saponin and quality starch. In this thesis, it is aimed to obtain embryogenic calluses which is the first step of somatic embryogenesis related to somatic embryogenesis in V. hispanica which has not been yet studied in the literature. For this purpose hypocotyl, cotyledon, internodal and leaf explants of two V. hispanica genotypes with high content of starch (Genotype A) and saponin (Genotype B) were cultured in several culture media in two groups of trials. The basal nutrient media of these media were MS and NN media in I. group of callus experiments and only MS medium in II. group callus experiments. Plant growth regulators (BGDs) consisting of 2,4-D or NAA as auxin at 0, 1 and 2 mg/L and BA or TDZ as cytokinin at 0, 0.5, 1 and 2 mg/L of were added to the basal nutrient media in various combinations. The effects of these media on the formation of callus (%), embryogenic callus (%), different callus characteristics and morphological structures that may occur from callus were investigated in different explant types of two V. hispanica genotypes.According to the results of the study, V. hispanica has a very high regeneration capacity in terms of forming callus, embryogenic callus and various morphological structures. This capacity is largely due to internal hormone levels, which are estimated to be high in V. hispanica, due to the high rate of callus, dense root structures and shoot formation formed even in control cultures in which no hormone was used. In all cultures containing various BGDs, very high rates of callus formed in all explants of both genotypes due to the high internal auxin level of both A and B genotypes of V. hispanica. Therefore, it is not possible to propose a specific culture content in V. hispanica only in terms of callus formation. However, in order to give embryogenic properties to these calluses, it has been determined that 2,4-D as auxin and TDZ as cytokinin should be added in certain combinations. It was specified that the most effective medium was MS + 2 mg / L 2.4-D + 0.5 mg / L TDZ to produce high level of embryogenic callus in all explants of Genotype A and Genotype B.As for the morphological structures obtained in the study, the highest embryo formation mostly in the globular stage occurred in medium containing MS + 2 mg / L 2,4-D in both genotypes. The maximum embryo formation was obtained from the leaf explant in Genotype A and from the cotyledons followed by leaf explants in Genotype B. The highest shoot formation took place in the internodal explants cultured in the control cultures of both I. and II. group of experiments in Genotype A while in the leaf explants in Genotype B. In regard of different types of rooting in Genotype A and Genotype B, it was noted that the highest rate of short root formation occured mostly in the media containing 2,4-D without cytokinin while the highest long and true root formation in the media containing NAA without auxin. It is hoped that the detailed findings especially on rooting obtained in this study will be useful for in vitro secondary metabolite studies in V. hispanica, which has rich content. 104

Bu çalışmada, Echinacea pallida ve Echinacea purpurea L. türlerinde kallus ve sürgün kültürlerinin oluşturulması ile hem etkili bir rejenerasyon ve mikroçoğaltım sisteminin kurulması hem de in vitro kültür koşullarının optimizasyonu ile sekonder metabolit içeriğinin artırılması amaçlanmıştır. Araştırmada her iki türün yaprak, yaprak sapı, kotiledon ve kök eksplantlarından farklı tip ve konsantrasyonlarda büyüme düzenleyicileri içeren besin ortamlarında başarılı bir şekilde kallus uyarımı sağlanmıştır. Her eksplant tipi için en iyi kallus gelişimi; E. purpurea türünde 1.0 mg/l 2,4-D+2.0 mg/l BAP (yaprak), 1.0 mg/l NAA+0.5 mg/l TDZ (yaprak sapı), 2.0 mg/l NAA+1.0 mg/l TDZ (kotiledon), 0.5 mg/l NAA+0.5 mg/l BAP (kök) içeren ortamlarda, E. pallida türünde ise 0.2 mg/l NAA+1.0 mg/l TDZ (yaprak), 4.0 mg/l NAA+0.5 mg/l TDZ (yaprak sapı), 4.0 mg/l NAA+0.2 mg/l TDZ (kotiledon), 0.5 mg/l NAA+0.2 mg/l TDZ (kök) içeren ortamlarda sağlanmıştır. Her iki bitki türünün, dört farklı eksplant tipi, belirlenen büyüme düzenleyicilerinde 4, 6, 8 ve 10 hafta boyunca kültüre alınmış ve elde edilen kallus dokularında kaftarik asit, klorojenik asit, kafeik asit ve kikorik asit miktarları belirlenmiştir. En yüksek kaftarik asit (4.11 mg/g) ve kikorik asit (57.89 mg/g) miktarları E. purpurea L. türünün yaprak sapı eksplantlarından, klorojenik asit (8.83 mg/g) ise kök eksplantlarından 10 haftalık kültür süresi sonunda elde edilen kalluslarda tespit edilmiştir. Büyüme düzenleyicisi ve kültür süresi optimizasyonu yapılan kallus kültürlerinde, farklı azot oranlarının, farklı karbon kaynakları ve miktarlarının, farklı polietilen glikol (PEG) miktarlarının sekonder metabolit üretimi üzerine etkileri incelenmiştir. Bu uygulamalar arasında, en yüksek kaftarik asit (9.38 mg/g), klorojenik asit (0.71 mg/g), kafeik asit (0.29 mg/g) ve kikorik asit (34.77 mg/g) miktarları, 0:35 mM amonyum/nitrat oranı içeren besin ortamında 10 haftalık kültür süresi sonunda E. purpurea L. türünün kök eksplantından elde edilen kallus dokularında tespit edilmiştir. Mikroçoğaltım amacıyla, her iki türün nodal segmentlerinden farklı tip ve konsantrasyonlarda büyüme düzenleyicisi içeren ortamlarda çoklu sürgün uyarımı başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir. E. purpurea L. türünde en yüksek sürgün oluşumu farklı konsantrasyonlarda BAP ve KIN içeren ortamlarda, eksplant başına sürgün sayısı değeri ise (3.47 adet) 0.50 mg/l BAP + 0.10 mg/l NAA içeren ortamda elde