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Additional file 2 Table S2. Observed mutations in APC,TP53 and KRAS genes.

Additional file 4 Figure S2. Apoptosis assay. The HT29 and SW480 cell lines did not show any changes in the apoptosis’ rates (A) and cell viability (B).

Additional file 5 Table S3. Enrichment of signaling pathways analysis.

Additional file 3 Figure S1. Relative expression of the ETV4 gene after its silencing in HT29 and SW480 CRC cell lines. The silencing was efficient with p

INTRODUÇÃO: o prognóstico e o tratamento dos pacientes com câncer colorretal são baseados na análise anatomopatológica, destacando-se a análise dos linfonodos. O número de linfonodos identificados depende da eficiência da equipe cirúrgica e do empenho do patologista. A marcação dos tumores com nanquim por colonoscopia é utilizada com a finalidade de facilitar a identificação do local da lesão pelo cirurgião. No entanto, além de marcar o local do tumor, a marcação com nanquim parece corar os linfonodos, o que poderia facilitar sua identificação pelo cirurgião e pelo patologista. OBJETIVO: avaliar se a marcação do tumor leva ao aumento do número de linfonodos dissecados. CASUÍSTICA E MÉTODO: foram estudados 22 pacientes com câncer de reto operados após tratamento neoadjuvante com rádio e quimioterapia. Foram distribuídos aleatoriamente em 2 grupos: I- marcação com nanquim; IInão submetidos à marcação. RESULTADOS: no grupo marcado, foram identificados em média 8,18 linfonodos por paciente, com 0,72 positivos e distância média do tumor à borda anal foi de 6,27 cm. No grupo não marcado, foram identificados em média 5,54 linfonodos, com 1,6 positivos e com distância da borda anal de 5,09 cm. O grupo marcado apresentou mais linfonodos identificados, mas sem diferença estatística. CONCLUSÃO: a marcação com nanquim, após a neoadjuvância, não aumenta o número de linfonodos identificados em pacientes com tumores de reto. INTRODUCTION: The prognosis and treatment of colorectal cancer are based on anatomopathological analysis, particularly on lymph node evaluation. The number of lymph nodes identified depends of the of the surgery team' efficiency and the pathologist's commitment. Tattooing tumor with India ink in colonoscopy facilitate the identification of the lesion site by the surgeon. However, besides marking the tumor site, India ink tattooing also seems to mark lymph nodes, which may make their identification easier by the surgeon and pathologist. OBJECTIVE: To evaluate whether tumor tattooing results in an increase in the number of lymph nodes analyzed. METHOD: 22 patients with rectal cancer submitted to surgery after neoadjuvant chemoradiotherapy were studied. The patients were randomly assigned to either of two groups: a) India ink tattooing b) no-tattooing RESULTS: The India ink tattooing group presented an average of 8.18 lymph nodes, with a mean of 0.72 positive results and mean distance of the tumor from the anus verge of 6.27 cm. The control group presented an average of 5.54 lymph nodes per patient, with a mean of 1.6 positive results, and a mean distance of the tumor from the anus verge of 5.09 cm. More lymph nodes were identified in the India ink tattooing group, however, without any statistical difference. CONCLUSION: India ink tattooing after neoadjuvant therapy does not contribute to increase the number of lymph nodes identified in patients with rectal tumor. Tese (Doutorado)

Orientadores: Ângela Cristina Malheiros Luzo, Joaquim Murray Bustorff-Silva Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: As fístulas enterocutaneas (FE) são de difícil cicatrização e manejo, associam-se a sepse, desnutrição, distúrbios hidroeletrolíticos, dentre outros. O processo de cicatrização ocorre de maneira coordenada, sendo que fatores de crescimento (VEGF/FGF/TGF-?/PDGF) e citocinas (IL/TNF-?