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Agradecimentos: The authors thank the Superintendence of the Technical Scientifc Police of the State of Sao Paulo for kind donation of data, and the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES—Projeto INSPEQT, Edital No. 16/2020), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, Processo 2021/09857-8) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científco e Tecnológico (CNPq) for the fnancial support Abstract: MDA-19 or BZO-HEXOXIZID (N'-[(3Z)-1-(1-hexyl)-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-ylidene]-benzohydrazide), in a more recent nomenclature, was first synthesized in 2008 as a selective type-2 cannabinoid receptor (CB2) agonist due to its potential to treat neuropathic pain. In Brazil, this substance was identified in a series of 53 apprehensions between September 2021 and February 2022. Nevertheless, what intrigues toxicologists is that BZO-HEXOXIZID does not exert significant type-1 cannabinoid receptor (CB1) agonism—which is responsible for the well-known psychoactivity of ?-9-tetrahydrocannabinol. Thus, the objective of this work is to report the first apprehension and identification of BZO-HEXOXIZID in Brazil and to discuss pharmacologically the possible reasons why a CB2 agonist has been incorporated to the illicit market. Suspected seized samples were sent to the Laboratory of the Scientific Police of the State of Sao Paulo. After the screening, samples were confirmed for the presence of BZO-HEXOXIZID using chromatography gas—mass spectrometry, Fourier-transform infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance techniques. Of the 53 samples analyzed, 25 contained only BZO-HEXOXIZID and 28 with mixtures, of which 11 with the CB1 agonist ADB-BUTINACA. Other substances were found in association such as cocaine and caffeine. BZO-HEXOXIZID was detected in a series of seized materials for the first time in Brazil. Nevertheless, there are still unanswered questions regarding the use of this selective CB2 agonist as a drug of abuse COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ Aberto

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O esmagamento de nervo isquiático de ratos neonatos simula a axonotmese obstétrica, levando à significativa morte de neurônios motores e sensitivos, o que permite a avaliação de efeitos neuroprotetores de novas moléculas, como as relacionadas ao sistema endocanabinoide, espontaneamente ativado em resposta à injúria. Dessa maneira, é possível que o Canabidiol (CBD), através da ativação do sistema endocanabinoide, leve à melhora da resposta regenerativa. O presente trabalho investigou o potencial neuroprotetor do canabidiol e sua ação através de receptores canabinóides após lesão periférica em ratos neonatos. Para isso, ratos neonatos da linhagem Wistar com dois dias de vida, foram divididos nos seguintes grupos experimentais: esmagamento do nervo isquiático e tratamento com veículo (grupo veículo); esmagamento e tratamento com CBD (grupo CBD); esmagamento e tratamento com AM 251 (inibidor de CB 1) + CBD (grupo CBD + AM 251), esmagamento e tratamento com AM 630 (inibidor de CB 2) + CBD (grupo CBD + AM 630), esmagamento e tratamento com AM 251 (grupo AM 251), esmagamento e tratamento com AM 630 (grupo AM 630) e esmagamento e tratamento com AM 251 + AM 630 (grupo AM 251 + AM 630). A sobrevivência de motoneurônios, 5 dias e 8 semanas após a lesão, mostrou que o tratamento com CBD aumenta a sobrevivência neuronal em ~54%, tanto 5 dias quanto 8 semanas após a injúria. Os demais grupos experimentais mostraram maior preservação de motoneurônios que o grupo Veículo porém, quando bloqueados ambos os receptores, a sobrevivência foi igual a obtida pelo tratamento com CBD. A longo prazo, apenas o bloqueio de CB 1 reverteu o efeito positivo do CBD. O bloqueio de receptores canabinoides aumenta a morte de neurônios sensitivos, tanto por apoptose quanto devido à lesão. Embora o tratamento com CBD não tenha efeito neuroprotetor no gânglio sensitivo, ele atenua a morte neuronal causada pelo bloqueio dos receptores canabinoides. O tratamento com CBD também preservou ~35% das sinapses no corno ventral e este efeito foi parcialmente revertido pela inativação de CB 2. Os tratamentos somente com os antagonistas mostraram preservação sináptica igual ao grupo veículo. Corroborando com esses resultados, a reação microglial na fase aguda também foi reduzida em 62% pelo tratamento com CBD, sendo maior nos grupos que receberam tratamento somente com os antagonistas