edilmiştir. E. pallida türünde ise en yüksek sürgün oluşumu BAP ve BAP'ın NAA ile kombinasyonlarını içeren ortamlarda, eksplant başına sürgün sayısı ise (2.45 adet) 0.50 mg/l BAP + 0.50 mg/l NAA içeren ortamda elde edilmiştir. Her iki türde elde edilen sürgünler, kök uyarımı için farklı konsantrasyonlarda (0.5, 1.0 veya 1.5 mg/l) ve tiplerde oksin (NAA, IBA, IAA) içeren ve içermeyen besin ortamlarında kültüre alınmıştır. En yüksek köklenme oranları, E. purpurea L.'da %29, E. pallida'da ise %6 olmak üzere büyüme düzenleyicisi içermeyen ortamlarda elde edilmiştir. Elde edilen sürgünlerde farklı tip ve konsantrasyonlardaki büyüme düzenleyicilerinin sekonder metabolit miktarlarına etkileri belirlenmiştir. E. purpurea L. türünde, en yüksek kaftarik asit (7.41 mg/g) 4.0 mg/l BAP, klorojenik asit (5.04 mg/g) 2.0 mg/l KIN, kikorik asit miktarları ise (46.27 ve 45.22 mg/g) sırasıyla 4.0 mg/l KIN+0.5 mg/l NAA ve 2.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l NAA içeren ortamlardan elde edilen sürgünlerde tespit edilmiştir. E. pallida türünde ise en yüksek kaftarik asit (6.43 mg/g) 4.0 mg/l BAP+0.1 mg/l NAA, klorojenik asit (3.47 mg/g) 0.50 mg/l BAP+0.10 mg/l NAA, kikorik asit miktarı ise (24.83 mg/g) 1.0 mg/l BAP içeren ortamlarda elde edilen sürgünlerde tespit edilmiştir. Bu tez çalışmasının sonucunda, önemli iki ekinezya türünde kallus ve sürgün kültürleri aracılığıyla etkili ve tekrarlanabilen rejenerasyon ve mikroçoğaltım protokolleri belirlenmiş olup, aynı zamanda in vitro koşullarda kafeik asit türevlerinin içeriğinin artırılmasına yönelik kültür koşullarının optimizasyonu ve farklı uygulamaların etkileri belirlenmiştir., In this study, it was aimed to increase the secondary metabolite content by the formation of callus and shoot cultures in Echinacea pallida and Echinacea purpurea L. species, both by establishing an effective regeneration and micropropagation system and by optimization of in vitro culture conditions. Callus induction was achieved in media containing growth regulators of different types and concentrations from leaf, petiole, cotyledon and root explants of both species. Best callus development for each explant type; In E. purpurea species, 1.0 mg/l 2,4-D+2.0 mg/l BAP (leaf), 1.0 mg/l NAA+0.5 mg/l TDZ (petiole), 2.0 mg/l NAA+1.0 mg/l TDZ (cotyledon), 0.5 mg/l NAA + 0.5 mg/l BAP (root) was provided in the media, while E. pallida species 0.2 mg/l NAA+1.0 mg/l TDZ (leaf), 4.0 mg/l NAA+0.5 mg/l TDZ (petiole), 4.0 mg/l NAA+0.2 mg/l TDZ (cotyledon), 0.5 mg/l NAA+0.2 mg/l TDZ (root) was provided in the media. Both plant species were cultured for 4, 6, 8 and 10 weeks in growth regulators with four different explant types and the amounts of caftaric acid, chlorogenic acid, caffeic acid and chicoric acid were determined in the callus tissues obtained. The highest amounts of caftaric acid (4.11 mg/g) and chicoric acid (57.89 mg/g) were obtained from petiole explants of E. purpurea L., the amount of chlorogenic acid (8.83 mg/g) was determined in callus obtained from root explants after 10 weeks of culture. The effects of different nitrogen ratios, different carbon sources and amounts, different amounts of polyethylene glycol (PEG) on secondary metabolite production were investigated in callus cultures with growth regulator and culture time optimized. Among these applications, the highest amounts of caftaric acid (9.38 mg/g), chlorogenic acid (0.71 mg/g), caffeic acid (0.29 mg/g) and chicoric acid (34.77 mg/g), 0:35 mM ammonium/nitrate rate of nutrient medium containing 10 weeks of culture at the end of E. purpurea L. species obtained from the root explants were determined in callus tissues. For the purpose of micropropagation, multiple shoot induction was successfully performed in media containing growth regulators of different types and concentrations from nodal segments of both species. The highest shoot formation in E. purpurea L. species was obtained in media containing different concentrations of BAP and KIN and the number of shoots per explant (3.47) was obtained in medium containing 0.50 mg/l BAP+ 0.10 mg/l NAA. In E. pallida species, the highest shoot formation was obtained in the medium containing BAP and BAP with NAA, and the number of shoots per explant (2.45) was obtained in the medium containing 0.50 mg/l BAP + 0.50 m /l NAA. The shoots obtained from both species were cultured in media with and without auxin (NAA, IBA, IAA) in different concentrations (0.5, 1.0 or 1.5 mg/l) and types for root induction. The highest rooting rates were obtained in 29% of E. purpurea L. and 6% of E. pallida without growth regulators. The effects of growth regulators of different types and concentrations on secondary metabolite amounts were determined in the shoots obtained. In E. purpurea L., the highest caftaric acid (7.41 mg/g) 4.0 mg/l BAP, chlorogenic acid (5.04 mg/g) 2.0 mg/l KIN, and the chicoric acid amounts (46.27 and 45.22 mg / g) were respectively, 4.0 mg/l KIN + 0.5 mg/l NAA and 2.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l NAA. In E. pallida species, the highest amount of caftaric acid (6.43 mg/g) 4.0 mg/l BAP + 0.1 mg/l NAA, chlorogenic acid (3.47 mg/g) 0.50 mg/l BAP+0.10 mg/l NAA and chicoric acid (24.83 mg/g) 1.0 mg/l BAP. As a result of this thesis, effective and reproducible regeneration and micropropagation protocols were determined by using callus and shoot cultures of two important echinacea species, and the effects of different conditions and optimization of culture conditions for increasing the content of caffeic acid derivatives in vitro were determined.