/IFN-?) estão diretamente ligados e apresentam importantes funções nos processos de cicatrização e inflamação. A síntese e degradação da matriz extracelular (MEC) estão ligadas ao reparo de feridas, formação de fibrose crônica, morfogênese e invasão e metástase de tumores. As células-tronco mesenquimais (MSCs) têm alta capacidade proliferativa, podendo se diferenciar em várias linhagens celulares, apresentando ação imunomodulatória e efeito parácrino, podendo melhorar o processo de cicatrização. Em estudo anterior, dissertação de mestrado, foi realizada a caracterização das AT-MSCs na 4ª passagem celular e também a comprovação, através de microscopias, de que as AT-MSCs têm capacidade de aderir a fios de sutura, permanecendo viáveis e proliferando. Estes fios foram utilizados em modelo animal de FE do ceco e promoveram uma melhor e mais eficaz cicatrização, num menor tempo. Já o atual estudo, tem como principal objetivo avaliar e compreender, do ponto de vista histopatológico, como o processo de cicatrização de FE ocorreu em modelo animal idêntico ao estudo anterior, após o tratamento com fios de sutura contendo AT-MSCs aderidas. As AT-MSCs foram obtidas através do procedimento de lipoaspiração estética de tecido adiposo, realizada em indivíduos sadios, após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. O tecido adiposo foi submetido ao processo de digestão com colagenase. Na 4ª passagem foram gotejadas 1x106 AT-MSCs nos fios de sutura de 4-0 poliglactina e logo em seguida foi adicionada a cola de fibrina (20uL Fibrinogênio, 30uL Trombina e 10uL Cloreto de Cálcio) para ajudar na adesão das células nos fios de sutura. O experimento animal utilizou ratos Wistar (25 animais) distribuídos em 3 grupos: Grupo controle (GC ¿ 5 animais), Grupo fístula sem AT-MSCs (GF ¿ 5 animais) e Grupo fístula com AT-MSCs (GF/AT-MSCs ¿ 15 animais). O GC não sofreu nenhum tipo de lesão e foi sacrificado com 21 dias. No GF o fio de sutura utilizado para formar a fístula foi um fio de sutura sem adesão de AT-MSCs, sendo este grupo acompanhado e sacrificado com 21 dias. Já no GF/AT-MSCs o fio de sutura utilizado para formar a fístula continha 1x106 AT-MSCs aderidas. Este grupo foi subdividido em grupos de 7, 14 e 21 dias (5 animais em cada), dias em que os animais foram sacrificados. Essa divisão foi realizada para acompanhar como ocorreu a cicatrização nas diferentes fases deste processo. Após a exposição do ceco foi realizada enterotomia de 5mm, sendo então realizada a sutura da abertura da parede abdominal (superfície interna da pele) com 4 pontos separados com 4-0 poliglactina. A região do ceco do GC e a região onde se encontravam as fístulas dos GF e GF/AT-MSCs foram coletadas e fixadas em Bouin, passando logo em seguida pelas etapas de processamento do material. Algumas lâminas foram coradas com Hematoxilina e Eosina (HE) e outras seguiram o protocolo de imunohistoquímica para os marcadores MMP-2, MMP-9, COL3A1, COL1, VEGF, TLR4, TNF-? e IL-6. Os resultados histopatológicos demonstraram uma melhor recuperação histológica e arquitetônica, muito semelhante ao GC (animais sadios) das fístulas dos animais do GF/AT-MSCs com 21 dias. Nos grupos GF/AT-MSCs 7 e 14 dias o processo inflamatório foi intenso principalmente na região submucosa, com redução no GF/AT-MSCs 21 dias. As análises imunohistoquímicas demonstraram que houve uma troca de colágeno tipo III para tipo I ao longo do processo de cicatrização, com uma imunomarcação moderada para VEGF, denotando presença de neoangiogênese, com redução importante no grupo GF-AT-MSCs 21 dias. O MMP-2 apresentou baixa marcação no GC, com aumento muito significativo no GF/AT-MSCs 7 dias e uma queda gradativa nos grupos GF/AT-MSCs 14 e 21 dias, demonstrando a tentativa de uma remodelação tecidual inicial (7 dias) e uma queda importante quando essa remodelação foi alcançada. Já no grupo GF/AT-MSCs 21 dias encontramos alta marcação da MMP-9, podendo estar relacionada com o aumento da migração celular causada pela modulação das MSCs. Encontramos baixa marcação da IL-6 no GC e moderada nos demais grupos, podendo estar relacionados com o trauma causado pela lesão, mesmo o grupo 21 dias apresentando uma melhor cicatrização e queda de processo inflamatório. Já no TLR4 observamos baixa marcação no GC com aumento gradativo nos grupos GF/AT-MSCs 7, 14 e 21 dias. O aumento da expressão do TLR4 pode estar relacionado com a modulação causada pelas AT-MSCs no intuito de mediar a liberação de PGE2 que sinalizaria para os receptores e prostanóides, aumentando a secreção de IL-10 pelos macrófagos e diminuindo a migração/proliferação de neutrófilos para o local da lesão, resultados estes compatíveis com o histopatológico encontrado. O TNF-? apresentou baixa imunomarcação no GC, com um aumento nos grupos GF/AT-MSCs 7 e 14 dias e uma queda significativa no grupo GF/AT-MSCs 21 dias, corroborando com os resultados histopatológicos do processo inflamatório. Assim, podemos concluir que houve uma melhor cicatrização no GF/AT-MSCs 21 dias, sendo que as AT-MSCs desempenharam um papel imunomodulador importante neste processo Abstract: Digestive fistulas (DF) are