de receptores canabinoides. Adicionalmente, o tratamento com CBD ou com AM 251 + AM 630 reduziu a astrogliose reativa 5 dias após lesão. A expressão de transcritos gênicos para receptores CB 1 foi maior no Veículo. Adicionalmente, tanto a administração de CBD sozinho quanto combinado com os antagonistas de receptores CB 1 e CB 2, resultou no aumento da expressão de CB 2 em relação ao controle, sendo, porém, ainda menor quando comparada ao Veículo. Já no gânglio espinal, o tratamento com CBD + AM 630 aumentou os níveis de CB 1, enquanto que o tratamento com CBD + AM251 diminuiu os níveis desse receptor. Ainda, detectamos que não houve diferença estatística na expressão de neurotrofinas na medula espinal, tanto 5 quanto 15 dias após a lesão, nos grupos que receberam a administração de CBD. Porém, a administração dos antagostistas de receptores canabinoides, sozinhos ou em conjunto, reduziram a expressão de BDNF. Já no gânglio, o tratamento CBD + AM 630 aumentou e o tratamento com CBD + AM 251 reduziu a expressão dos fatores neurotróficos, sendo que, quinze dias após a lesão somente o GDNF ainda manteve os níveis elevados, principalmente no grupo CBD. Por fim, a análise da recuperação motora funcional, mostrou que 8 semanas após a lesão o grupo CBD apresentou melhor recuperação em relação ao grupo CBD + AM251. Como um todo, os resultados mostram que o CBD é neuroprotetor, aumentando a sobrevivência neuronal e reduzindo a reação glial após axotomia. Da mesma maneira, a ação seletiva de receptores canabinoides pode resultar em neuroproteção, mesmo na ausência do CBD Abstract: Sciatic nerve crush in neonatal rats mimics the obstetric axonotmesis, leading to an extensive death or motor and sensory neurons, enabling the evaluation of neuroprotective effects of new molecules, such as the ones related to endocannabinoid system, which is spontaneously activated in response to injury. Thus, it is possible that cannabidiol (CBD), through activation of the endocannabinoid system, leads to increased regenerative response. The present work investigated the neuroprotective effect of CBD and its action through endocannabinoid receptors after peripheral nerve lesion in neonatal rats. For this, 2days-old Wistar rats were divided into the following experimental groups: sciatic nerve crush (SNC) +Vehicle treatment (Vehicle group); SNC + CBD treatment (CBD group); SNC + CBD + AM 251 (Cb1 inhibitor) treatment (CBD + AM 251 group); SNC + CBD + AM 630 (CB2 inhibitor) treatment (CBD + AM 630 group); SNC + AM 251 treatment (AM 251 group); SNC + AM 630 treatment (AM 630 group) and SNC + AM 251 + AM 630 treatment (AM 251 + AM 630 group). Motoneuron survival, 5 days and 8 weeks after injury, showed that CBD enhances in about 54% neuronal survival, both 5 days and 8 weeks after injury. The other experimental groups showed higher motoneuron preservation than the vehicle group, but when both Cb1 and CB2 receptors were blocked, the motoneuron survival was the same then after CBD treatment. In long term, only CB1 blockade reversed the CBD positive effect. The blockade of cannabinoid receptors increases the sensory neuron death as a result of apoptosis or lesion. Although CBD treatment did not protect sensory neurons of death, it attenuates the death caused by cannabinoid receptors blockade. CBD treatment also preserved 35% of synapses in the ventral horn and this effect was partially reversed by CB 2 inactivation. Antagonists-only treatments showed synaptic preservation equivalent to Vehicle group. Corroborating with this, the microglial reaction in the acute phase was also reduced by CBD in 62%, being higher in the experimental groups that were treated only with cannabinoid receptors antagonists. Additionally, CBD or AM 251 + AM 630 treatment decreased the reactive astrogliosis 5 days after lesion. Gene transcripts expression for CB1 was higher in Vehicle group. Both CBD alone or combined with CB1 and CB2 receptors antagonists resulted in higher CB2 expression, when compared to control, being even lower when compared to Vehicle. In the dorsal root ganglia (DRG), CBD + AM 630 treatment increased CB1 levels, while CBD + AM 251 decreased it. Still, we did not detect statistical differences in neurotrophins expression in the spinal cord, both 5 days or 8 weeks after lesion, in the experimental groups that received CBD. However, CB1 and CB2 antagonists administration, alone or together, reduced BDNF expression. In DRG, CBD + AM 630 increased and CBD + AM 251 decreased BDNF expression, and 15 days after lesion, only GDNF had elevated levels, especially on CBD group. Lastly, functional motor recovery revealed that, 8 weeks after lesion, CBD group presented improved recovery when compared to CBD + AM 251 group. In general, the data herein shows that CBD is neuroprotective, enhancing neuronal survival and decreasing the glial reaction induced by axotomy. In the same way, the selective action of cannabinoid receptors can also result in neuroprotection, even in the absence of CBD Doutorado Anatomia Doutor em Biologia Celular e Estrutural FAPESP 2012/22751-5