Bu çalışmada, Türkiyenin Batı Anadolu Bölgesinde doğal olarak yetişen Campanulaceae familyasına ait, kritik düzeyde tehlike altında olan endemik bitki Campanula tomentosa türüne ait tohumların çimlendirilmesi ve kallus kültürü eldesi için en uygun besin ortamının tespiti amaçlanmıştır. Tohumdan üretilerek yapılan doku kültürü araştırmalarına başlandığında yetiştirilen steril fidelerden alınan eksplantlar öncelikle kallus oluşturma ve daha sonra da bu kallusların rejenerasyona yönlendirilmeleri şeklinde olacaktır Araştırmanın birinci aşamasında; Temel besin ortamlarının çimlenme üzerine etkisinin araştırıldığı çalışmalarda besin ortamlarının tohumların çimlenme oranları üzerinde farklı etkileri vardır.Bundan dolayı tohumların çimlenme oranları arasındaki farkı karşılaştırmak için materyal olarak kullanılan tohumlar besi ortamlarına ekilmeden önce yüzey sterilizasyonları yapılan steril tohumların bitki büyüme düzenleyicisi (BBD) içermeyen 4 farklı besi ortamına ( yüksek tuz oranı içeren MS ve ½ MS , yüksek nitrat azotu içeren B5 ve olgunlaşmamış embriyoların kültüründe kullanılan N6) kültüre alınarak çimlendirilmesi sağlanmış ve bu şekilde besi ortamlarının etkisi ayrı ayrı test edilmiştir. Fitohormon yokluğunda çimlenmenin en yüksek olduğu ortam ½ MS (%33 çimlenme başarısı) olmuştur. İkinci aşamada : Steril fidelerden alınan yaprak eksplantları kallus başlatma çalışmaları için büyüme düzenleyicilerinden oksin türevi olan 1α-Naftalen asetikasit (NAA)'nın farklı konsantrasyonlarını (0.1 mg/l ve 3 mg/l) ve sitokinin türevi olan 6-Benzilaminopürin (BAP)'ın farklı konsantrasyonlarını (1 mg/l ve 4 mg/l) içeren MS, ½ MS , N6 ve B5 besi ortamlarına aktarılarak besi ortamlarında kültüre alınmıştır.Besi ortamı ve bitki büyüme hormonlarının kallus gelişimine olan etkisine bakılmıştır.Yaprak eksplantları için 0.1mg/L NAA + 4 mg/L BAP destekli B5 VE 0,1 mg/L NAA+4 mg/L BAP ve 3 mg/L NAA + 1 mg/L BAP ile desteklenmiş MS besi ortamlarının en iyi kallus gelişim görüldüğü ortamlar olduğu belirlenmiştir. Sürgünlerin morfolojik gelişiminin iyi olmadığı kallus yapısının gevşek ve soluk yeşil- kahverengi olduğu (2.tip kallus) , 0.1mg/L NAA ve 4 mg/L BAP içeren MS ve B5 besin ortamlarında gelişen kallusların daha canlı ,yapıca sert ve sağlıklı (1. tip kallus) olduğu gözlenmiştir. Çalışmanın üçüncü aşamasında; Besi Ortamlarına göre I. Tip ve II. Tip kallus oluşum oranları (%) ve farklı ortamların kallus kalitesine etkisi araştırılmıştır. Çalışmanın dördüncü aşamasında; Proliferasyon çalışmaları NAA ve BAP içerikleri sabit tutulan 4 farklı ortamda kültür hazırlanmıştır. Sürgün proliferasyonu için en uygun besi ortamı sürgün gelişiminin daha hızlı ve sağlıklı olması açısından MS'tir., İn this research it is aimed to determine establishment the most suitable nutrition media to get callus culture from seeds of Campanula tomentosa,that was critically endangered endemic plant belongs to Campanulaceae family which naturally grown in Turkey's West Anatolia region. In the first phase of study; Studies that searching effect of basic medias on germination, nutrition medias were different effects over seeds germination rate.Therefore compare the differrences between seeds germination rate on 4 basic nutrition medias seeds of Campanula tomentosa, used as a material.Sterile seeds were germinated based culture on MS ,1/2 MS , N6 , B5 medium free plant growth regulators (PGRs) .The highest germination rate was seen in ½ MS (%33success) media without plant growth regulator. In the second phase of study; İn tissue culture if study is about producing callus , using seeds to obtain explants from sterilized and healthy seedlings will be success to rejenerate. To produce callus ,explants transfer and cultured in MS, ½ MS , N6 and B5 medias with plant growth regulators in different concentrations (0.1 mg/l ve 3 mg/l)of 1α-Nafthalene aseticacid(NAA) that are used as a auxin and different concentrations (1 mg/l ve 4 mg/l) of benzylaminopurine (BAP) that are used as a cytokinin.Although more shoots were obtained in 1 mg/l BAP medium,growth of shoots were not good, callus structure was not compact and the colour of callus was yellowish or brown( 2nd type of callus) .In addition , 4 mg/l BAP of medium , growth of shoots were good , strong,compact and faded green-white colour(1st type of callus). In the third phase of study; effects of different nutrition medias on callus structure and colour and producing 1st type of callus and 2nd type of callus (%) In the fourth phase of study; Four different types of medium was prepared to investigate effects of NAA and BAP to proliferation processes. The best media for shoot development was MS.