difficult to resolve and surgical failure is frequent. They are responsible for electrolyte disturbances, infections, sepsis, skin lesions, gastrointestinal bleeding, intestinal obstruction and malnutrition. The healing process is related to cellular, molecular and biochemical events, acting and working to regenerate the damaged tissue. Stem cells are characterized by the ability to differentiate into different lineages and by their great capacity of proliferation and self-renewal. Recent studies have shown that stem cell therapy could represent a new approach in this area. Besides their great capacity of proliferation and differentiation to other lineages Mesenchymal stromal cells (MSCs) have also immunomodulatory properties, being easily obtained from adipose tissue (AT). In a previous study, we demonstrated that AT- MSCs could be attached into suture filaments. These filaments were used in the treatment of an animal model with enterocutaneous fistula, similar to those of Crohn¿s disease and have provided a better and faster fistula healing with statistical significance. The actual study aimed evaluate what were the mechanisms involved that have lead to this better healing, when suture filaments with attached AT-MSCs were used. Adipose tissue was obtained from healthy patients submitted to stetical lipoaspirate procedures (50mL) which have previously assigned a written informed consent form. Adipose tissue will be submitted to collagenase digestion, the acquired cells were cultured in a specific medium. At the 4th passages, AT-MSCs, 1x106 cells, were fixed in the suture filament (4-0 Poly Vicryl / Poliglactine 910) by adding fibrin glue (20uL Fibrinogen, 30uL Thrombin and 10uL Calcium Chloride). The animal experiment was carried out with Wistar rats (25 animals) which were divided in three groups; control group (CG - 5 animals) where the animals didn¿t suffer any injury and were analyzed in the 21th day; fistula group (FG), where the lesion was performed with suture filaments without stem cells (AT-MSCs) and the fistula group/AT-MSCs where suture filaments with added AT-MSCs were applied being analyzed in the 7th, 14th and 21th days, 5 animals each). The cecal fistula was created by incising the cecum and suturing the opening to the surgical wound subcutaneously with four separate stitches that were carried out with or without 1x106 AT-MSCs attached in the filaments (FG and F-AT-MSCs groups). After the sacrifice the samples were collected and fixed with Bouin. Then, they were processed due to histological slides being carried out. Some slides were stained with Hematoxylin and eosin and others submitted to immunohistochemistry protocols for MMP-2, MMP-9, COL3A1, COL1, VEGF, TLR4, TNF-? e IL-6 marker. The results showed a better architectural and histological healing in the 21th (F-AT-MSCs group). An intense inflammatory process, in the submucosal area was detected in the 7th and 14th days (F-AT-MSCs) that diminished in day 21. Immunohistochemistry results demonstrated that the collagen type III was exchanged to collagen type I improving the healing process. Moreover, a moderate VEGF immunoreactivity was achieved in these areas in the 7th and 14th days showing the presence of neoangiogenesis, with a great reduction on day 21. There was a weak immunoreactivity of MMP-2 in the CG, otherwise, in the F-AT-MSCs group, a great reactivity was detected in the 7th day that gradual decrease in the 14th and 21th days. These finding probably were related to an initial tendency to tissue-remodeling, and have decreased in day 21 due to the end of the process. The MMP-9 results were similar to MMP-2 in the initial phase (7th day) increasing the immunoreactivity up to the day 21. This high reactivity maybe related to a persistent cell migration to this area due to MSCs immunomodulation. The IL-6 results showed also a weak immunoreactivity in the CG, as expected. The other F-AT-MSCs groups demonstrated a moderate IL-6 reactivity, as a result of the acute trauma phase, even in the 21th day, besides the injured area displayed at that time a complete healing with decrease of the inflammatory process. TLR4 results also demonstrated a weak reactivity in the CG increasing gradually in the F-AT-MSCs groups. The TLR4 increase may be due to the MSCs immunomodulation property leading to PGE2 releases that would signaling to E prostanoid receptors increasing secretion of the anti-inflammatory cytokine IL-10 by macrophages, preventing neutrophils from migrating/proliferating into the injured tissue areas. The TNF-? results were weak in the CG, showing at the F-AT-MSCs group a gradual increase in the first 14th days, decreasing in day 21. These data may explain the histological findings which demonstrated a low number of neutrophil with great reduction of inflammatory reaction. The 21th day (F-AT-MSCs group) results demonstrated that AT-MSCs with their immunomodulatory properties were able to induce a better healing and might be useful to repair digestive fistulas Doutorado Fisiopatologia Cirúrgica Doutor em Ciências CAPES 01-P-3369/2017