Orientador: Carlos Amilcar Parada Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Contexto e objetivo: A dipirona é um analgésico utilizado no controle da dor moderada. É rapidamente metabolizada em dois metabolitos bioativos: 4¿metil-aminoantipirina (4-MAA), por hidrólise, o qual é metabolizado em 4-aminoantipirina (4-AA), por reação enzimática. O objetivo deste estudo foi verificar a participação dos receptores canabinoides CB1 e CB2 e sua relação com os receptores TRPV1 e opióides do tecido periférico no efeito analgésico da dipirona, 4-MAA ou 4-AA. Métodos: PGE2 (100 ng), carragenina (100 µg) ou capsaicina (0.12 µg) foram administradas na pata de ratos Wistar. A hiperalgesia mecânica induzida por carragenina foi avalidada por von-Frey eletrônico e a nocicepção avaliada pela contagem de flinches. Para investigar o envolvimento dos receptores canabinóides CB1, CB2, opióides e TRPV1, seus antagonistas (respectivamente, AM251, AM630, naloxona e capsazepina) foram administrados 30 min antes da dipirona, 4-MAA e 4-AA. Espectrometria de massa foi utilizada para analisar a hidrolise da dipirona para 4-MAA. O efeito do 4-AA no receptor TRPV1 foi analisado por ensaio de Ca2+ em neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) mantidos em cultura. Resultados: Os resultados demonstraram que a hiperalgesia induzida por carragenina foi reduzida de maneira dose-dependente pelo tratamento local com dipirona ou 4-MAA. Os dados também demonstraram que a dipirona foi localmente metabolizada em 4-MAA no tecido subcultâneo. Administração local de AM630, Naloxona ou norBNI, mas não de Naltrindole ou CTOP, reverteu totalmente o efeito anti-hiperalgésico da dipirona ou do 4-MAA. A administração local de 4-AA reduziu a nocicepção e o aumento de [Ca2+]i induzido por capsaicina em neurônios do DRG. O efeito anti-nociceptivo e a redução do [Ca2+]i promovidos por 4-AA foram revertidos por AM251. PGE2 aumentou a nocicepção induzida por capsaicina, a qual foi revertida por 4-AA. Em cultura de neurônios sensibilizados por PGE2 o metabolito 4-AA induziu aumento [Ca2+]i que foi revertido pela admininistração de capsazepina (antagonista de TRPV1). AM251 reduziu ambos, o [Ca2+]i induzido por 4-AA e por capsaicina. Conclusão: Os resultados demonstram que a dipirona é localmente metabolizada em 4-MAA. Os dados sugerem que este metabólito promove analgesia pela interação entre o sistema canabinóide e opióide em particular pela ativação dos receptores CB2 e Kappa opioide. Por sua vez, o metabólito 4-AA reduziu a atividade das fibras TRPV1+ por dessensibilizarem os receptores TRPV1 via ativação dos receptores canabinóides CB1 Abstract: Background and aim: Dipyrone is an analgesic used to control moderate pain. It is metabolized in two bioactive metabolites: 4-methylaminoantipyrine (4-MAA) by hydrolysis and 4-aminoantipyrine (4-AA) by enzymatic reaction. The aim of this study was to investigate the involvement of peripheral cannabinoid CB1 and CB2 receptors and their relation with TRPV1 and opioid receptors, respectively, in the anti-hyperalgesic effect of Dypirone, 4-MAA or 4-AA. Methods: PGE2 (100 ng), carrageenan (100 µg) or capsaicin (0.12) were administered in the hind paw of male Wistar rats. The carrageenan-induced mechanical hyperalgesia was evaluated by electronic von-Frey and capsaicin-induced nociception was evaluated by counting flinches. To analyze the involvement of cannabinoid CB1, CB2, TRPV1 and opioid receptors their antagonist (respectively AM251, AM630, naloxone and capsazepine) were administered 30 min before dipyrone, 4-MAA or 4-AA. Mass spectrometry was used to analyse dipyrone¿s hydrolysis to 4-MAA. The effect of 4-AA on TRPV1 was analyzed by Calcium-influx assay in Dorsal root ganglian (DRG) keept in culture. Results: The results showed that the hyperalgesia induced by the inflammatory agent carrageenan was reduced in a dose dependent-manner by 4-MAA or dipyrone. Dipyrone was locally metabolized to 4-MAA in the subcutaneous tissue of hind