Bu çalışmada Kaman 1 ve Kaman 5 ceviz çeşitlerinin koltukaltı tomurcuklarından basit ve etkili bir klonal mikroçoğaltım protokolü geliştirilmeye çalışılmıştır. Eksplantların yüzey sterilizasyonu %70'lik etanolde 1 dk. ve Tween 20 ilave edilmiş % 0.2'lik HgCl2'de 5 dk. tutularak sağlanmıştır. Kararmayı önlemek için ortama 100 mg/l Askorbik Asit, 100 mg/l Sitrik Asit ve 100 mg/l Askorbik Asit+100 mg/l Sitrik Asit ilavesi ve 3, 24 ve 48 saat alt kültüre alma uygulamaları denenmiştir. Kaman 1 ve Kaman 5 ceviz çeşitlerinin her ikisinde de en etkin uygulamanın 100 mg/l AA + 100 mg/l SA+ 48 saat alt kültür olduğu gözlemlenmiştir. Sürgün rejenerasyonu çalışması kapsamında BAP'ın 0.5, 1.0 ve 1.5 mg/l dozları ile IBA'nın 0.5 ve 1.0 mg/l dozlarının 6 farklı kombinasyonu denenmiştir. Eksplant başına maksimum sürgün sayısı 0.5 mg/l BAP + 0.5 mg/l IBA içeren MS besin ortamından K1 ve K5 cevizlerinde sırasıyla 2.00 ve 0.67 adet olarak elde edilmiştir. Sürgünler 4 mg/l IBA içeren solüsyonunda 5 dk. bekletildikten sonra 1:1 oranında torf:perlit karışımı içeren saksılara dikilmiş ancak sürgünlerden köklenme sağlanamamıştır. An efficient protocol for in vitro clonal propagation of Kaman 1 and Kaman 5 varieties was achieved using axillary buds. The explants were treated with 70% ethanol for 1 min. followed by surface sterilization using one drop per 100 ml of Tween 20 of 0.2 % HgCl2 for 5 min and rinsing with sterile distilled water for 3×5 min. The explants to avoid development of phenolic acids based chlorosis were cultured for 3, 24 and 48 hours using 100 mg/l of ascorbic acid, 100 mg/l citric acid, 100 mg/l ascorbic acid plus 100 mg/l citric acid in MS medium. The explants were cultured on MS medium containing 0.5 and 1.0 mg/l of IBA plus 0.5, 1.0 and 1.5 mg/l of BAP for shoot regeneration in 100 mg/l ascorbic acid plus 100 mg/l citric acid treatment for 48 hours. The maximum number of 2.00 and 0.67 shoots on Kaman 1 and Kaman 5 walnut varieties per explant were obtained on MS medium containing 0.5 mg/l BAP plus 1.0 mg/l IBA respectively. Well developed sturdy shoots were rooted by conditioning with 4.0 mg/I IBA for 5 min. and transferred to sterile soil mixture containing peat:perlite in pots for growth development and acclimatisation. 70

Bu çalışmada, 15- ve 30-günlük arpa (Hordeum vulgare L. cv. Zafer-160) kallusları arasındaki genetik ve epigenetik varyasyonlar sırasıyla IRAP ?Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism? ve MSRF ?Methylation Sensitive Restriction Fingerprinting? teknikleri ile araştırıldı. Dört-günlük arpa fideleri kontrol olarak seçildi. Olgun embriyolar, 4 mg l-1 Dicamba içeren Murashige ve Skoog (MS) besiyerinde 30 gün boyunca kültüre alındı. Embriyogenik kalluslar, rejenerasyon için 0.5 mg l-1 trans-zeatin riboside içeren MS besiyerine aktarıldı. Dokular, BARE-1 ve Sukkula gibi arpa retroelementlerinden geliştirilen dört IRAP kombinasyonu ile analiz edildi. BARE-1 polimorfizmi gözlenmesine rağmen; Sukkula elementinin hareketsiz kaldığı gözlendi. Olgun embriyolardan kallus gelişimi sırasında, epigenetik varyasyonların en önemlilerinden biri kabul edilen metillenme değişimlerinin meydana geldiği anlaşıldı. MSRF verilerine göre, 30-günlük kallus DNA'sı, fide DNA'sına göre daha fazla metillenmiştir.Çalışmanın ikinci kısmında, Homobrassinolide (HBL)'in, kallus gelişimine ve rejenerasyona etkileri araştırıldı. Otuz-günlük kalluslar, bir ay boyunca, iki farklı konsantrasyonda (0.5 µM and 1 µM) 22(S),23(S)-Homobrassinolide (HBL) uygulamasına maruz bırakıldı. Hem kontrol (hormon içermeyen) hem de HBL grupları, taze ağırlık miktarında ve SOD aktivitesinde azalmaya; total çözünebilir protein ve DNA içeriğinde artışa yol açtı. 0.5 µM grubu en yüksek değerleri oluştururken; en düşük SOD aktivitesi, 1 µM HBL grubunda gözlendi. HBL uygulamasının 14-15. gününde, HBL-uygulanmış ve uygulanmamış kalluslar, yeşil hücre kümeleri ve sürgün şeklinde rejenerasyon belirtileri gösterdi. Kontrol ve özellikle 0.5 µM hormon gruplarındaki kallusların, daha büyük, sert ve ufalanabilir oldukları gözlendi. En uzun sürgünlerin, 0.5 µM grubundaki kalluslarda geliştiği görüldü. Kontrol ve 0.5 µM hormon gruplarındaki metillenme değişimleri, MSRF tekniği ve iki primer kombinasyonu ile araştırıldı. HBL uygulamasının, genomda metillenme artışına yol açtığı görüldü.Çalışmada elde edilen sonuçlara göre, kallus gelişimi sırasında genetik ve epigenetik varyasyonlar meydana gelmektedir. HBL metillenmede artışa yol açmakta ve rejenerasyonu olumlu etkilemektedir. Bu çalışmanın, doku kültürü kaynaklı varyasyonların anlaşılmasında ve HBL'nin, doku kültürlerinde kullanılmasında yararlı olması beklenmektedir. In this study, genetic and epigenetic variations between 15- and 30-days-old barley (Hordeum vulgare L.) calli were investigated with IRAP ?Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism? and MSRF ?Methylation Sensitive Restriction Fingerprinting? techniques, respectively. Four-days-old seedling was used as control. Mature embryos were cultured on Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with 4 mg l-1 dicamba for 30 days. Embryogenic calli were transferred to regeneration medium, MS containing 0.5 mg l-1 trans-zeatin riboside. Tissues were analyzed with four IRAP primer combinations, which were designed according to barley retroelements BARE-1 and Sukkula. BARE-1 polymorphisms were detected however, Sukkula elements remained inactive. Methylation alterations, which is one of the most prominent epigenetic variations, occurred during callus formation from mature embryos. According to MSRF data, 30-days-old callus DNA was much more methylated than seedling DNA.In the second part of the study, effects of Homobrassinolide (HBL) on callus growth and regeneration were investigated. Thirty-days-old calli were treated with two different concentrations (0.5 µM and 1 µM) of 22(S),23(S)-Homobrassinolide for one month. Both control (hormone-free) and HBL media caused decrease in fresh weight and SOD (EC 1.15.1.1) activity and increase in total soluble protein and DNA content. 