Orientadores: Raquel Franco Leal, Luciana Rodrigues de Meirelles Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A doença de Crohn (DC) está associada com as vias patogênicas complexas envolvendo alterações nos mecanismos de apoptose. Recentemente, o tecido adiposo mesenterial (TAM) tem sido associado com a etiopatogenia DC, uma vez que é verificado um aumento da espessura do tecido adiposo mesenterial e envolvimento circunferencial da alça intestinal próximo à área intestinal afetada. Entretanto, não há estudos do mecanismo de apoptose no TAM na DC. Desta forma, o objetivo desse estudo foi avaliar apoptose na mucosa intestinal e no TAM de pacientes com DC, além de correlacionar estes achados com o estudo morfométrico dos adipócitos neste tecido. Casuística e Métodos: Foram estudadas amostras de mucosa intestinal e TAM de 10 pacientes com DC ileocecal e de 8 pacientes sem doenças inflamatórias intestinais (controles). A apoptose foi avaliada pelo ensaio de TUNEL e correlacionada com a análise histológica e morfométrica dos adipócitos. Determinou-se a análise transcripcional e proteica de uma seleção de genes e proteínas relacionadas com o mecanismo de apoptose. Resultados: O ensaio de TUNEL mostrou menor número de células em apoptose na DC, quando comparado com os grupos controles, tanto na mucosa intestinal quanto no TAM. Além disso, o número de adipócitos em apoptose (TUNEL) correlacionou significativamente com a área e perímetro destas células. A análise transcripcional e proteica revelaram níveis de transcritos e de proteína Bax significativamente mais baixos na mucosa intestinal de DC, em comparação com os respectivos controles; sendo que os baixos níveis de Bax foram encontrados na lâmina própria e não no epitélio intestinal; não houve diferença na expressão de Bax no TAM. Além disso, maior nível de Bcl-2 e baixo nível de Caspase 3 foram vistos no TAM de pacientes com DC. Conclusão: A alteração da apoptose no TAM pode explicar as características morfológicas singulares deste tecido na DC, que podem estar implicadas na fisiopatologia da doença Abstract: Crohn¿s disease (CD) is associated with complex pathogenic pathways involving defects in apoptosis mechanisms. Recently, mesenteric adipose tissue (MAT) has been associated with CD ethiopathology, since adipose thickening is detected close to the affected intestinal area. However, there are no studies concern apoptosis pathways in MAT of CD. Therefore, the aim of this study was to evaluate apoptosis in the intestinal mucosa and MAT of patients with CD, besides to correlate these findings with the morphometricstudy of the adipocytes from MAT.Patients and Methods: Samples of intestinal mucosa and MAT from 10 patients with ileocecal CD and from 8 non-inflammatory bowel diseases patients (controls) were studied. Apoptosis was assessed by TUNEL assay and correlated with the adipocytes histological morphometric analysis. The transcriptional and protein analysis of selected genes and proteins related to apoptosis were determined. Results: TUNEL assay showed fewer apoptotic cells in CD, when compared to the control groups, both in the intestinal mucosa and in MAT. In addition, the number of apoptotic cells (TUNEL) correlated significantly with the area and perimeter of the adipose cells in MAT. Transcriptomic and proteomic analysis reveal a significantly lower transcript and protein levels of Bax in the intestinal mucosa of CD, compared to the controls; low protein levels of Bax were found localized in the lamina propria and not in the epithelium of this tissue. Furthermore, higher level of Bcl-2 and low level of Caspase 3 were seen in the MAT of CD patients. Conclusion: The defective apoptosis in MAT may explain the singular morphological characteristics of this tissue in CD, which may be implicated in the pathophysiology of the disease Doutorado Fisiopatologia Cirúrgica Doutora em Ciências