paw. Local administration of AM630, Naloxone or norBNI but not of naltrindole or CTOP reduced the analgesic effect of dipyrone or 4-MAA. The local administration of capsaicin induced nociception and [Ca2+]i that was reduced by 4-AA. 4-AA reduces nociception and the calcium influx was reduced by AM251. PGE2 increases the capsaicin-induced nociception that was reversed by 4-AA. 4-AA increased [Ca2+]i in neurons sensitized by PGE2 that was reduced by capsazepine, a TRPV1 antagonist. AM251 reduced the [Ca2+]i induced by 4-AA or capsaicin. Conclusion: These results demonstrated that dipyrone is locally hydrolyzed to 4-MAA. Also, these data suggested that this metabolite induced analgesic effect through an interaction of cannabinoid and opioid system. 4-AA reduced the activity of the TRPV1+ (fiber C) by desensitization of TRPV1 through cannabinoid CB1 receptor. These data also suggested that the efficacy analgesic of dipyrone is increased in inflammatory conditions Doutorado Fisiologia Doutor em Biologia Funcional e Molecular CAPES

Orientador: Carlos Amilcar Parada Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A dipirona (metamizol) é um pró-fármaco analgésico utilizado no controle da dor moderada, sendo metabolizada em dois metabolitos bioativos: 4-metil-aminoantipirina (4-MAA) e 4-aminoantipirina (4-AA). O objetivo deste estudo foi investigar a participação de receptores canabinóides periféricos, CB1, CB2 e canais de KATP sobre o efeito anti-hiperalgésico da dipirona, 4-MAA ou 4- AA. Para indução de hiperalgesia, PGE2 (100 ng/pata ) foi administrada localmente na pata traseira de ratos Wistar machos, e o limiar hiperalgésico mecânico foi quantificado por Von- Frey eletrônico, antes e três horas após a injeção. Dipirona, 4-MAA ou 4-AA foram administrados 30 minutos antes do Von Frey. Os antagonistas seletivos do receptor CB1 (AM251), CB2 (AM630) e glibenclamida, um bloqueador KATP (80 ug) ou ODQ um inibidor de cGMP (32 ?g) foram administrados 30 minutos antes da Dipirona, 4-MAA ou 4 -AA. O ODN-antisense para reduzir a expressão do receptor CB1 (30 ?g) foi administrado por via intratecal, uma vez por dia durante quatro dias consecutivos. A hiperalgesia mecânica induzida pela PGE2 foi reduzida pela dipirona, 4-MAA, e 4-AA de maneira dose-dependente. AM251 ou ODN-antisense contra o receptor neuronal CB1, mas não AM630, reduziu o efeito anti-hiperalgésico mediado por 4-AA, mas não da dipirona ou 4-MAA. Por outro lado, o efeito anti-hiperalgésico da dipirona, ou 4-MAA foi revertido por glibenclamida ou ODQ. Os resultados sugerem que a ativação de receptores neuronal CB1, mas não do receptor CB2, no tecido periférico esteja envolvido no efeito anti-hiperalgésico do metabólito 4-AA. Além disso, a dipirona e 4-MAA possui um efeito anti-hiperalgesico dependente de cGMP e consequente abertura KATP Abstract: Dipyrone (metamizole) is an analgesic pro-drug used to control moderate pain. It is metabolized in two bioactive metabolites: 4-methylaminoantipyrine (4-MAA) and 4-aminoantipyrine (4-AA). The aim of this study was to investigate the participation of peripheral CB1 and CB2 cannabinoid receptors activation on the anti-hyperalgesic effect of Dypirone, 4-MAA or 4-AA. For induction of hyperalgesia, PGE2 (100 ng) was locally administrated in hindpaw of male Wistar rats, and the mechanical nociceptive threshold was quantified by electronic von-Frey, before and 3 hours after its injection. Dypirone, 4-MAA or 4-AA was administrated 30 minutes before the von-Frey test. The selective CB1 receptor antagonist AM251, CB2 receptor antagonist AM630, cGMP inhibitor ODQ (32 ?g) or KATP blocker glibenclamide (80 ?g) was administrated 30 minutes before Dypirone, 4-MAA or 4-AA. The antisense-ODN against CB1 receptor expression (30 ?g) was intrathecally administrated once a day during four consecutive days. PGE2-induced mechanical hyperalgesia was inhibited by dypirone, 4-MAA, and 4-AA in a dose-response manner. AM251 or ODN anti-sense against neuronal CB1 receptor, but not AM630, reversed the antihyperalgesic effect mediated by 4-AA, but not by dypirone or 4-MAA. On the other hand, the anti-hyperalgesic effect of dypirone or 4-MAA was reversed by Glibenclamide or ODQ. These results suggest that the activation of neuronal CB1, but not CB2 receptor, in the peripheral tissue is involved in the anti-hyperalgesic effect of 4-aminoantipyrine. In addition, 4- methylaminontipyrine mediates anti-hyperalgesic effect by the cGMP activation and the KATP opening Mestrado Fisiologia Mestre em Biologia Funcional e Molecular