0.5 µM group exhibited the highest protein and DNA levels and the least decrease in fresh weight. However, minimum SOD activity was measured in 1 µM HBL group. At the 14-15th day of the HBL treatment, HBL-treated and non-treated calli started to regenerate. Green cell clusters and as well as shoots were observed. Control and especially 0.5 µM group calli were bigger, harder and more friable than 1 µM group calli. Longest shoots developed in 0.5 µM group. Methylation alterations between control and 0.5 µM group were investigated with MSRF with two primer combinations. HBL treatment caused increase in genome-wide methylation.Data indicate that genetic and epigenetic variations occurred during callus formation. HBL treatment caused increase in methylation and favoured regeneration. These results may be useful for exploration of tissue culture-induced variation and use of HBL in tissue cultures. 104

Bu tezde, Catharanthus roseus (L.) G. Don bitkisinin in vitro kallus biyokütle eldesi ve bu biyokütle üzerinde ortam ozmotik stresinin etkileri farklı kimyasal maddeler kullanılarak araştırılmıştır. In vivo ve in vitro yetiştirilen fidelerden alınan bitki parçaları MS ortamında kallus eldesinde kullanılmıştır. Daha sonra bu kalluslardan alt kültürlemeler yolu ile elde edilen biyokütlelerin ozmotik stres koşulları altındaki ağırlıkları ve morfolojik yapıları karşılaştırılmıştır. Biyokütle eldesinde MS ortamı ile birlikte kullanılan bitki büyüme hormonlarının en uygun kombinasyonu 5mg/mL NAA ve 2 mg/mL BAP olarak belirlenmiştir. Elde edilen 18 haftalık kallus biyokütlelerine, Polietilenglikol (PEG) 4000, D-Mannitol ve hidrojen peroksit gibi bitki üzerinde ozmotik stres oluşturduğu bilinen kimyasal maddeler ile uygulamalar yapılmıştır. Biyokütlelerin altkültürlemeleri birer haftalık aralar ile yapılmıştır. Stres faktörü uygulamaları ile oluşan biyokütle değişimleri ile ilgili ölçümler ve hesaplamalar yapılarak, biyokütlede oluşan morfolojik değişimler de incelenmiştir. Biyokütle değişimleri ikinci altkültürden itibaren hidrojen peroksit'in 100 mM ve 200 mM konsantrasyonlarında sırası ile kontrole göre %33 ve 37 azalma gösterirken, üçüncü altkültürden itibaren PEG-4000'in %5'lik konsantrasyonunda %19, %10'luk konsantrasyonunda %20, D-Mannitol'ün %5'lik konsantrasyonunda %10, %10'luk konsantrasyonunda ilk haftadan itibaren toplamda %18'lik azalma göstermiştir. In this thesis, production of in vitro callus biomass of Catharanthus roseus (L.) G. Don and effects of osmotic stress on biomass was investigated with several materials. Explants were obtained from in vivo and in vitro seedlings and used for callus production in callus MS medium. Subsequently, biomass obtained from subcultures of these callus were investigated for their weight and morphologic structure under different osmotic stress conditions. Plant growth regulators; 5mg/mL NAA and 2 mg/mL BAP with MS medium is identified as the best combination for biomass production.In this thesis, PEG-4000, D-Mannitol and hydrogen peroxide which are known to induce osmotic stress on plants were used on 18 weeks old callus biomass. Subcultures of biomass were generated in one week intervals. Variations on the biomass as a result of stress factor applications were measured and calculated while morphological features were also observed.Subsequent to second subcultures biomass on 100 mM and 200 mM concentrations of hydrogen peroxide showed %33 and %37 reduction. Following third subcultures %5 and %10 concentrations of PEG-4000 caused %19 and %20 reductions. Following third subcultures %5 D-mannitol caused %10 reduction and %10 concentration of D-mannitol caused %18 reduction just after first week. 85

Flavonoit, iridoit ve alkaloit içeren Gentiana olivieri Griseb. (Gentianaceae), antidiyabetik, antidepresan ve sindirime yardımcı olarak kullanılmaktadır. Flavonoit (izoorientin ile izoviteksin) ve iridoitlerin (gentiopikrozit ile svertiamarin) varlığı G. olivieri kallus ve süspansiyon kültürlerinde araştırıldı. G. olivieri tohumları 0.1 mM GA3 içeren Woody Plant Medium (WPM)'da çimlendirildi. Kallus üretmek için ilk deneme için yaprak ve kök eksplantları, ikincisi için sadece yaprak eksplantı kullanıldı. Her iki denemede de eksplantlar 60 günlük aseptik fidelerden alındı. Eksplantlar 1 mg/l Naftalen Asetik Asit (NAA) ile 0.5 mg/l Benzil Amino Purin (BAP) veya 0.2-0.5 mg/l Kinetin içeren Murashige ve Skoog (MS) ile WPM ortamlarına ekildi. Kültürler ilk denemede karanlıkta; ikincide ise 16/8 aydınlık/karanlık fotoperiyotta 3000 lux ışık şiddetinde inkübe edildi. İkinci denemeden elde edilen kalluslardan süspansiyon kültürleri kuruldu. Kallus kültürlerinden 3 alt kültür ve süspansiyon hücrelerinden 25 gün boyunca üretilen sekonder metabolitler; kalitatif ve kantitatif olarak araştırıldı.Sekonder metabolit üretiminde süspansiyon kültürü, kallus kültürüne göre daha verimli bulundu. 1 mg/l NAA ve 0.5 mg/l BAP içeren WPM ortamında 20. günde süspansiyon kültüründe gelişen hücrelerde izoviteksin miktarı G. olivieri ekstresinden 10 kat fazla bulundu (0.408 mg/g). 1 mg/l NAA ve 0.5 mg/l Kinetin içeren WPM ortamında 1. alt kültürde gelişen kallus hücreleri izoorientin üretimi için en iyi sonucu verdi (0.492 mg/g). İridoit yapıda olduğu düşünülen fakat gentiopikrozit ve svertiamarin ile eşleşmeyen maddeler üretildi. Gentiana olivieri Griseb. (Gentianaceae), which contains flavonoid, iridoid and alkaloid, has been used as antidiabetic, antidepressant and digestive aid. Existence of flavonoids (isoorientin and isovitexin) and iridoids (gentiopicroside and swertiamarin) were investigated in callus and suspension culture of G. olivieri. Seeds of G. olivieri were germinated in Woody Plant Medium (WPM) with 0.1 mM GA3. Leaf and root explants were used for the first experiment while only leaf explant was used for the second to produce callus. In both experiments, explants were obtained from 60 days old aseptic plantlets. Explants were sown onto Murashige & Skoog Medium (MS) and WPM including 1 mg/l Naphtalane Acetic Acid (NAA) with 0.5 mg/l Benzyl Amino Purine (BAP) or 0.2-0.5 mg/l Kinetin. Cultures were incubated in the dark in the first experiment while the second was in 3000 lux at 16/8h light/dark photoperiod. Suspension cultures were established from calli which obtained from the second experiment. Secondary metabolites, which were produced from callus cultures during 3 sub-culture and from suspension cultures during 25 days, were investigated qualitatively and quantitatively.Suspension cultures were found more productive than callus cultures in terms of secondary metabolite production. Quantity of isovitexin, grown in WPM suspension cultures containing 1 mg/l NAA and 0.5 mg/l BAP in the 20th day, was found ten times more from G. olivieri extract (0.408 mg/g). Callus cells which grown in WPM containing 1 mg/l NAA and 0.5 mg/l Kinetin in the first sub-culture were found to be more succesful for isoorientin production (0.492 mg/g). Substances, which were considered to have iridoidal structure but had no match with gentiopicroside and swertiamarin, were produced. 136

Bu çalışmada, Juniperus oxycedrus L. bitkisinin nod ve yaprak eksplantlarına çeşitli bitki doku teknikleri uygulanarak kararma sorunun üstesinden gelinmiştir. Böylece in vitro koşullarda kallus üretimi farklı kültür ortamları kullanılarak denenmiştir ve kallus kültürlerinin kurulması sağlanmıştır.Juniperus oxycedrus L. bitkisinin nod ve yaprak eksplantları makro/mikronütrient içerikleri değiştirilmiş Schenk and Hildebrant besin ortamında kültüre edilmişlerdir. Buna ek olarak, ortama eksplantların kararmasını azaltmak için 1000 mg/l aktif karbon ve 100 mg/l askorbik asit eklenmiştir.0.5 mg/l Benzil Amino Pürin (BAP) + 1 mg/l 2,4-diklorofenoksi asetik asit (2,4D) (ortam 5) + 0.5 mg/l Kinetin (KIN) ve 1 mg/l BAP + 1 mg/l 2,4D + 0.5 mg/l KIN (ortam 6) büyüme düzenleyici kombinasyonlarıyla desteklenen modifiye SH ortamında kültüre alınan yaprak ve nod eksplantlarından en etkili kallus teşviki sağlanmıştır. Ayrıca, bu büyüme düzenleyicilerini içeren modifiye SH ortamı, sürgün gelişimini de teşvik etmiştir. En iyi sürgün oluşumu, nod eksplantlarının kültüre edildiği 6. indüksiyon ortamı olan modifiye SH + 1 mg/l BAP + 1 mg/l 2,4-D + 0.5 mg/l Kinetin'de gözlenmiştir.Yetişkin Juniperus oxycedrus L. bitkisinin yaprak ve odun kısımlarından alınan örneklerin kimyasal içerikleri ile kallusların içerikleri kıyaslanmıştır. Kalitatif analiz ile alkaloit, saponozit, flavonoid ve tanen varlığı araştırılmıştır. Sekonder metabolit miktarına bağlı olarak +'dan ++++'ya kadar değerlendirmeler yapılmıştır. Juniperus oxycedrus L. bitkisinin yapraklarının içeriğinde flavonoid (++++), saponozit (+++) ve tanen (++++) varlığı belirlenmiştir. Kallus ve odunsu kısımların fitokimyasal içeriği flavonoid (++++) ve tanen (++++) olarak belirlenmiştir. Nodal and leaf explants of Juniperus oxycedrus subsp. oxycedrus were applied by different plant tissue techniques for overcoming browning problem. Therefore, in vitro callus production was examined by using different culture media and establishment of callus cultures was achieved.Nodal and leaves of Juniperus oxycedrus L. cultured on changing of concentration of micro/macronutrients of modified Schenk and Hildebrant media. In addition, 1000 mg/l active carbon and 100 mg/l ascorbic acid were added to reduce browning of explants.Most effective caulogenesis from leaf and nodal explants cultured on modified SH supplied with two growth regulator combinations; 0.5 mg/l BAP + 1 mg/l 2,4D (medium 5) + 0.5 mg/l KIN and 1 mg/l BAP + 1 mg/l 2,4D + 0.5 mg/l KIN (6. induction medium). Furthermore, shoot regeneration was induced by modified SH medium with these growth regulators. Nodal explants cultured on 6. modified SH medium in which The best shoot formation were observed.The Phytochemical content of leaves and wood samples collected from mature Juniperus oxycedrus L. was compared with the phytochemical chemical content of callus grown in vitro conditions. Qualitative analysis were revealed that alkaloids, flavonoids, saponins, and tannins. Depending on amount of secondary metabolite, it rated from + to ++++. In contents of leaves of Juniperus oxycedrus L. were determined presence of flavonoid (++++), saponin (+++) and tannin (++++). Phytochemical contents of woods and callus were determined as flavonoid (+) and tannin (++++). 59

ÖZET BAZI ÜZÜM ÇEŞİTLERİNİN VE ASMA ANAÇLARININ KALLUS KÜLTÜRÜ YOLUYLA IN VITRO REJENERASYONU ÜZERİNDE ARAŞTIRMALAR Arzu BAYIR Yüksek Lisans Tezi, Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. H. İbrahim UZUN Nisan 2003, 74 Sayfa Bu çalışmada, ülkemizde yetiştiriciliği yapılan Sultani Çekirdeksiz ve Cardinal üzüm çeşitleri ile Kober 5BB ve Fercal asma anaçlarının kallus kültürü yoluyla rejenerasyon olanakları araştırılmıştır. Bu amaçla yürütülen çalışmalar 2000-2002 yıllan arasında, Akdeniz Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Doku Kültürü Laboratuvarı ile Araştırma ve Uygulama Bağında yürütülmüştür. Araştırmada kullanılan çeşit ve anaçlara ait in vitro koşullarda yetiştirilmiş bitkilerden alınan yaprak ayası, yaprak sapı ve internodyum eksplantlan değişik bitki büyüme düzenleyici maddelerin (BAP, 2,4-D, Kinetin) eklendiği Murashige ve Skoog (MS) (1962) besi ortamlarında kültüre alınmıştır. Denemede kullanılan tüm çeşitler için 1 mg/l BAP'ın 0.1 mg/1 yada 1 mg/1 2,4-D ile olan kombinasyonları, anaçlar içinde 0.2 mg/1 BAP'ın 0.1 mg/1 2,4-D ile olan kombinasyonu kallus oluşumu ve kallus boyutu bakımından en iyi sonucu vermiştir. 2,4-D ve Kinetin'in birlikte kullanıldığı uygulamalarda ise Sultani Çekirdeksiz, Cardinal üzüm çeşitleri ve Kober 5BB asma anacı için 1 mg/1 2,4-D+ 1 mg/1 Kinetin uygulaması, Fercal asma anacı içinde 0.1 mg/1 2,4-D+l mg/1 Kinetin uygulaması kallus oluşumu ve kallus boyutu bakımından uygun bulunmuştur. Kallus kültürü sonucu elde edilen bitkiler toprağa aktarılmıştır. ANAHTAR KELİMELER: Asma, kallus kültürü, rejenerasyon. JÜRİ: Prof. Dr. H. İbrahim UZUN (Danışman) Prof. Dr. Kenan TURGUT Doç. Dr. A. Naci ONUS ABSTRACT STUDIES ON THE IN VITRO REGENERATION OF GRAPE CULTIVARS AND GRAPEVINE ROOTSTOCKS BY CALLUS CULTURE Arzu BAYIR Adviser: Prof. Dr. H. İbrahim UZUN M. Sc. Thesis, Horticultural Department April 2003, 74 Pages In this research, Sultani Çekirdeksiz and Cardinal grape cultivars and Kober 5BB and Fercal grapevine rootstocks, which are grown in Turkey, were investigated for their potential to be regenerated in in vitro conditions by callus culture technique. The experiments were conducted in the Tissue Culture Laboratory of the Department of Horticulture, Faculty of Agriculture, Akdeniz University between 2000 and 2002. Leaf lamina, petiole and internode explants were excised from plantlets that were grown in vitro conditions and cultured in Murashige ve Skoog (MS) (1962) medium supplemented with different plant growth regulators (BAP, 2,4-D, Kinetin). Media containing 1 mg/1 BAP in combination with 0.1 mg/1 or 1 mg/1 2,4-D was found to be the best for callus culture and callus dimension of all cultivars while 0.2 mg/1 BAP in combination with 0.1 mg/1 2,4-D of all rootstocks. MS medium supplemented with 1 mg/1 2,4-D+l mg/1 Kinetin combination was found to be optimal for callus culture and callus dimension of Sultani Çekirdeksiz, Cardinal grape cultivars and of Kober 5BB rootstock while 0.1 mg/1 2,4-D+l mg/1 Kinetin combination of Fercal rootstock. Plantlets derived from callus culture were transferred to soil. KEY WORDS: grapevine, callus culture, regeneration. COMMITTEE: Prof. Dr. H. İbrahim UZUN Prof. Dr. Kenan TURGUT Assoc. Prof. Dr. A. Naci ONUS II 74

90 3. After determining that, germination rate increased as the embryo length increased, it was found out that survival ratio and whole plant forming ratio were affected by male or female parent (cultivar) used in the crosses, nutrient medium, and the interaction of these two factors, when the trials were established only with the embryos obtained from the 2nd and the 3rd racemes, in the crosses with L. pimpinellifolium. 4. Generally speaking, the embryos obtained from the reciprocal crosses between L. pimpinellifolium and Ontairo 7710 gave the highest ratios of survival and whole plant formation, whereas those obtained from the crosses with cv. Tivoli gave the lowest. 5. Both survival and whole plant forming ratios of embryos obtained from the crosses with L. pimpinellifolium were higher in DMS medium compared with HLH medium. 6. The interaction between the cultivars used as male or female parent in the trials and nutrient medium also affected the survival and whole plant forming ratios. In general, the embryos obtained from the crosses with Ontario 7710 and P. 19 gave the best result on DMS medium. Nevertheless, Ontario 7710 x HLH combination also determined to have high survival ratio, when L. pimpinellifolium was the female parent. 7. When the plantlets obtained after the crosses with L. pimpinellifolium were taken to outdoor conditions at 2 different stages, it was observed that the transfer of plantlet at smaller stage gave better result. With an overall view, almost all cultivars had an adaptation rate of over 50%. 8. No fruit could be obtained from the crosses in which L. peruvianum was the female parent; fruit may be obtained when it was the male parent, but the seeds aborted. The diameter of these fruits and the size of the excised seeds were measured, and a correlation was determined between them. Seed size also increased as the fruit diameter increased. This shows us the viability in this type of seeds goes on. 9. Attempt was made to obtain plantlets from the seeds whose embryos were aborted, due to the reasons stated beforehand. In the first trial carried out with this purpose, 140 seeds whose embryos were aborted were cultured and in the second 178 such seeds were cultured. Nearly two months after the culture of seeds on the medium reported by Thomas and Pratt (1981); and at the end of the cytological observation, 10% diploid, 5.7% triploid plants were determined in the first trial, and 12.4% diploid, 8.4% triploid in the second. In these trials, the seeds obtained from the crosses using cvs. Ontario 771091 and P. 19 were again determined to give good result. According to these results, this method was determined as promising with respect to obtaining hybrid plant in the interspecific crosses of L. esculentum x L. pemviannm.90 3. After determining that, germination rate increased as the embryo length increased, it was found out that survival ratio and whole plant forming ratio were affected by male or female parent (cultivar) used in the crosses, nutrient medium, and the interaction of these two factors, when the trials were established only with the embryos obtained from the 2nd and the 3rd racemes, in the crosses with L. pimpinellifolium. 4. Generally speaking, the embryos obtained from the reciprocal crosses between L. pimpinellifolium and Ontairo 7710 gave the highest ratios of survival and whole plant formation, whereas those obtained from the crosses with cv. Tivoli gave the lowest. 5. Both survival and whole plant forming ratios of embryos obtained from the crosses with L. pimpinellifolium were higher in DMS medium compared with HLH medium. 6. The interaction between the cultivars used as male or female parent in the trials and nutrient medium also affected the survival and whole plant forming ratios. In general, the embryos obtained from the crosses with Ontario 7710 and P. 19 gave the best result on DMS medium. Nevertheless, Ontario 7710 x HLH combination also determined to have high survival ratio, when L. pimpinellifolium was the female parent. 7. When the plantlets obtained after the crosses with L. pimpinellifolium were taken to outdoor conditions at 2 different stages, it was observed that the transfer of plantlet at smaller stage gave better result. With an overall view, almost all cultivars had an adaptation rate of over 50%. 8. No fruit could be obtained from the crosses in which L. peruvianum was the female parent; fruit may be obtained when it was the male parent, but the seeds aborted. The diameter of these fruits and the size of the excised seeds were measured, and a correlation was determined between them. Seed size also increased as the fruit diameter increased. This shows us the viability in this type of seeds goes on. 9. Attempt was made to obtain plantlets from the seeds whose embryos were aborted, due to the reasons stated beforehand. In the first trial carried out with this purpose, 140 seeds whose embryos were aborted were cultured and in the second 178 such seeds were cultured. Nearly two months after the culture of seeds on the medium reported by Thomas and Pratt (1981); and at the end of the cytological observation, 10% diploid, 5.7% triploid plants were determined in the first trial, and 12.4% diploid, 8.4% triploid in the second. In these trials, the seeds obtained from the crosses using cvs. Ontario 7710 91 and P. 19 were again determined to give good result. According to these results, this method was determined as promising with respect to obtaining hybrid plant in the interspecific crosses of L. esculentum x L. pemviannm.90 3. After determining that, germination rate increased as the embryo length increased, it was found out that survival ratio and whole plant forming ratio were affected by male or female parent (cultivar) used in the crosses, nutrient medium, and the interaction of these two factors, when the trials were established only with the embryos obtained from the 2nd and the 3rd racemes, in the crosses with L. pimpinellifolium. 4. Generally speaking, the embryos obtained from the reciprocal crosses between L. pimpinellifolium and Ontairo 7710 gave the highest ratios of survival and whole plant formation, whereas those obtained from the crosses with cv. Tivoli gave the lowest. 5. Both survival and whole plant forming ratios of embryos obtained from the crosses with L. pimpinellifolium were higher in DMS medium compared with HLH medium. 6. The interaction between the cultivars used as male or female parent in the trials and nutrient medium also affected the survival and whole plant forming ratios. In general, the embryos obtained from the crosses with Ontario 7710 and P. 19 gave the best result on DMS medium. Nevertheless, Ontario 7710 x HLH combination also determined to have high survival ratio, when L. pimpinellifolium was the female parent. 7. When the plantlets obtained after the crosses with L. pimpinellifolium were taken to outdoor conditions at 2 different stages, it was observed that the transfer of plantlet at smaller stage gave better result. With an overall view, almost all cultivars had an adaptation rate of over 50%. 8. No fruit could be obtained from the crosses in which L. peruvianum was the female parent; fruit may be obtained when it was the male parent, but the seeds aborted. The diameter of these fruits and the size of the excised seeds were measured, and a correlation was determined between them. Seed size also increased as the fruit diameter increased. This shows us the viability in this type of seeds goes on. 9. Attempt was made to obtain plantlets from the seeds whose embryos were aborted, due to the reasons stated beforehand. In the first trial carried out with this purpose, 140 seeds whose embryos were aborted were cultured and in the second 178 such seeds were cultured. Nearly two months after the culture of seeds on the medium reported by Thomas and Pratt (1981); and at the end of the cytological observation, 10% diploid, 5.7% triploid plants were determined in the first trial, and 12.4% diploid, 8.4% triploid in the second. In these trials, the seeds obtained from the crosses using cvs. Ontario 771091 and P. 19 were again determined to give good result. According to these results, this method was determined as promising with respect to obtaining hybrid plant in the interspecific crosses of L. esculentum x L. pemviannm. 111